楊 麗，陳 陽

(皖南醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)病理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

·法醫(yī)學(xué)·

線栓法大鼠腦缺血再灌注損傷模型的實(shí)驗(yàn)研究

楊 麗，陳 陽

(皖南醫(yī)學(xué)院 法醫(yī)病理學(xué)教研室，安徽 蕪湖 241002)

目的：探討大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(MCAO/R)損傷模型的建立及其穩(wěn)定性評價(jià)，以及再灌注時(shí)間對腦梗死體積的影響。方法：SD雄性大鼠70只，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=5)及MCAO/R組(n=65)，MCAO/R組用改良的Zea-Longa法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型，觀察大鼠神經(jīng)功能缺損，采用Longa評分法對大鼠神經(jīng)行為學(xué)進(jìn)行評分。分別于再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d后斷頭處死大鼠，取腦組織0.2%TTC染液進(jìn)行染色。測量不同時(shí)間組腦梗死體積百分比，比較各組間大鼠神經(jīng)功能缺損及腦梗死體積百分比。結(jié)果：MCAO/R組大鼠造模穩(wěn)定性可達(dá)86.95%；與假手術(shù)組比較，MCAO/R組大鼠均出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損，腦梗死體積百分比在6 h組逐漸增大，3 d組達(dá)到高峰，5～7 d組下降。結(jié)論：線栓法制作大鼠腦局部缺血再灌注損傷模型是一種穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高的造模方法；隨再灌注時(shí)間的延長腦梗死體積百分比先逐漸增大，而后逐漸減小。

動(dòng)物模型；大腦中動(dòng)脈缺血再灌注；梗死體積

腦卒中具有發(fā)病率高、病死率高、殘疾率高及復(fù)發(fā)率高的特點(diǎn)[1]。其中缺血性腦卒中的發(fā)病率高于出血性腦卒中，占腦卒中總數(shù)的60%～70%。缺血性腦卒中引起的組織損傷是主要的致死原因，但研究發(fā)現(xiàn)，缺血后再灌注引起的過量氧自由基是造成組織損傷的主要因素。通過制備腦局部缺血再灌注損傷動(dòng)物模型研究腦缺血再灌注損傷的作用機(jī)制已成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。線栓法是最常用的腦局部缺血再灌注損傷模型制備方法，此方法不需要開顱且不需要呼吸機(jī)等儀器輔助，缺血部位較恒定，能夠準(zhǔn)確控制缺血及再灌注時(shí)間，容易控制局部條件，全身影響小，是制作腦局部缺血再灌注損傷模型最理想的方法[2]。本實(shí)驗(yàn)通過線栓法復(fù)制大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注(middle cerebral artery ischemia-reperfusion，MCAO/R)損傷模型，于再灌注后不同時(shí)間處死大鼠，探討此法制作動(dòng)物模型的成功率、穩(wěn)定性及再灌注后不同時(shí)間腦梗死體積的變化。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 止血鉗、剪刀、自制拉鉤、顯微止血鉗、顯微鑷、顯微剪、微血管夾、電凝刀、大鼠固定器、油性記號筆等，栓線(由北京西濃科技有限公司提供)；10%水合氯醛；4%多聚甲醛；0.2%TTC染液；SPF級雄性大鼠70只，體質(zhì)量250～280 g，由南京青龍山動(dòng)物繁殖場提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 將70只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=5)、MCAO/R組(n=65)，其中MCAO/R組又分為再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d組，造模成功后，隨機(jī)分配到各時(shí)間組，每個(gè)時(shí)間組5只大鼠。

1.2.2 模型制作 本實(shí)驗(yàn)采用改良的Zea-Longa法制作大鼠大腦中動(dòng)脈缺血再灌注模型[2-4]。MCAO/R組大鼠用10%水合氯醛按0.35 mL/100 g劑量腹腔注射，頸部備皮常規(guī)消毒，取頸正中切口剪開皮膚，分離皮膚下軟組織并暴露頸動(dòng)脈鞘。仔細(xì)分離右側(cè)頸總動(dòng)脈(CCA)、頸外動(dòng)脈(ECA)、頸內(nèi)動(dòng)脈(ICA)，后于枕動(dòng)脈以上結(jié)扎ECA，ECA靠近分叉處放置一備用線，動(dòng)脈夾分別夾閉ICA、CCA。電凝刀離斷枕動(dòng)脈及ECA遠(yuǎn)心端，用顯微剪在ECA上剪一缺口，將備好的栓線經(jīng)ECA插入ICA至栓線頭部達(dá)到MCA起始處，備用線打結(jié)固定栓線。取下ICA、CCA的動(dòng)脈夾，清理創(chuàng)口并縫合肌肉及皮膚，傷口消毒后局部使用抗生素預(yù)防感染。缺血2 h后拔出栓線形成大鼠腦缺血再灌注損傷。假手術(shù)組與MCAO/R組操作步驟前部分相同，但不插栓線。動(dòng)物回籠飼養(yǎng)。

1.3 觀察指標(biāo)

1.3.1 動(dòng)物模型神經(jīng)功能評分 參考Longa評分法[5]，于再灌注2 h麻醉蘇醒后對大鼠進(jìn)行神經(jīng)行為學(xué)評分。Longa評分法評分標(biāo)準(zhǔn)為0分：正常，無神經(jīng)功能缺損；1分：左側(cè)前爪不能完全伸展，輕度神經(jīng)功能缺損；2分：行走時(shí)，大鼠向左側(cè)(癱瘓側(cè))轉(zhuǎn)圈，中度神經(jīng)功能缺損；3分：行走時(shí)，大鼠身體向左側(cè)(癱瘓側(cè))傾倒，重度神經(jīng)功能缺損；4分：不能自發(fā)行走，有意識(shí)喪失。造模完成后剔除神經(jīng)行為學(xué)評分為0分、4分以及死亡的大鼠，評分1～3分為造模成功。

1.3.2 動(dòng)物模型制作成功率及穩(wěn)定性 統(tǒng)計(jì)MCAO/R模型制作過程中大鼠死亡個(gè)數(shù)，計(jì)算造模成功大鼠占造模大鼠的比例，即動(dòng)物模型制作成功率=造模成功大鼠個(gè)數(shù)/造模大鼠個(gè)數(shù)×100%。統(tǒng)計(jì)造模后評分2～3分大鼠數(shù)量，計(jì)算評分2～3分大鼠占造模成功大鼠的比例，即大鼠造模穩(wěn)定性= 2～3分大鼠個(gè)數(shù)/造模成功大鼠個(gè)數(shù)×100%。

1.3.3 TTC染色測定腦梗死體積 分別在再灌注3 h、6 h、12 h、24 h、2 d、3 d、5 d、7 d后，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠后斷頭取腦。腦置于-20℃冰箱冷凍30 min后去除嗅球部分，冠狀面每隔2 mm均勻切片，將腦片放入現(xiàn)配的0.2%TTC染液中，37℃水浴避光孵育10～20 min至顯色。用PBS洗去TTC染液，置于4%甲醛溶液中固定24 h后用相機(jī)拍照后輸入計(jì)算機(jī)中。用圖像處理軟件(Image J)計(jì)算梗死面積(粉紅色區(qū)域?yàn)檎ＤX組織，白色區(qū)域?yàn)楣Ｋ绤^(qū))。為減少腦組織水腫對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，采用校正的腦梗死體積比[6]表示，校正的腦梗死體積百分比=(對側(cè)腦組織體積-缺血側(cè)正常腦組織體積)/對側(cè)腦組織體積×100%。

1.3.4 腦梗死體積變化規(guī)律 統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間組腦梗死體積，觀察腦梗死體積隨時(shí)間變化的規(guī)律。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 18.0軟件。TTC染色后大鼠腦梗死體積百分比變化規(guī)律均采用直線圖表示。大鼠MCAO/R模型制備病死率、成功率及穩(wěn)定性采用百分比表示。右側(cè)梗死面積、左側(cè)大腦面積和腦梗死體積百分比采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 動(dòng)物模型神經(jīng)功能學(xué)評分分布情況 MCAO/R組大鼠造模后神經(jīng)功能學(xué)評分情況為：0分4只；1分6只；2分32只；3分8只；4分3只。神經(jīng)功能評分呈正態(tài)分布，評分主要集中在2分左右。

2.2 大鼠MCAO/R動(dòng)物模型制備存活率、成功率及穩(wěn)定性分析 大鼠造模過程中，由于實(shí)驗(yàn)操作以及大鼠的個(gè)體差異等，存在一定數(shù)量的死亡，存活率可維持在80%以上。造模后大鼠行為學(xué)評分表現(xiàn)為左前爪屈曲、向左側(cè)轉(zhuǎn)圈或行走時(shí)向左側(cè)傾倒即為造模成功，成功率約70.77%，造模穩(wěn)定性可達(dá)86.95%。詳見表1。

表1 大鼠MCAO/R模型制作存活率、病死率及穩(wěn)定性分析

樣本數(shù)存活數(shù)死亡數(shù)造模成功數(shù)評分2～3分存活率/%成功率/%穩(wěn)定性/%假手術(shù)組5505-100100100MCAO組655312464081.5470.7786.95

2.3 不同時(shí)間組大鼠TTC染色結(jié)果 如圖1所示，假手術(shù)組大鼠染色后腦組織呈鮮紅色，MCAO/R組大鼠腦冠狀切面可見額頂顳葉皮質(zhì)及尾狀核部位梗死。其中，再灌注后不同時(shí)間組大鼠腦冠狀切面梗死面積呈現(xiàn)一定的規(guī)律。

圖1 0.2%TTC染色后各組腦組織染色結(jié)果

2.4 大鼠腦梗死體積百分比及變化規(guī)律 TTC染色后測定的各組腦梗死體積百分比結(jié)果如圖2示，再灌注后3 h腦梗死體積百分比為負(fù)值，可能與右側(cè)腦組織水腫有關(guān)；6 h、12 h、24 h、2 d、3 d腦梗死體積百分比隨再灌注時(shí)間的延長逐漸增大(P<0.05)，5 d、7 d后腦梗死體積逐漸減小(P<0.05)。

注：* 與上一組比較，P<0.05。

圖2 TTC染色后不同時(shí)間組腦梗死體積百分比變化規(guī)律

3 討論

線栓法是國內(nèi)外最常用的制作腦局部缺血再灌注損傷的方法。Koizumi等[7]于1986年首先報(bào)道了用線栓法制備大鼠腦缺血再灌注模型，此后Longa等對該方法進(jìn)行了改良。線栓法腦缺血模型的研究已經(jīng)取得很多突破和進(jìn)展，但模型制備的穩(wěn)定性受很多因素的影響，如大鼠體質(zhì)量、線栓的選擇等。有學(xué)者指出大鼠體質(zhì)量與線栓直徑呈正相關(guān)：200～250 g大鼠適用直徑0.20 mm線栓，250～300 g大鼠適用0.22 mm線栓，超過350 g大鼠宜用0.25 mm線栓。自制線栓存在頭端大小、圓滑程度不穩(wěn)定等問題，從而導(dǎo)致模型制備成功率及穩(wěn)定性不高，神經(jīng)功能缺損癥狀不穩(wěn)定。本實(shí)驗(yàn)采用購買的體質(zhì)量-直徑規(guī)格相匹配的線栓，最大程度減小了因線栓差異等因素導(dǎo)致造模穩(wěn)定性下降的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)驗(yàn)證明，機(jī)械化生產(chǎn)線栓制備模型的穩(wěn)定性高達(dá)86.95%，造模后神經(jīng)功能學(xué)評分主要集中在2～3分，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)成功奠定了良好的模型基礎(chǔ)。

再灌注不同時(shí)間取腦進(jìn)行TTC染色，結(jié)果顯示不同時(shí)間組大鼠腦梗死體積百分比呈一定規(guī)律[8-9]。灌注后3 h組大鼠斷頭取腦TTC染色腦梗死體積百分比為負(fù)值，可能與梗死側(cè)腦組織水腫有關(guān)；6 h組至3 d組大鼠腦梗死體積百分比增大，可能與缺血后再灌注，腦組織氧自由基增多造成的二次腦損傷有關(guān)；5 d、7 d組大鼠腦梗死體積百分比明顯下降，可能與腦損傷后腦組織修復(fù)相關(guān)通路啟動(dòng)損傷修復(fù)機(jī)制密切相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)表明，缺血后不同再灌注時(shí)間導(dǎo)致大鼠腦梗死體積百分比可能隨著再灌注時(shí)間延長逐漸增大，至3 d時(shí)梗死體積百分比達(dá)到高峰，3 d后逐漸下降的趨勢。6 h組與12 h組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，其余各時(shí)間組與上一組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。大鼠缺血再灌注損傷后腦梗死體積百分比的變化可以為研究治療腦卒中藥物時(shí)間窗提供基礎(chǔ)依據(jù)，對進(jìn)一步深入研究大鼠缺血再灌注損傷模型有重要的意義。

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Experimental study on the suture-occluded technique for ischemia-reperfusion injury models in rats

YANG Li,CHEN Yang

Department of Forensic Pathology,Wannan Medical College,Wuhu 241002,China

Objective： To establish middle cerebral artery ischemia-reperfusion(MCAO/R) injury models in laboratory rats using suture-occluded technique,and assess the stability of such models as well as observe the effects of reperfusion time on cerebral infarction volume.Methods: Seventy male Sprague-Dawley rats were randomized into sham operation group (n=5) and MCAO/R group (n=65).The MCAO/R injury models were established as modified Zea-Longa method,and the neurological deficits in the model rats were observed and evaluated with Longa Score Scale.Then all rats were decapitated at 3 h,6 h,12 h,24 h,2 d,3 d,5 d and 7 d,respectively following reperfusion,and the cerebral tissues were taken to undergo staining using 0.2%TTC.The percentage of cerebral infarction volume in different time phase were measured,and the percentage of cerebral infarction volume and neurological deficits were compared among different time phases.Results: The stability in MCAO/R group reached 86.95%,and rats in the MCAO/R group generally demonstrated neurologic deficits.The percentage of infarction volume was increased at 6 h,peaked at 3 d,yet declined from 5 d to 7 d.Conclusion: Suture-occluded technique can be stable and reproductive in establishment of ischemia-reperfusion injury models in animals.The infraction volume in model rats tends to increase with prolonged reperfusion and decrease with time progression.

animal model；middle cerebral artery ischemia-reperfusion；infarct volume

1002-0217(2017)04-0318-04

2016-11-02

楊 麗(1991-)，女，2014級碩士研究生，(電話)15212239622，(電子信箱)2161083312@qq.com； 陳 陽，男，副教授，碩士生導(dǎo)師，(電子信箱) chy5454@163.com，通信作者。

R-332;R 587.1

A

10.3969/j.issn.1002-0217.2017.04.004