汪超甲, 王 輝, 胡鈞濤, 胡勝利, 張宇強(qiáng), 成于思, 雷尚國(guó)

1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)神經(jīng)外科, 湖北 十堰 442000; 2.十堰市鄖西縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科, 湖北 十堰 442600

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CRISPR/Cas9敲除pyk2基因?qū)θ四X膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

汪超甲1, 王 輝1, 胡鈞濤1, 胡勝利1, 張宇強(qiáng)1, 成于思1, 雷尚國(guó)2*

1.十堰市太和醫(yī)院(湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院)神經(jīng)外科, 湖北 十堰 442000; 2.十堰市鄖西縣人民醫(yī)院神經(jīng)外科, 湖北 十堰 442600

為了探討富含脯氨酸的酪氨酸激酶(proline rich tyrosine kinase2，Pyk2)對(duì)人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖及侵襲能力的影響,設(shè)計(jì)了2對(duì)以pyk2為靶基因的sgRNA片段，以px335質(zhì)粒為載體,構(gòu)建CRISPR/Cas9重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置野生型U251細(xì)胞作為對(duì)照組。通過酶切鑒定及Western blot分析篩選陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，并測(cè)序揭示突變位點(diǎn)。篩選出的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)組，經(jīng)RTCA法比較后，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的增殖能力較對(duì)照組明顯下降，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Transwell小室法及劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果均證實(shí)，較對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的體外侵襲及遷移能力受到明顯的抑制，差異顯著(P<0.05)。作為驗(yàn)證侵襲能力的代表，基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloprotein 9，MMP9)在Western blot實(shí)驗(yàn)中表達(dá)量較對(duì)照組也明顯下降。通過上述方法成功得到目的基因敲除的穩(wěn)定細(xì)胞株，并證實(shí)敲除pyk2基因能明顯的抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力。

CRISPR/Cas9；pyk2基因；人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞；增殖、遷移及侵襲能力

腦膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)最常見的原發(fā)性惡性腫瘤。目前,手術(shù)仍是首選的治療方案，對(duì)于高級(jí)別的腦膠質(zhì)瘤來(lái)說，術(shù)后進(jìn)行放療、化療等輔助治療將有助于控制腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。但由于其自身呈侵襲性生長(zhǎng)、惡性程度高等生物學(xué)特點(diǎn)，很難達(dá)到徹底治愈。手術(shù)治療并不能徹底切除整個(gè)腫瘤組織，放療、化療受限于其耐受性和耐藥性，也達(dá)不到理想的效果。隨著對(duì)腫瘤發(fā)生發(fā)展研究的深入，研究者們發(fā)現(xiàn)，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是多個(gè)基因在多方面共同作用的結(jié)果。若能徹底研究清楚對(duì)腦膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展起決定性作用或者影響較大的基因發(fā)揮作用的機(jī)制，則有望從基因水平為徹底治療腦膠質(zhì)瘤提供一條新的途徑。

含脯氨酸的酪氨酸激酶(Pyk2)被研究證實(shí)在人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高表達(dá),且與該病預(yù)后密切相關(guān)，但具體機(jī)制尚不清楚。MMP9屬于鋅依賴性內(nèi)肽酶家族，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)，維持細(xì)胞外基質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡。研究表明,其與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)，常被用來(lái)代表侵襲能力的評(píng)價(jià)指標(biāo)，故本實(shí)驗(yàn)希望通過檢測(cè)MMP9表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步證實(shí)目的基因在腫瘤侵襲能力方面的影響。前期本課題組利用RNA干擾技術(shù)成功沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中C-Met基因并揭示了其在腦膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展中的作用機(jī)制[1]，但由于其操作復(fù)雜、成本高，且干擾效果有限，而CRISPR/Cas9技術(shù)操作簡(jiǎn)單、設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單、成本低，可使目的基因徹底得到敲除或者是點(diǎn)突變、插入，能更真實(shí)的反應(yīng)該基因的作用機(jī)制。故本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的pyk2基因，以期探討其在細(xì)胞增殖、遷移及侵襲方面的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

px335/Cas9質(zhì)粒由武漢大學(xué)藥學(xué)院研究所饋贈(zèng)；U251細(xì)胞由十堰市太和醫(yī)院生命科學(xué)研究所提供；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Transwell BD購(gòu)自美國(guó)Biosciences公司；Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Pyk2抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;PMSF及RIPR裂解液購(gòu)自上海碧云天公司；PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；BbsⅠ酶購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；T7EⅠ酶購(gòu)自北京唯尚立德公司；其他試劑均為分析純。

1.2pyk2敲除載體的構(gòu)建

選取pyk2基因外顯子1序列，以NGG為PAM序列(protospacer-adjacent motif，PAM)設(shè)計(jì)2對(duì)sgRNA引物，分別命名為sgRNA 1.1/1.2，sgRNA 2.1/2.2(表1)，退火體系:sgRNA正鏈引物、sgRNA反鏈引物各5 μL。退火程序：37℃ 30 min；95℃ 5 min；0.1℃/s逐漸降溫直至25℃。退火成雙鏈后，BbsⅠ酶線性化px335/cas9質(zhì)粒，并與退火產(chǎn)物連接，連接體系(10 μL)：sgRNA退火產(chǎn)物5.0 μL，線性化質(zhì)粒1.0 μL，T4連接酶1.0 μL，T4 buffer 1.0 μL,ddH2O 2.0 μL。而后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑菌測(cè)序，分析所得質(zhì)粒。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將DMEM+10%胎牛血清培養(yǎng)基加入復(fù)蘇的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞中，5% CO2，37℃，孵箱內(nèi)培養(yǎng)，備用。當(dāng)細(xì)胞達(dá)到70%～90%融合時(shí)，利用陽(yáng)離子脂質(zhì)體Lipofectamine 2000將構(gòu)建好的成對(duì)的質(zhì)粒(如引物sgRNA2.1、sgRNA2.2退火產(chǎn)物對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒2.1、2.2)轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)，并將各組對(duì)應(yīng)的細(xì)胞分別命名為P1、P2。

1.4 酶切鑒定及測(cè)序

提取細(xì)胞總DNA，利用pyk2引物(表1)，擴(kuò)增體系(10 μL)：上游引物 0.5 μL，下游引物0.5 μL，MIX 5.0 μL，模板1.0 μL，ddH2O 3.0 μL。PCR擴(kuò)增程序: 95℃ 5 min；95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物pyk2經(jīng)T7EⅠ酶切，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并用BandScan 5.0分析膠片灰度值計(jì)算切割效率，效率值用切割后片段的總灰度值/所有條帶灰度值之和。將有效率組的細(xì)胞分單克隆繼續(xù)擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后再次酶切鑒定。將PCR產(chǎn)物與T載體連接，隨后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑菌測(cè)序，揭示目的序列的突變位點(diǎn)。

1.5 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞中Pyk2及MMP9蛋白表達(dá)水平

收集轉(zhuǎn)染至U251腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，用蛋白裂解液裂解細(xì)胞，提取總蛋白后，酶標(biāo)液測(cè)定蛋白濃度，取50 μg總蛋白上樣，8% PAGE膠電泳，轉(zhuǎn)PVDF膜，用5%脫脂奶粉的TBST封閉液封閉2 h，加1∶300一抗(兔抗人Pyk2抗體)，孵育過夜，加二抗(山羊抗兔抗體)1∶1 000，AP顯色，β-actin作為內(nèi)參，BandScan5.0分析膠片灰度值，蛋白的表達(dá)水平以相對(duì)表達(dá)量即Pyk2/β-actin、MMP9/β-actin的比率計(jì)算,并繪圖比較各組之間的差異。

1.6 RTCA法比較細(xì)胞增殖能力的變化

計(jì)數(shù)后調(diào)整細(xì)胞濃度為1×104個(gè)/mL，將細(xì)胞懸液接種于16孔R(shí)TCA板中，每孔接入300 μL，37℃培養(yǎng)120 h。各組設(shè)置8個(gè)復(fù)孔，記錄生長(zhǎng)曲線及數(shù)據(jù)，將24 h、48 h、72 h的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析繪制柱形圖。

表1 sgRNA及PCR引物序列

1.7 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的體外侵襲能力

收集計(jì)數(shù)細(xì)胞，用MEM無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞至2×104個(gè)/mL，備用。10% FBS MEM培養(yǎng)基預(yù)先加入24孔板中，并將Transwell小室置入24孔板中，上室加入200 μL的細(xì)胞懸液，下室加入500 μL含10% FBS的培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24 h后取出小室，用10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗2遍，棉簽擦拭上室中的細(xì)胞， 95%乙醇固定1 h，0.2%結(jié)晶紫染色30 min，10 mmol/L PBS再次清洗，顯微鏡選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證細(xì)胞的遷移能力

計(jì)數(shù)并種植細(xì)胞，待細(xì)胞融合度接近70%，用槍頭平行劃線，10 mmol/L PBS清洗細(xì)胞后，繼續(xù)培養(yǎng)，選取5個(gè)觀察點(diǎn)顯微鏡記錄48 h劃痕之間細(xì)胞數(shù)，該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，并求平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶基因pyk2敲除載體的構(gòu)建及鑒定

將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒2.1、2.2與空質(zhì)粒經(jīng)BbsⅠ酶切后，瓊脂糖凝膠電泳鑒定(圖1)，重組質(zhì)粒2.1、2.2可以切出8 000 bp左右的條帶，與空質(zhì)粒一致。并將重組質(zhì)粒2.1、2.2測(cè)序后的序列與pyk2目的序列進(jìn)行比對(duì)，經(jīng)DNA Star軟件分析，結(jié)果顯示目標(biāo)序列已完全正確的插入載體中，至此，目的基因pyk2的敲除載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒酶切鑒定的瓊脂糖電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of recombinant plasmids.注：M：DNA Marker; 2.1、2.2、px335分別為重組質(zhì)粒2.1、2.2和px335環(huán)形質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物。

2.2 酶切鑒定敲除效率及測(cè)序

提取實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的總DNA，PCR產(chǎn)物用T7EⅠ酶切鑒定，PCR擴(kuò)增長(zhǎng)度為569 bp，如圖2所示：與對(duì)照組相比，P1組無(wú)切割效率，而P2組則有約40%的切割效率。挑取P2組細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，獲得6個(gè)單克隆細(xì)胞，分別命名為1～6，經(jīng)T7EⅠ酶切鑒定后，瓊脂糖凝膠電泳，并用BandScan 5.0分析條帶的灰度值，將酶切下的條帶的灰度值/所有條帶的灰度值之和作為有效率，如圖3所示：2、4號(hào)單克隆細(xì)胞有效率，其效率值分別約為30%、40%。PCR產(chǎn)物連接T載體后測(cè)序，結(jié)果顯示1號(hào)有點(diǎn)突變，而2號(hào)和4號(hào)單克隆分別缺失13 bp、51 bp，確定為有意義的突變，得到陽(yáng)性單克隆細(xì)胞，備用進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)

圖2 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞酶切鑒定的瓊脂糖電泳Fig.2 Agarose gel electrophoresis of enzyme digestion after transfection.注：M：DNA Marker；uwt、uP1、uP2代表沒有加入T7EⅠ酶組；而wt、P1、P2代表加入T7EⅠ酶組。

圖3 單克隆細(xì)胞PCR酶切鑒定瓊脂糖電泳Fig.3 Identification of PCR of monoclonal cells by agarose gel electrophoresis.注：M：DNA Marker；1～6分別對(duì)應(yīng)1～6號(hào)單克隆細(xì)胞。

經(jīng)Western blot檢測(cè)分析各組細(xì)胞中Pyk2及MMP9蛋白的表達(dá)量的差異，可見實(shí)驗(yàn)組1、2、3(分別與陽(yáng)性單克隆細(xì)胞1、2、4號(hào)對(duì)應(yīng))Pyk2表達(dá)量幾乎為零(圖4)，進(jìn)一步證實(shí)目的基因pyk2被成功敲除；圖5顯示MMP9的表達(dá)量較對(duì)照組明顯降低。柱狀圖更好的反應(yīng)了各組之間的差異(圖6、7)，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖4 各組細(xì)胞Pyk2表達(dá)量的差異圖Fig.4 The difference of Pyk2 expression in different groups.注：wt:對(duì)照組；1、2、3分別對(duì)應(yīng)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞1、2、4號(hào)。

圖5 各組細(xì)胞MMP9表達(dá)量的差異圖Fig.5 The difference of MMP9 expression in different groups.注：wt:對(duì)照組；1、2、3分別對(duì)應(yīng)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞1、2、4號(hào)。

圖6 各組細(xì)胞Pyk2表達(dá)量的差異圖Fig.6 The difference of Pyk2 expression in different groups.注：wt:對(duì)照組；1、2、3分別對(duì)應(yīng)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞1，2，4號(hào)。**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

圖7 各組細(xì)胞MMP9表達(dá)量的差異圖Fig.7 The difference of MMP9 expression in different groups.注：wt:對(duì)照組；1、2、3分別對(duì)應(yīng)陽(yáng)性單克隆細(xì)胞1，2，4號(hào)。**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

2.4 RTCA檢測(cè)細(xì)胞增殖能力的變化

如圖8所示,經(jīng)RTCA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，敲除目的基因pyk2后,細(xì)胞的增殖能力(陽(yáng)性單克隆細(xì)胞1、2、4號(hào)的平均值)明顯下降，經(jīng)單樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖8 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線比較Fig.8 Comparison of cell growth curve.

2.5 Transwell小室法檢測(cè)細(xì)胞的體外侵襲能力的變化

如圖9(彩圖見圖版三)和圖10所示，實(shí)驗(yàn)組200×情況下穿膜細(xì)胞數(shù)(陽(yáng)性單克隆細(xì)胞1、2、4號(hào)的平均值)約為11.530±2.21個(gè)，而空白對(duì)照組則為30.86±4.53，經(jīng)SPSS 17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.6 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞的體外遷移能力的變化

劃痕實(shí)驗(yàn)顯示：實(shí)驗(yàn)組200×下觀察到48 h劃痕間細(xì)胞數(shù)(陽(yáng)性單克隆細(xì)胞1、2、4號(hào)的平均值)為16.35±2.51個(gè)，而對(duì)照組為25.12±3.43個(gè)。較對(duì)照組明顯減少，經(jīng)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖11、12)。

圖9 小室法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力Fig.9 Transwell method was used to detect the invasion ability of the cells.注：A:對(duì)照組細(xì)胞的侵襲能力；B:實(shí)驗(yàn)組(陽(yáng)性單克隆2號(hào))細(xì)胞后侵襲能力，200×。(彩圖見圖版三)

圖10 小室法檢測(cè)各組穿膜細(xì)胞數(shù)比較Fig.10 Comparison of the cells number in each group by the chamber method.注:**表示與對(duì)照組相比差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤的治療一直是神經(jīng)外科及腫瘤科面臨的難題。因其侵襲性強(qiáng)、易復(fù)發(fā)、惡性程度高，目前的各種治療手段雖有一定的療效，但均不能達(dá)到理想的效果。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的平均生存期尚不足一年[2]。癌基因的激活或者是抑癌基因的失活被認(rèn)為是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的基礎(chǔ)，腦膠質(zhì)瘤也不例外，是多基因、多因素共同作用的結(jié)果[3]。因此，從基因水平探討其治療措施是非常必要的。

圖11 劃痕實(shí)驗(yàn)48 h各組細(xì)胞數(shù)比較Fig.11 Comparison of the cells number in each group for 48 hours by Scratch test.注：*表示與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。

Pyk2是一種胞質(zhì)非受體蛋白酪氨酸激酶，屬于黏附斑復(fù)合物家族的一員，分子量約為115.7 kDa, 有4個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域,分布較為局限[4]。研究報(bào)道Pyk2在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中高表達(dá)，且參與腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展的過程，可能對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖能力發(fā)揮著重要作用[5]。本研究利用CRISPR/Cas9表達(dá)載體，成功并高效的敲除了pyk2基因，通過 Western blot試驗(yàn)及T7EⅠ酶切共同驗(yàn)證了其敲除效率。RTCA實(shí)驗(yàn)揭示敲除該基因后細(xì)胞的增殖能力明顯下降。Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)提示細(xì)胞的遷移及侵襲能力得到顯著抑制，MMP9蛋白表達(dá)量的下降也進(jìn)一步證實(shí)細(xì)胞的侵襲能力的下降。上述的試驗(yàn)表明，pyk2基因在腦膠質(zhì)瘤中高表達(dá)，且進(jìn)一步證實(shí)其參與了細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲過程的調(diào)節(jié)。

圖12 劃痕實(shí)驗(yàn)比較細(xì)胞的遷移能力Fig.12 Comparison of the migration ability of the cells.注：A、C：對(duì)照組0 h、48 h時(shí)細(xì)胞的遷移能力；B、D:實(shí)驗(yàn)組(陽(yáng)性單克隆2號(hào))0 h、48 h時(shí)細(xì)胞的遷移能力。

Pyk2之所以在調(diào)節(jié)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲方面發(fā)揮著重要作用，具體的機(jī)制可能與以下因素有關(guān)：通過激活P13/AKT信號(hào)通路中的GSK3在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平間接抑制抗凋亡蛋白MCL1的降解[6]；Pyk2可隨著自由的、催化過的鈣離子濃度的升高而激活，可被自身磷酸化而激活，也可通過對(duì)SRC及Fyn等信號(hào)分子的招募，激活一系列信號(hào)通路[7]；同時(shí)也可作為細(xì)胞骨架的綁定蛋白而參與信號(hào)的傳導(dǎo)、細(xì)胞骨架的識(shí)別，進(jìn)而參與整合素的激活和信號(hào)的整合[8]；通過整合素及生長(zhǎng)因子受體介導(dǎo)信號(hào)傳導(dǎo)調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)、擴(kuò)增及分化[9]；調(diào)節(jié)肌動(dòng)蛋白的偶聯(lián)，在細(xì)胞骨架的構(gòu)建中發(fā)揮重要作用[10]；Pyk2酪氨酸激酶的平衡對(duì)細(xì)胞骨架的構(gòu)建及細(xì)胞自噬起重要作用[11]。

CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)作為一種高效的新型的基因編輯技術(shù)，較傳統(tǒng)的TALEN、RNAi等具有效率高、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，在本實(shí)驗(yàn)中也得到驗(yàn)證[12]。但為了提高效率，嚴(yán)格按照設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)sgRNA是非常重要的。本研究通過對(duì)目的基因pyk2進(jìn)行敲除，揭示了其在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等方面的作用，但腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是由多方面的綜合因素引起的，要應(yīng)用于臨床尚有局限性。若期望在未來(lái)徹底治愈腦膠質(zhì)瘤，尚需科研工作者在基礎(chǔ)和臨床方面付出更大的努力。

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Effects ofpyk2 Knockout on the Proliferation, Migration and Invasion of Human Glioma Cell Line by CRISPR/Cas9

WANG Chaojia1, WANG Hui1, HU Juntao1, HU Shengli1, ZHANG Yuqiang1, CHENG Yusi1, LEI Shangguo2*

1.DepartmentofNeurosurgery,ShiyanTaiheHospital(AffliatedHospitalofHubeiMedicineCollege),HubeiShiyan442000,China; 2.DepartmentofNeurosurgery,YunxiPeople’sHospital,HubeiShiyan442600,China

Two pairs of CRISPR/Cas9 recombinant plasmids which targetspyk2 genes were constructed to investigate the effects of Pyk2 (proline rich tyrosine kinase 2) on the proliferation and invasion of human glioma cell line U251. The plasmids were transfected into human glioma U251 cells after they were identificatied, and the wild type U251 cells were set as the control group. Positive monoclonal cells were selected by enzyme digestion and Western blot analysis, then the mutation sites were revealed by sequencing. Compared with the control group, the proliferation ability of the experimental group (the positive monoclonal cells) was decreased by the RTCA method (P<0.05). The invasion and migration ability of the cells in experimental group were significantly inhibited by Transwell chamber method and Scratch test, and the differences were statistically significant (P<0.05). The matrix metalloproteinase 9 (MMP9), which was used to verify the invasion ability, was significantly decreased in the experimental group than in the control group by Western blot method. Through the above methods, we successfully obtained the stable cell lines with target gene knockout, and confirmed that knockout ofpyk2 gene could significantly inhibit the proliferation, migration and invasion of human glioma cells.

CRISPR/Cas9;pyk2 genes; human glioma cells; proliferation, migration and invasion

2017-02-22; 接受日期：2017-03-31

湖北省自然基金項(xiàng)目(2013CFB225)；湖北醫(yī)藥學(xué)院中青年創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(2014CXZ03)；湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬太和醫(yī)院博士啟動(dòng)基金項(xiàng)目(2014QD02)；十堰市科技局指導(dǎo)性項(xiàng)目(15Y26)資助。

汪超甲，主治醫(yī)師，研究方向?yàn)槟X膠質(zhì)瘤的臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail：vernon502@163.com。*通信作者：雷尚國(guó)，副主任醫(yī)師，研究方向?yàn)槟X膠質(zhì)瘤的臨床及基礎(chǔ)研究。E-mail：404090832@qq.com

10.19586/j.2095-2341.2017.0010