易 鳴 朱志強 曾 智

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水產(chǎn)品中氯霉素和己烯雌酚快速檢測方法初探

易 鳴 朱志強 曾 智

在標(biāo)準(zhǔn)《NY 5070-2002 無公害食品水產(chǎn)品中漁藥殘留限量》中氯霉素和己烯雌酚因其對人體的危害已被列為不得檢出的藥物殘留項目。檢測氯霉素和己烯雌酚的方法主要有酶聯(lián)免疫法、氣相法、液質(zhì)聯(lián)用法，其中酶聯(lián)免疫法耗時最短且操作最簡單，也是筆者檢測工作的主要項目之一。結(jié)合筆者的實際工作，本文詳述了酶聯(lián)免疫法測定水產(chǎn)品中氯霉素和己烯雌酚含量的原理、方法和注意事項。

一、材料和方法

1.氯霉素和己烯雌酚

氯霉素屬抑菌性廣譜抗生素，能對多種細(xì)菌微生物產(chǎn)生作用，常用于對水生動物各種傳染病的治療，曾在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中得到廣泛應(yīng)用，同時也帶來了水產(chǎn)品中氯霉素殘留的嚴(yán)重問題。因其會引起人類的再生障礙性貧血、新生兒灰嬰綜合癥等嚴(yán)重毒副作用，作為漁藥已禁用。己烯雌酚為人工合成的非甾體雌激素，對水生動物有提高繁育率等作用。但人食用了殘留有己烯雌酚的水產(chǎn)品后會造成體內(nèi)激素失調(diào)，對人體健康產(chǎn)生危害，作為漁藥也已禁用。因此對水產(chǎn)品中氯霉素和己烯雌酚的檢測對于食品安全有重要意義。

2.酶聯(lián)免疫法

1971年瑞典學(xué)者Engvail和Perlmann，荷蘭學(xué)者Van Weerman和Schuurs分別報道將免疫技術(shù)發(fā)展為檢測體液中微量物質(zhì)的固相免疫測定方法，即酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，ELISA）。它的中心原理就是讓抗體與酶復(fù)合物結(jié)合，然后通過顯色來檢測。

具體步驟是使抗原或抗體結(jié)合到某種固相載體表面，然后與某種酶連接成酶標(biāo)抗原或抗體，這種酶標(biāo)抗原或抗體既保留其免疫活性，又保留酶的活性。在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。加入酶反應(yīng)的底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺來進(jìn)行定性或定量分析。由于酶的催化頻率很高，故可極大地放大反應(yīng)效果，從而使測定方法達(dá)到很高的敏感度。但由于酶聯(lián)免疫法可能出現(xiàn)假陽性情況，故在本法檢出陽性后一般再用其它方法復(fù)驗。

3.酶聯(lián)免疫試劑盒

試劑盒中提供的檢測材料有：酶標(biāo)板、標(biāo)準(zhǔn)品、酶結(jié)合物、抗體、底物溶液、終止液和洗滌液、提取液等試劑。

（1）氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒

筆者在實際工作中使用氯霉素酶聯(lián)免疫試劑盒檢測時采用間接競爭一步法。在酶標(biāo)板中同時加入標(biāo)準(zhǔn)品（或樣本）、酶標(biāo)二抗及氯霉素抗體，酶標(biāo)板上包被的抗原與加入的標(biāo)準(zhǔn)品（或樣本）中的抗原競爭結(jié)合加入的氯霉素抗體，同時酶標(biāo)二抗與氯霉素抗體結(jié)合。用TMB底物顯色，樣本吸光值與其殘留物中氯霉素濃度呈負(fù)相關(guān)，與校準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)，即可得出樣本中氯霉素的含量。

（2）己烯雌酚酶聯(lián)免疫試劑盒

筆者在實際工作中所用的己烯雌酚酶聯(lián)免疫試劑盒基于競爭性酶聯(lián)免疫反應(yīng)原理。含有己烯雌酚的抗原已經(jīng)包被于微孔板上。檢測時，樣品同特異性一抗共同被添加到板孔中，如果樣品中含有己烯雌酚，會競爭一抗，抑制抗體與板上包被的藥物抗原結(jié)合。加入酶標(biāo)記的二抗，形成包被抗原-抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物。加入底物后，產(chǎn)物的顏色深淺與樣品中己烯雌酚的濃度成反比。

二、樣品前處理

由于上酶標(biāo)板檢測必須采用液體樣本，所以必須對樣品進(jìn)行前處理，提取出其中的氯霉素和己烯雌酚。因兩種藥殘的樣品前處理步驟大同小異，以下以氯霉素的前處理為主，合并敘述。以筆者在工作中采用的試劑盒為例，所有的提取液、洗滌液等均需預(yù)先配成1倍濃度。

（1）稱取3.0±0.05g（己烯雌酚稱取2.0g）組織樣本于50mL離心管中；

（2）加入6mL乙酸乙酯（己烯雌酚加6mL乙腈和2mL組織提取液）；

（3）渦漩3-5分鐘；

（4）4000轉(zhuǎn)離心10分鐘，取4mL有機相（己烯雌酚取3mL有機相至另一試管中加入150mg組織清洗劑，渦漩30秒，室溫靜置5分鐘，再次4000轉(zhuǎn)離心10分鐘后取2.4mL上清液），于60℃下氮氣吹干；

（5）殘留物加入1mL正己烷和1mL樣本稀釋液（己烯雌酚加入400μL1倍PBS-甲醇（3∶2，v/v），渦漩混勻1分鐘；

（6）取50μL下層液體（己烯雌酚為均相液體）進(jìn)行檢測。

三、操作步驟與要點

此為定性定量的關(guān)鍵步驟，但由于兩種試劑盒的操作步驟不盡相同，以下分別敘述。

1.氯霉素試劑盒操作步驟

①加樣：每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50μL，加入酶結(jié)合物50μL和抗體50μL，輕輕震蕩混勻，25℃靜置溫育30分鐘。

②洗板：取出微孔板，甩干孔內(nèi)液體，用洗滌液洗板4次，250μL/孔，浸泡30秒，在吸水紙上拍干。

③顯色：每孔加入底物溶液100μL，震蕩后25℃避光顯色15分鐘。

④依序每孔加終止液50μL，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

⑤在加終止液后5分鐘內(nèi)用酶標(biāo)儀在450nm波長依序測量各孔的光度（OD）值。

2.己烯雌酚試劑盒操作步驟

①每孔加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品50μL和一抗100μL輕輕震蕩混勻，25℃靜置反應(yīng)30分鐘。

②洗板，同氯霉素試劑盒操作步驟（2）。

③每孔加入150μL二抗，25℃避光顯色30分鐘。

④洗板，同步驟（2）。

⑤加入100μLTMD底物并混勻，25℃避光靜置反應(yīng)10-15分鐘。

⑥每孔加終止液100μL，終止反應(yīng)（此時藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

⑦穩(wěn)定2分鐘后，在450nm波長下測定OD值。

3.操作要點

由于同屬酶聯(lián)免疫試劑盒，其操作有共同之處?，F(xiàn)將操作要點一并敘述如下：

（1）為保證抗體活性，試劑盒應(yīng)保存在2-8℃下，使用前將盒內(nèi)試劑移至室溫25℃平衡至少30分鐘。整個酶標(biāo)板操作過程都應(yīng)保證溫度在25℃左右。按量取用微孔條，不用的放回鋁箔袋，2-8℃保存。

（2）加樣：加樣使用一次性槍頭，避免交叉污染。加樣時應(yīng)輕緩，避免起泡，直接加于酶標(biāo)板底部，勿沿孔壁加樣。一次加樣時間最好控制在10分鐘內(nèi)，如樣品數(shù)量多，在可能時推薦使用排槍加樣。

（3）溫育：為防止樣品蒸發(fā)或污染，溫育過程中推薦覆上板貼。溫育過程中應(yīng)保持溫度恒定，室溫達(dá)不到25℃時推薦使用空調(diào)，可在已恒溫的小盒子內(nèi)溫育。

圖1 Mk3型酶標(biāo)儀給出的數(shù)據(jù)

（4）洗板：洗板過程非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。ELISA分析中的重現(xiàn)性很大程度上取決于洗板的一致性。手工洗板法：吸去（不可觸及孔壁和孔底）或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)液體；在實驗臺上鋪幾層吸水紙，酶標(biāo)板向上用力拍幾次；浸泡時間不可太短，以30秒為宜；重復(fù)次數(shù)以4次為宜。自動洗板法：如有自動洗板機，就在熟練使用后再用到正式實驗中去。

（5）顯色：為保證實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物顯色反應(yīng)時間到后應(yīng)盡快加入終止液。可在加入底物溶液后每隔一段時間（如每隔10分鐘）觀察顯色情況以控制反應(yīng)時間。當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品前1-4孔有明顯梯度藍(lán)色，后5-6孔顯色不明顯時，即可加入終止液終止反應(yīng)，此時藍(lán)色立刻變?yōu)辄S色。終止液的加入順序應(yīng)與底物溶液加入順序相同。

（6）底物溶液應(yīng)為淺藍(lán)色或無色，如果顏色嚴(yán)重變深則應(yīng)棄用。底物溶液易受污染，應(yīng)避光保存。

（7）試劑盒的最佳反應(yīng)溫度為25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光值和靈敏度發(fā)生變化。

四、數(shù)據(jù)處理

以氯霉素的數(shù)據(jù)處理為例說明酶聯(lián)免疫法的數(shù)據(jù)處理。

筆者使用的是熱電Mk3型酶標(biāo)儀。給出的數(shù)據(jù)如圖1：其中A1、B1、C1、D1、E1、F1格為標(biāo)準(zhǔn)曲線OD值，G1-H3為樣品OD值。

圖2 在計算軟件上輸入的測定值

圖3 由OD值計算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖形

筆者在實際工作中使用RIDARSOFT Win (Art.No.Z9999軟件)計算，輸入界面如圖2，其中上半部分為指定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品，下半部分為標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的OD值。

計算出的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3。

計算出的結(jié)果如圖4，樣品的稀釋倍數(shù)為0.5。

圖4 計算結(jié)果

五、結(jié)果分析

對標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行分析：OD值有明顯的梯度，圖形呈曲線，判斷標(biāo)準(zhǔn)曲線合格。軟件自動分析18號樣品OD值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍；對樣品值進(jìn)行分析：1號樣品和18號樣品OD值接近或超過標(biāo)準(zhǔn)點最低濃度，判斷為樣品氯霉素含量極低，屬正?，F(xiàn)象。

六、結(jié)論

水產(chǎn)品中氯霉素和己烯雌酚的檢測對現(xiàn)時的食品安全有重要意義，酶聯(lián)免疫法作為一種快速檢測方法在實際應(yīng)用中更有潛力。因相對其它檢測方法操作簡單、快速而節(jié)省了實驗室的時間、人力，提高了檢測效率。通常農(nóng)業(yè)部一次例行監(jiān)測約50個樣品用酶聯(lián)免疫法檢測氯霉素只需要1-2天即可給出結(jié)果，但如何避免假陽性，還需進(jìn)一步研究。

（通聯(lián)：430077，湖北省水產(chǎn)科學(xué)研究所）