項冰倩， 高 慧， 樓國強， 郝卯林， 王萬鐵

(溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035)

右美托咪定通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)減輕肺缺血/再灌注小鼠腎損傷*

項冰倩， 高 慧， 樓國強， 郝卯林△， 王萬鐵△

(溫州醫(yī)科大學(xué)缺血/再灌注損傷研究所， 浙江 溫州 325035)

目的： 評價右美托咪定(dexmedetomidine,DEX)通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)減輕小鼠肺缺血/再灌注(I/R)誘發(fā)腎損傷的機制。方法: 雄性健康SPF級C57BL/6J小鼠50只，體重20～24 g， 8～10周齡，隨機分為5組(n=10)：假手術(shù)組(sham組)、I/R組、阿替美唑(atipamezole，Atip)組、DEX組和DEX+Atip組。采用小鼠在體左側(cè)肺門夾閉30 min再灌注180 min方法制備肺缺血/再灌注損傷(I/R)模型。Atip組、DEX組和DEX+Atip組分別在肺門阻斷前30 min腹腔注射Atip(250 μg/kg)、DEX(20 μg/kg)和DEX+Atip，其余處理同I/R組。再灌注結(jié)束后眼眶采血檢測血肌酐與尿素氮濃度，取腎組織光鏡下觀察腎細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變，檢測caspase-3的酶活性，TUNEL法檢測腎細(xì)胞凋亡指數(shù)，Western blot和RT-PCR檢測c-Jun氨基末端激酶(JNK)、caspase-12、CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78)的蛋白及mRNA水平。結(jié)果: 與假手術(shù)組相比，其余組光鏡下腎組織有明顯損傷，血肌酐與尿素氮、腎細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3酶活性、JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白及mRNA水平均升高(P<0.01)。與I/R、Atip組和DEX+Atip組相比，DEX組光鏡下可見腎細(xì)胞損傷減輕，血肌酐與尿素氮、腎細(xì)胞凋亡指數(shù)、caspase-3酶活性、JNK、caspase-12和CHOP表達(dá)均有下降，GRP78表達(dá)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論: 右美托咪定預(yù)先給藥可減輕小鼠肺缺血/再灌注誘發(fā)的腎損傷，其機制可能與激動α2-腎上腺素能受體，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激有關(guān)。

右美托咪定； 缺血/再灌注損傷； 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激； 細(xì)胞凋亡

肺缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷是圍手術(shù)期常見并發(fā)癥之一，多見于肺溶栓治療、肺移植、心肺聯(lián)合移植等手術(shù)治療。肺缺血/再灌注損傷常引發(fā)急性肺損傷，同時也伴隨遠(yuǎn)隔器官的功能障礙和病理性損傷，如心臟、肝臟及腎臟等。腎臟毛細(xì)血管豐富，對肺I/R反應(yīng)中的促炎因子較為敏感，使之容易發(fā)生急性腎損傷(acute kidney injury，AKI), 當(dāng)肺I/R合并腎臟損傷時，可明顯增加死亡率。肺缺血再灌注引起的缺血、缺氧可誘發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)，適度的ERS可恢復(fù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持細(xì)胞存活，但過度的ERS則會加重組織損傷。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在缺血再灌注損傷中有重要作用，可誘發(fā)細(xì)胞凋亡[1-2]。

右美托咪定(dexmedetomidine，DEX)是高選擇性α2-腎上腺素能受體激動藥，我們前期的研究結(jié)果表明，肺臟缺血前給予右美托咪定可降低促炎介質(zhì)和炎性因子，從而減輕肺的缺血/再灌注損傷，具有肺臟保護作用[3]。同時有研究證明右美托咪定對I/R損傷的心臟、腦、肝臟、腸等也具有一定的保護作用[4-8]。但右美托咪定對肺缺血/再灌注致遠(yuǎn)隔腎損傷的影響仍有待探討。本實驗旨在研究右美托咪定能否通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激來減輕小鼠肺缺血/再灌注誘發(fā)腎損傷，為臨床防治肺I/R引起的遠(yuǎn)隔器官損傷提供新治療思路與方法。

材 料 和 方 法

1 動物

雄性健康SPF級C57BL/6J小鼠50只，體重20～24 g， 8～10周齡，由溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,合格證編號為SYXK(浙)2012-075。

2 主要試劑

氯胺酮(福建古田藥業(yè)有限公司)；塞拉嗪(吉林長春華牧有限公司)；阿替美唑(atipamezole，Atip)和DEX(江蘇恒瑞制藥有限公司)；BCA試劑盒和caspase-3活性檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；TUNEL凋亡試劑盒(Roche)；本實驗中所用I抗均購自Cell Signaling Technology， II 抗均購自杭州至賢生物科技有限公司。

3 主要方法

3.1 實驗分組 實驗動物按隨機數(shù)字表法分為5組(n=10)：假手術(shù)組(sham組)、肺缺血/再灌注損傷組(I/R組)、肺缺血/再灌注+阿替美唑組(Atip組)、肺缺血/再灌注+右美托咪定組(DEX組)和肺缺血/再灌注+右美托咪定+阿替美唑(DEX+Atip組)。

3.2 肺缺血/再灌注模型的制備 依據(jù)文獻(xiàn)采用C57BL/6J小鼠在體左側(cè)肺門夾閉制備I/R模型[9]。100 mg/kg氯胺酮+10 mg/kg塞拉嗪聯(lián)合腹腔注射進行麻醉，消毒胸頸部皮膚后切開并分離皮下組織和肌肉，暴露氣管行T型切開，氣管插管后接呼吸機行機械通氣,呼吸機參數(shù)為吸呼比 2∶3、呼吸頻率120次/分、100%氧濃度、潮氣量0.6～0.8 mL/min。于左胸部3～5肋間處開胸并游離左側(cè)肺門，動脈夾阻斷左肺門，30 min后恢復(fù)血流再灌注180 min。灌注結(jié)束后處死小鼠并取腎組織。Sham組小鼠僅開胸不夾閉肺門，機械通氣210 min； I/R組小鼠左肺門阻斷30 min，再灌注180 min； Atip組、DEX組和DEX+Atip組小鼠分別在肺門阻斷前30 min腹腔注射阿替美唑(250 μg/kg)、右美托咪定(20 μg/kg)和右美托咪定+阿替美唑，其余處理同I/R組。

3.3 光鏡下腎組織的形態(tài)學(xué)觀察 取出腎組織后，取約0.5 cm3大小腎組織，經(jīng)4%多聚甲醛固定數(shù)天后石蠟包埋切片，HE染色后光鏡下觀察各組標(biāo)本組織學(xué)改變 。

3.4 血清肌酐及尿素氮濃度的檢測 實驗結(jié)束后取血液，離心后取血清，用COBAS全自動生化分析儀測定血清肌酐值和尿素氮值。

3.5 TUNEL 法檢測腎細(xì)胞凋亡指數(shù) 取血結(jié)束后處死小鼠，分離出腎臟并用無菌PBS漂洗，經(jīng)4%多聚甲醛固定，依次經(jīng)脫水、浸蠟、石蠟包埋、切片、烘烤固定制成腎組織切片，再依次經(jīng)二甲苯、無水乙醇、95%、90%、85%、80%和75%乙醇脫水、PBS漂洗后加入蛋白酶K溶液去除組織蛋白，蒸餾水漂洗。按TUNEL試劑盒說明書進行操作，光學(xué)顯微鏡(×400)下觀察腎細(xì)胞凋亡情況。細(xì)胞核呈現(xiàn)棕黃色為凋亡細(xì)胞。每張切片隨機選擇10個視野并記錄總細(xì)胞數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，計算凋亡指數(shù)(%)=凋亡細(xì)胞數(shù)÷總細(xì)胞數(shù)×100%。

3.6 Caspase-3酶活性的檢測 按每3～10 mg腎組織加入100 μL裂解液的比例加入裂解液，冰上研磨成勻漿，轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中冰上裂解5 min。4 ℃、20 000 r/min離心10～15 min后轉(zhuǎn)移上清液，按照caspase-3活性檢測試劑盒操作說明書進行操作，采用分光光度計法檢測腎組織中caspase-3酶活性。

3.7 RT-PCR檢測腎組織c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)、葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)、caspase-12和CCAAT/增強子結(jié)合蛋白同源蛋白(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein, CHOP)的mRNA表達(dá)水平 取小鼠腎組織加液氮冰上研磨，以Trizol法提取總RNA并測定RNA濃度，按照RT-PCR試劑盒(Thermo)說明書進行cDNA合成及擴增。PCR參數(shù): 94 ℃ 3 min; 94 ℃ 30 s, 56 ℃ (JNK)、58 ℃ (caspase-12)、54 ℃ (CHOP)、49 ℃ (GRP78) 或58 ℃ (GAPDH) 30 s, 72 ℃ 1 min, 循環(huán)33次; 72 ℃ 5 min。RT-PCR以GAPDH為內(nèi)參照。引物序列見表1。結(jié)果用Quantity One分析。以目的基因條帶灰度值和內(nèi)參照GAPDH條帶灰度值的比值反映其表達(dá)水平。

表1 PCR引物序列

3.8 Western blot 檢測腎組織p-JNK、 GRP78、caspase-12和CHOP的蛋白水平 冰上研磨腎組織，加入400 μL RIPA冰中裂解組織20 min，吸取勻漿液4 ℃離心取上清，BCA蛋白定量試劑盒測蛋白濃度并繪標(biāo)準(zhǔn)曲線，隨后100 ℃煮沸10 min使蛋白變性。配膠進行電泳、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，TBST漂洗后分別加 I 抗(p-JNK、JNK和GRP78 均以1∶1 000稀釋；GAPDH和caspase-12以1∶500稀釋，CHOP以1∶300稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗滌3次后加 II抗室溫孵育1 h，再次TBST洗滌，加ECL工作液反應(yīng)3 min，暗室曝光，Quantity One軟件分析蛋白吸光度值。取目的蛋白條帶吸光度值和內(nèi)參照條帶吸光度值的比值。計算p-JNK與JNK的比值，以反映p-JNK蛋白的水平。

4 統(tǒng)計學(xué)處理

使用SPSS 19.0軟件分析，計量資料行正態(tài)性檢驗，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較采用單因素方差分析，多組樣本的均數(shù)比較先行方差齊性檢驗，方差齊者，兩兩比較行SNK-q檢驗，方差不齊者行Duunet’s檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 光鏡下各腎組織形態(tài)學(xué)變化

光鏡下sham組腎小球和腎小管結(jié)構(gòu)清晰可見，未見明顯異常。I/R組、Atip組和DEX+Atip組的腎小球輪廓基本清楚，腎小管排列較為疏松、紊亂，上皮細(xì)胞明顯腫脹，部分出現(xiàn)空泡變性，部分腎小管管腔擴張，間質(zhì)水腫。DEX組的腎組織損傷減輕，腎小球和腎小管輪廓清晰，上皮細(xì)胞水腫程度減輕。見圖1。

Figure 1.The histological changes of renal tissues in each group (HE staining, ×200).

圖1 光鏡下各組腎組織形態(tài)學(xué)變化

2 各組血肌酐及尿素氮濃度變化

與sham組相比，其余4組的血清肌酐及尿素氮均有升高(P<0.01)；與I/R組相比，Atip組和DEX+Atip組無明顯差異，DEX組血肌酐及尿素氮均有下降(P<0.01)。與Atip組比較，DEX組明顯下降(P<0.01)，而DEX+Atip組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DEX組相比，DEX+Atip組的血肌酐及尿素氮水平升高(P<0.01)，見表2。

表2 各組血肌酐、尿素氮濃度、腎組織caspase-3酶活性及腎細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化

Table 2.The changes of serum creatinine (SCr)， blood urea nitrogen (BUN), renal caspase-3 enzymatic activity and apoptotic index of renal cells (Mean±SD.n=10)

GroupSCr(μmol/L)BUN(mmol/L)Caspase-3enzymaticactivityApoptoticindexofrenalcells(%)Sham22.4±3.47.6±2.039.8±5.57.9±2.5I/R39.8±2.1**19.0±2.2**104.1±8.0**58.9±3.7**Atip39.3±1.919.2±2.6105.5±7.958.5±4.6DEX28.8±2.3##△△13.4±1.8##△△81.7±4.1##△△40.5±3.8##△△DEX+Atip39.1±2.5▲▲19.2±2.4▲▲108.9±8.8▲▲61.1±3.3▲▲

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

3 各組腎細(xì)胞凋亡指數(shù)的變化

與sham組相比，其余4組的腎細(xì)胞凋亡率均有升高(P<0.01)；與I/R組相比，Atip組和DEX+Atip組差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，DEX組的腎細(xì)胞凋亡指數(shù)下降(P<0.01)。與Atip組比較，DEX組的腎細(xì)胞凋亡指數(shù)明顯下降(P<0.01)，而DEX+Atip組的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DEX組相比，DEX+Atip組的腎細(xì)胞凋亡指數(shù)升高(P<0.01)，見圖2、表2。

Figure 2.The apoptosis of the renal cells in each group detected by TUNEL (×400)

圖2 TUNEL法檢測各組腎細(xì)胞凋亡情況

4 各組腎組織caspase-3酶活性的變化

與sham組相比，其余4組的caspase-3酶活性均有升高(P<0.01)； Atip組和DEX+Atip組與I/R組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，DEX組的caspase-3酶活性與I/R組相比顯著下降(P<0.01)。與Atip組比較，DEX組的caspase-3酶活性明顯下降(P<0.01)，DEX+Atip組與Atip組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DEX組相比，DEX+Atip組的caspase-3酶活性升高(P<0.01)，見表2。

5 各腎組織p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白水平

與Sham 相比，其余各組p-JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的蛋白水平均明顯升高(P<0.01)； Atip組和DEX+Atip組與I/R組相比差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，DEX組的p-JNK、caspase-12和CHOP蛋白水平下降(P<0.01)，GRP78蛋白水平升高(P<0.01)。與Atip組比較，DEX組的p-JNK、caspase-12和CHOP蛋白水平明顯下降(P<0.01)，GRP78蛋白水平升高(P<0.01)，DEX+Atip組與Atip組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DEX組相比，DEX+Atip組的p-JNK、caspase-12和CHOP蛋白水平升高(P<0.01)，但GRP78蛋白水平無顯著改變，見圖3～6。

Figure 3.The protein level of p-JNK in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

圖3 各組p-JNK蛋白水平的比較

Figure 4.The protein expression level of caspase-12 in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

圖4 各組caspase-12蛋白表達(dá)量的變化

Figure 5.The protein expression level of CHOP in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

圖5 各組CHOP蛋白表達(dá)量的變化

Figure 6.The protein expression of GRP78 in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group.

圖6 各組GRP78蛋白表達(dá)量的變化

6 各腎組織JNK、caspase-12、CHOP和GRP78 mRNA表達(dá)水平

與sham相比，其余各組JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA水平均明顯升高(P<0.01)； Atip組和DEX+Atip組與I/R組相比的差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性，DEX組JNK、caspase-12和CHOP的mRNA水平下降(P<0.01)，GRP78的mRNA水平升高(P<0.01)。與Atip組比較，DEX組的JNK、caspase-12和CHOP的mRNA水平明顯下降(P<0.01)，GRP78的mRNA水平升高(P<0.01)，DEX+Atip組與Atip組比較差異無統(tǒng)計學(xué)顯著性；與DEX組相比，DEX+Atip組JNK、caspase-12和CHOP的mRNA水平升高(P<0.01)，GRP78的mRNA水平無變化,見圖7～10。

Figure 7.The mRNA expression level of JNK in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

圖7 各組JNK的mRNA表達(dá)水平

Figure 8.The mRNA expression level of caspase-12 in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

圖8 各組caspase-12的mRNA表達(dá)水平

Figure 9.The mRNA expression level of CHOP in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group;▲▲P<0.01vsDEX group.

圖9 各組CHOP的mRNA表達(dá)水平

Figure 10.The mRNA expression level of GRP78 in each group. Mean±SD.n=10.**P<0.01vssham group;##P<0.01vsI/R group;△△P<0.01vsAtip group.

圖10 各組GRP78的mRNA表達(dá)水平

討 論

右美托咪定為高選擇性α2-腎上腺素能受體激動藥，能夠激活膽堿能抗炎通路，具有抗炎、器官保護作用[10]；作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的α2-腎上腺素能受體時，可使細(xì)胞產(chǎn)生超極化，進而抑制神經(jīng)元的放電，阻斷了疼痛信號向大腦傳導(dǎo)，產(chǎn)生鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、抗焦慮和抑制交感活動、間接提高迷走神經(jīng)張力的效應(yīng)，其它作用還包括抗寒戰(zhàn)、止涎和利尿等[11-12]。常用于血管疾病患者圍手術(shù)期的輔助麻醉與鎮(zhèn)靜鎮(zhèn)痛，有很好的圍術(shù)期器官保護作用，能有效改善術(shù)中缺血對器官的損傷[13]。

器官缺血/再灌注時細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及多條途徑, 其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在臟器I/R中起重要作用[1]。ATP耗竭、缺血缺氧、氧化應(yīng)激、葡萄糖/營養(yǎng)物質(zhì)匱乏等均可引起ERS, 適度的ERS對機體起保護作用，但持續(xù)過強ERS將導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14-15]。本實驗檢測的4種蛋白JNK、caspas-12、CHOP和GRP78為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白。其中GRP78是一種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的鈣離子結(jié)合分子伴侶，當(dāng)細(xì)胞受到外界刺激發(fā)生ERS時，細(xì)胞內(nèi)會產(chǎn)生大量錯誤折疊或未折疊蛋白蓄積，此時GRP78也會大量表達(dá)從而與ER中錯誤折疊和未折疊蛋白結(jié)合，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。因此，GRP78的急速上調(diào)被認(rèn)為是ERS 最敏感的標(biāo)志物[16-17]。JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是MAPKs信號通路中重要的通路之一，與應(yīng)激誘導(dǎo)型凋亡有關(guān)，可被多種細(xì)胞外應(yīng)激激活而引起細(xì)胞凋亡。有研究表明，在臟器I/R損傷過程中JNK發(fā)生過度激活，而在缺血或再灌注前抑制JNK激活可明顯減少細(xì)胞凋亡，減輕臟器I/R損傷[18-20]。Caspase-12廣泛存在于小鼠的各組織中，是ERS的主要凋亡信號分子之一，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣離子平衡的失調(diào)或者內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白積累過多都會導(dǎo)致caspase-12的表達(dá)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[21-22]。CHOP又稱生長停滯及DNA損傷誘導(dǎo)蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153，GADD153)，是一個特異性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，是促凋亡的重要信號分子，在正常情況下表達(dá)水平很低，而在ERS時，其表達(dá)量大大增加，被認(rèn)為是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志物[23-24]。細(xì)胞凋亡通過線粒體途徑被激活，釋放線粒體促凋亡蛋白及凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)等，激活caspase級聯(lián)反應(yīng)，誘發(fā)細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為caspase-3凋亡蛋白酶活性升高。

研究結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，其余4組JNK、caspase-12、CHOP和GRP78的mRNA及蛋白、caspase-3凋亡蛋白酶、血肌酐和尿素氮以及腎細(xì)胞凋亡指數(shù)均呈上升趨勢，光鏡下腎小管有不同程度的水腫，腎細(xì)胞均有損傷性的變化，說明肺I/R的確引發(fā)腎組織發(fā)生過度ERS反應(yīng)，使ERS相關(guān)蛋白表達(dá)上升，并通過線粒體途徑誘發(fā)細(xì)胞凋亡引起腎組織的損傷；I/R組和Atip組相比，以上檢測指標(biāo)均無明顯差異，說明阿替美唑?qū)Ψ蜪/R誘發(fā)的腎損傷沒有拮抗作用。與I/R組相比，DEX組的JNK、caspase-12、CHOP水平、caspase-3凋亡蛋白酶活性、血肌酐和尿素氮以及腎細(xì)胞凋亡指數(shù)均有下降，光鏡下腎細(xì)胞水腫和損傷性變化減輕，說明DEX可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激反應(yīng)降低JNK、caspase-12和CHOP的水平，同時使腎細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，從而減輕肺I/R誘發(fā)的腎損傷，對腎組織起保護作用。而通過DEX組與DEX+Atip組比較，我們發(fā)現(xiàn)右美托咪定對腎組織的保護作用能被選擇性α2-腎上腺素受體阻滯劑阿替美唑所阻斷，表現(xiàn)為DA組的JNK、caspase-12、CHOP蛋白水平與caspase-3凋亡蛋白酶活性、血肌酐和尿素氮以及腎細(xì)胞凋亡指數(shù)均呈上升趨勢，光鏡下腎組織損傷加重，提示右美托咪定減輕肺I/R誘發(fā)的腎損傷的作用可能與激動α2-腎上腺素能受體有關(guān)。

綜上所述，肺缺血/再灌注前給予右美托咪定可減輕肺缺血/再灌注誘發(fā)的腎損傷，其機制可能與其通過激動α2-腎上腺素能受體，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)過度應(yīng)激有關(guān)。

[1] 郝卯林， 趙 珊， 陳海娥， 等. siRNA沉默過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激下JNK基因在缺血/再灌注肺損傷中的作用[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2014, 30(1):48-53.

[2] Zhang ZZ, Tong NT, Gong YY, et al. Valproate protects the retina from endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis after ischemia-reperfusion injury[J]. Neurosci Lett, 2011, 504(2):88-92.

[3] 羅梓垠， 郭長滿， 項冰倩， 等. 右美托咪定對肺缺血/再灌注損傷小鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子caspase-12表達(dá)的影響[J]. 中國應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2016, 32(2):164-168.

[4] 張 莉，張 勇，唐 曉，等. 右美托咪定對腎缺血再灌注誘發(fā)大鼠心肌損傷的影響[J]. 中華麻醉學(xué)雜志, 2014, 34(8):1017-1019.

[5] Ibacache M, Sanchez G, Pedrozo Z, et al. DEX medetomidine preconditioning activates pro-survival kinases and attenuates regional ischemia/reperfusion injury in rat heart[J]. Biochim Biophys Acta, 2012, 1822(4):537-545.

[6] Kili? K, Hanci V, Selek S, et al. The effects of dexmedetomidine on mesenteric arterial occlusion-associated gut ischemia and reperfusion-induced gut and kidney injury in rabbits[J]. J Surg Res, 2012, 178(1):223-232.

[7] Tüfek A, Tokg?z O, Aliosmanoglu I, et al. The protective effects of dexmedetomidine on the liver and remote organs against hepatic ischemia reperfusion injury in rats[J]. Int J Surg, 2013, 11(1):96-100.

[8] Ali K, Metin I, Unal I, et al. An investigation about the inhibition of acute ischemia/reperfusion damage by dexmedetomidine in rat ovarian tissue[J]. Gynecol Endocrinol, 2013, 29(3):222-225.

[9] 萬占海， 張 紅， 冷玉芳， 等. 右美托咪定對大鼠肺缺血再灌注損傷的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志, 2014, 34(9):1066-1068.

[10]Mantz J, Josserand J, Hamada S. Dexmedetomidine: new insights[J]. Eur J Anaesthesiol, 2011, 28(1):3-6.

[11]崔云鳳， 宋智敏， 周 姝， 等. 右美托咪定輔舒芬太尼用于全麻病人的術(shù)后鎮(zhèn)痛[J]. 中國實驗診斷學(xué), 2013, 17(2):321-323.

[12]Luan HF, Zhao ZB, Feng JY， et al. Prevention of etomidate-induced myoclonus during anesthetic induction by pretreatment with dexmedetomidine[J]. Braz J Med Biol Res, 2015, 48(2):186-190.

[13]Gertler R, Brown HC, Mitchell DH, et al. Dexmedetomidine: a novel sedative-analgesic agent[J]. Proc (Bayl Univ Med Cent), 2001, 14(1):13-21.

[14]Yousefi H, Ahmadiasl N, Alihemmati A, et al. Effect of renal ischemian-reperfusion on lung injury and inflammatory responses in male rat[J]. Iran J Basic Med Sci, 2014, 17(10):802-807.

[15] 鄭 倩， 劉 紅， 劉 華， 等. 果糖二磷酸鈉對2型糖尿病大鼠胰島內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時CHOP和JNK表達(dá)及胰島細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(4):733-737.

[16]Wu H, Tang Q, Yang J, et al. Atorvastain ameliorates myocardial ischemia/reperfusion injury through attenuation of endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis[J]. Int J Clin Exp Med, 2014, 7(12):4915-4923.

[17]Ye Z, Wang N, Xia P, et al. Parecoxib suppresses CHOP and Foxo1 nuclear translocation, but increases GRP78 le-vels in a rat model of focal ischemia[J]. Neurochem Res, 2013, 38(4):686-693.

[18]Bogoyevitch MA, Ngoei KR, Zhao TT, et al. c-Jun N-terminal kinase (JNK) signaling: recent advances and challenges[J]. Biochim Biophys Acta, 2010, 1804(3):463-475.

[19]Ishii M, Suzuki Y, Takeshita K, et al. Inhibition of c-Jun NH2-terminal kinase activity improves ischemia/reperfusion injury in rat lungs[J]. J Immunol, 2004, 172(4):2569-2577.

[20]趙 珊， 馬迎春， 劉亞坤， 等. 姜黃素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和JNK通路過度活化減輕小鼠肺缺血再灌注損傷[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(2):308-313.

[21]Poone GK, Hasseldam H, Munkholm N, et al. The hypothermic influence on CHOP and Ero1-α in an endoplasmic reticulum stress model of cerebral ischemia[J]. Brain Sci, 2015, 5(2):178-187.

[22]Lakshmanan AP, Thandavarayan RA, Palaniyandi SS, et al. Modulation of AT-1R/CHOP-JNK-Caspase12 pathway by olmesartan treatment attenuates ER stress-induced renal apoptosis in streptozotocin-induced diabetic mice[J]. Eur J Pharm Sci, 2011, 44(5):627-634.

[23]Oyadomari S, Mori M. Roles of CHOP/GADD153 in endoplasmic reticulum stress[J]. Cell Death Differ, 2004, 11(4):381-389.

[24]杜錫潮， 韓 冰， 謝汝佳， 等. 肝纖維化大鼠肝臟中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)分子CHOP和TRB3的表達(dá)變化[J]. 中國病理生理雜志, 2013, 29(5):906-912.

(責(zé)任編輯： 林白霜， 羅 森)

Dexmedetomidine reduces renal injury induced by lung ischemia/reperfusion in mice through inhibiting endoplasmic reticulum stress response

XIANG Bing-qian, GAO Hui, LOU Guo-qiang, HAO Mao-lin, WANG Wan-tie

(Ischemia/ReperfusionInjuryResearchInstituteofWenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China.E-mail:wwt@wmu.edu.cn)

AIM: To investigate the effect of dexmedetomidine (DEX) on renal injury induced by lung ischemia/reperfusion (I/R) in mice and its relationship with endoplasmic reticulum stress response. METHODS: Healthy SPF male C57BL/6J mice, weighing 20～24 g, aged 8～10 weeks, were randomly divided into 5 groups (n=10 each): sham operation group (sham group), I/R group, atipamezole (Atip) group, DEX group, and DEX+Atip group.Invivolung I/R model was established by occlusion of the left pulmonary artery for 30 min followed by 180 min of reperfusion in the mice. The Atip (250 μg/kg)， DEX (20 μg/kg) and DEX+Atip were intraperitoneally infused into the mice before left pulmonary hilus was blocked in Atip group, DEX group and DEX+Atip group, and other operations were the same as I/R group. After experiment， the mice were killed， and the renal tissues were harvested to observe the morphological changes. The enzymatic activity of caspase-3, serum creatinine and blood urea nitrogen, and cell apoptotic index of the renal cells were also analyzed. The expression of c-Jun N-terminal kinase (JNK), caspase-12， CCAAT/enhancer-binding protein homdogous protein (CHOP) and glucose-regulated protein 78 (GRP78) at mRNA and protein levels in the renal tissues was determined by RT-PCR and Western blot. RESULTS: Compared with sham group, the enzymatic activity of caspase-3, serum creatinine and blood urea nitrogen, renal cell apoptotic index, and the mRNA and protein levels of JNK, caspase-12, CHOP and GRP78 in I/R group were significantly increased (P<0.01), and the renal tissues had obvious damage under light microscope. Compared with I/R group, Atip group and DEX+Atip group, the enzymatic activity of caspase-3, serum creatinine and blood urea nitrogen, renal cell apoptotic index, and the mRNA and protein levels of JNK, caspase-12 and CHOP in DEX group were significantly decreased, and the expression level of GRP78 significantly increased (P<0.01). Furthermore, the renal tissue damage was obvious reduced. CONCLUSION: DEX effectively relieves the renal injury induced by lung I/R in mice, which may be associated with exciting α2-adrenergic receptor and inhibiting endoplasmic reticulum stress response.

Dexmedetomidine; Ischemia/reperfusion injury; Endoplasmic reticulum stress; Apoptosis

1000- 4718(2017)07- 1288- 07

2017- 02- 20

2017- 03- 21

浙江省公益技術(shù)應(yīng)用研究項目(No. 2013C33168)；浙江省新苗人才計劃項目(No. 2014R413043)；溫州市公益性科技計劃項目(No. Y20140652)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.022

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