孫占朋， 李 欣， 楊 焰， 黎 博， 魏紅艷， 胡春林， 付清玲， 廖曉星△

(1中山大學附屬第一醫(yī)院急診科，2廣東省人民醫(yī)院急危重癥醫(yī)學部， 廣東 廣州 510080；3林芝市人民醫(yī)院， 西藏 林芝 860000； 4中山大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科， 廣東 廣州 510080)

ILC2通過激活STAT6和分泌IL-13調節(jié)慢性腎功能衰竭患者的免疫功能*

孫占朋1， 李 欣2,3， 楊 焰1， 黎 博1， 魏紅艷1， 胡春林1， 付清玲4， 廖曉星1△

(1中山大學附屬第一醫(yī)院急診科，2廣東省人民醫(yī)院急危重癥醫(yī)學部， 廣東 廣州 510080；3林芝市人民醫(yī)院， 西藏 林芝 860000；4中山大學附屬第一醫(yī)院耳鼻喉科， 廣東 廣州 510080)

目的： 探討II型固有淋巴細胞(ILC2)在慢性腎衰發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機制。方法: 選擇中山大學附屬第一醫(yī)院2016年3月～2016年12月入院的慢性腎功能衰竭患者36例，選取同期健康體檢者32例為對照。流式細胞術(FCM)檢測外周血單個核細胞(PBMC)中ILC2的比例；ELISA技術檢測血漿中白細胞介素(IL)-13的濃度；提取慢性腎衰患者及健康對照者PBMC后分別分為3組(對照組、細胞因子刺激組、干預組)進行體外培養(yǎng)3 d后，ELISA法測定上清液中IL-13濃度；Western blot法對健康對照者PBMC在刺激前及刺激后15 min、30 min、1 h、2 h的轉錄活化因子6(STAT6)的磷酸化水平進行檢測。結果: 慢性腎功能衰竭患者PBMC中ILC2比例及血漿IL-13濃度均較健康人高(P<0.05)； 體外培養(yǎng)上清液中，慢性腎功能衰竭患者的3個亞組中IL-13濃度均較健康人高(P<0.05)，且2類人群中均呈現出細胞因子刺激組較對照組升高，干預組較細胞因子刺激組降低的現象；Western blot結果顯示p-STAT6的蛋白水平隨時間的延長逐漸增高。結論: 慢性腎衰患者外周血中ILC2的比例升高，同時ILC2內STAT6活化并分泌大量IL-13，介導Th2細胞的極化而調節(jié)免疫。

II型固有淋巴細胞； 流式細胞術； 慢性腎功能衰竭； 信號轉導及轉錄活化因子6； 白細胞介素-13

2型固有淋巴細胞(type 2 innate lymphoid cell，ILC2)是近期發(fā)現的一類新型的免疫細胞，該類細胞在固有免疫、淋巴組織形成、組織重塑、腫瘤以及代謝穩(wěn)態(tài)中具有重要的作用。ILC2具有典型的淋巴細胞的形態(tài)，但缺乏T細胞、B細胞和髓系細胞的標志，且高表達IL-7受體(CD127)。ILC2早期被不同的研究者所發(fā)現，分別被命名為NHCs、nuocyte或Ih2[1-4]。此外，有研究表明ILC2高表達MHCⅡ類分子和共刺激分子[5]。ILC2與Th2細胞相類似，廣泛存在于腸、腸系膜淋巴結、肺、肺引流淋巴結、氣管、皮膚、動物脂肪和血液中。目前已有大量研究表明ILC2能快速分泌Th2型細胞因子如IL-5、IL-13等，并且是其主要的細胞來源。

有文獻表明，ILC2在哮喘、變應性鼻炎等疾病患者中含量升高，且ILC2可能通過產生IL-5、IL-13導致疾病進展。體外研究發(fā)現IL-25、IL-33可以激活ILC2，導致IL-5、IL-13等細胞因子大量產生[6-7]。慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)在其疾病進程中存在著長期的慢性炎癥，但CRF中關于ILC2的比例及功能變化情況尚未明確。為此，我們擬以CRF的患者為研究對象，采用密度梯度離心法提取出其中的單個核細胞(包括淋巴細胞和單核細胞)，觀測其中ILC2細胞的比例及功能變化情況，并探索可能的干預方式，以期為CRF的診治提供新的實驗依據。

材 料 和 方 法

1 標本獲取

本課題獲得中山大學附屬第一醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會的同意和批準，以及患者或家屬的同意并簽訂知情同意書。選擇2016年3月～2016年12月期間我院收治明確診斷為CRF的患者36例，其中男性20例，女性16例，年齡(54.3±16.3)歲。所有患者的臨床和實驗室及影像學檢查均符合CRF的診斷標準；排除風濕免疫性疾病(如系統性紅斑狼瘡、類風濕性關節(jié)炎等)、腫瘤、支氣管哮喘、變應性鼻炎等疾??；患有精神疾患、嚴重心腦血管疾病、近2月內做過胸腹部手術等患者及有大面積燒傷者亦不列為選擇對象。選取同期于我院門診健康體檢者32例作為對照組，其中男性18例，女性14例，平均年齡(52.8±17.4)歲，既往無泌尿系統疾病史，經詢問病史、體格檢查等均未發(fā)現異常。兩組性別、年齡構成差異無統計學意義，具有可比性。

2 實驗方法

2.1 ILC2的檢測 診斷為CRF后取5 mL肝素抗凝管采集全血標本，于3 h內進行外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)的分離，采用Ficoll密度梯度離心，獲取外周血單個核細胞,細胞總量達1～5×106個。血漿凍存于-80 ℃冰箱備用。分離出的PBMC根據ILC2的表面標記進行染色[染色方案為FITC Lin-(BD)、FITC FceRI-(eBioscience)、PE CRTH2+(BD)、PE-CyTM7 CD127+(eBioscience)]，4 ℃孵育30 min，PBS重懸，300×g離心5 min后去上清，再次加入300 μL PBS重懸，轉移入流式管內，10色科研用分析型流式細胞儀(Beckman-Gallios)檢測ILC2占PBMC的比例(若不能立刻上機檢測，需使用4%多聚甲醛固定，但一般于固定12 h內上機)，實驗重復3次。在淋巴細胞中標記為Lin-(CD2-、CD3-、CD14-、CD16-、CD19-、CD56-、CD235a-)、FceRI-、CRTH2+和CD127+的細胞即為ILC2。

2.2 細胞培養(yǎng) 同時獲取健康體檢者與CRF患者的PBMC，將其接種于96孔板內，每位患者或健康對照(healthy control，HC)者的PBMC細胞分別分為3組，第1組為對照組，除培養(yǎng)基外不加任何成分；第2組為細胞因子刺激組(cytokine組)，加入刺激劑IL-2(50 μg/L)、IL-25(10 μg/L)和IL-33(10 μg/L)；第3組為干預組，除加入上述刺激劑外，再加入治療用甲強龍(methylprednisolone，MP; 10 mg/L)。于含5% CO2的37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中共培養(yǎng)3 d。

2.3 IL-13測定 嚴格按照IL-13 ELISA檢測試劑盒(Amershan life science)說明書操作。取凍存血漿，室溫解凍后，ELISA測定IL-13的含量；收集96孔板內培養(yǎng)3 d后的細胞及培養(yǎng)液后離心，取上清液進行適當倍數的稀釋后行ELISA檢測。將100 μL樣本加入IL-13單抗包被孔中，加入已標記生物素的IL-13多抗，形成雙夾心抗原抗體復合物，再加入酶標的生物素抗體，加入酶的底物發(fā)生顯色反應，酶標儀450 nm處讀吸光度值。描繪不同稀釋濃度IL-13標準品曲線，計算樣品IL-13含量，以上實驗重復3次。

2.4 Western blot法檢測信號轉導及轉錄活化因子6(signal transducers and activators of transcription 6，STAT6)的磷酸化水平 對健康人PBMC在加刺激劑(IL-2、IL-25、IL-33)前及刺激后15 min、30 min、1 h、 2 h的p-STAT6蛋白水平進行檢測。取健康人PBMC細胞，提取全蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒對所提蛋白進行定量，并進行蛋白預處理。取50 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳, 按濕轉法將電泳產物轉移到PVDF 膜, 5%的脫脂奶粉封閉2 h, 滴加 I 抗4 ℃過夜，TBST洗膜(5 min、3次), 滴加HRP標記的 II 抗，室溫下孵育1 h，TBST 洗膜(5 min、3 次)，膠片曝光，顯影、定影，并計算蛋白灰度值，實驗重復3次。

3 統計學處理

應用Graph Pad Prism 5.0統計軟件對所得數據進行統計學處理，計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，兩組間差異采用獨立樣本t檢驗方法進行比較；多組比較采用單因素方差分析，用SNK-q檢驗進行均數間兩兩比較，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 CRF患者中ILC2比例的變化

在CRF組中ILC2在PBMC中的占比為(0.03±0.02)%。ILC2在PBMC中的比例消除了Lin-細胞和PBMC絕對數量變化帶來的影響，最能反應其在炎癥反應中的功能活化情況，這一比例在CRF組顯著高于健康對照組(P<0.05)，見圖1。

2 CRF患者血漿中IL-13含量的變化

CRF組患者血漿中IL-13的含量為(2.58±0.73) ng/L，健康對照組血漿中IL-13的含量為(0.84±0.58) ng/L，兩組相比差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

3 體外細胞因子刺激及激素干預后IL-13含量的變化

CRF患者PBMC體外培養(yǎng)的上清液中，對照組、細胞因子刺激組和干預組的IL-13的含量分別為(12.77±8.01) ng/L、(454.54±339.60) ng/L和(114.57±58.47) ng/L；在健康成年人組，上述3組IL-13的含量分別為(1.26±0.67) ng/L、(66.06±18.24) ng/L和(8.34±1.99) ng/L。CRF患者的細胞因子刺激組IL-13含量較對照組顯著升高(P<0.01)，干預組IL-13的含量較刺激組有所下降(P<0.01)，健康人亞組亦表現出這一規(guī)律，差異有統計學意義。CRF患者PBMC體外培養(yǎng)的上清液中對照組、細胞因子刺激組和干預組的IL-13含量均較健康人升高，且兩兩相比差異有統計學意義，見圖3。

Figure 1.Ratio of ILC2 in total PBMCs. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHC group.

圖1 PBMC中ILC2的流式細胞術分析

Figure 2.IL-13 concentration in plasma. Mean±SD.n=3.**P<0.01vsHC group.

圖2 CRF患者與健康人血漿中IL-13含量的比較

Figure 3.Changes of IL-13 content in， PBMCinvitro. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsHC；#P<0.05vscontrol；△P<0.05vscytokine.

圖3 CRF患者與健康人PBMC體外培養(yǎng)干預后IL-13含量的變化

4 PBMC中p-STAT6活化情況

Western blot結果顯示p-STAT6的蛋白水平隨細胞因子刺激時間的延長逐漸增高，見圖4。這表明p-STAT6在刺激劑的作用后逐漸激活。

Figure 4.The protein levels of p-STAT6 after stimulation. Mean±SD.n=3.**P<0.01vs0 min group.

圖4 健康人PBMC體外刺激后不同時點p-STAT6蛋白水平的比較

討 論

ILC2起源于骨髓淋巴祖細胞，在轉錄因子RORα和GATA3的調控下發(fā)育成熟，其在發(fā)育和形態(tài)上屬于淋巴細胞譜系，但不表達T細胞或B細胞表面的特異性識別受體TCR或BCR，不表達譜系發(fā)育分子Lineage[8]。人ILC2特異性表達IL-7受體α鏈(CD127)以及Th2細胞的化學誘導趨向性受體CRTH2；在IL-33、IL-25及胸腺基質淋巴細胞生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP)的刺激下可產生大量2型細胞因子[9]。小鼠實驗中還發(fā)現ILC2可以對抗寄生蟲感染，通過分泌大量IL-13使杯狀細胞大量分泌黏液、平滑肌收縮以清除寄生蟲[7]。

2型細胞因子既可以由Th2細胞產生，也可以由ILC2產生；然而IgE的產生主要還是依賴T細胞分泌的2型細胞因子。ILC2在IgE介導的炎癥反應中所起作用較小，充其量為輔助作用。結合臨床實踐中，很多患者并無IgE升高證據，推測ILC2在Th2免疫反應主導的疾病中是Th2細胞因子的重要來源，且ILC2的作用不依賴T細胞和B細胞。

IL-13是一種重要的Th2細胞因子?，F已經明確，IL-13是一種10 kD含有112個氨基酸的蛋白質，3個α螺旋疏水結構構成其核心。其編碼基因位于第5條染色體長臂的3區(qū)1帶(5q31)，由4個外顯子和3個內含子構成[10]。IL-13對單核巨噬細胞、B淋巴細胞、中性粒細胞和血管內皮細胞等具有多種生物學活性。Minty等[11]報道，IL-13可明顯抑制由細菌脂多糖誘導的單核巨噬細胞產生IL-1β、IL-6、IL-8及TNF-α等細胞因子，在急慢性炎癥反應中發(fā)揮抗炎作用。

人 IL-13 主要由 CD4、CD8 T 細胞產生，部分由肥大細胞、嗜酸性粒細胞分泌。IL-13 通過與細胞表面的IL-13受體結合而發(fā)揮生物學效應。已經證實多種免疫性腎小球疾病存在NO產生亢進，IL-13可抑制NO產生及NO合成酶mRNA表達，因此IL-13在腎小球腎炎發(fā)病中發(fā)揮著重要作用[12]。Lakkis等[13]的實驗表明，用抗腎小球基膜抗體誘發(fā)大鼠腎小球腎炎后，測得IL-13 mRNA的表達顯著增高，提示IL-13在調節(jié)腎臟炎癥中有重要意義。

慢性腎衰竭是各種原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病進行性發(fā)展的共同轉歸。IL-13作為多功能的免疫調節(jié)性細胞因子在腎臟病中的表達和作用機制的研究已備受重視。有研究顯示CRF患者血漿中IL-13水平較正常對照組增高，且隨著腎功能損害程度的加重而增高，至尿毒癥時達最高，且與肌酐呈負相關[14-15]，從而推測CRF患者血漿IL-13增加，可能作為一種重要的防御機制拮抗腎小球系膜細胞的增殖和炎癥介質產生的損害作用。

本實驗結果顯示，CRF患者PBMC中ILC2的比例明顯升高，與健康對照組相比差異顯著，且同時血漿中IL-13水平明顯高于正常人，推測在CRF患者常有低水平的內毒素血癥發(fā)生，機體處于炎癥狀態(tài)，受炎癥刺激，外周血中PBMC處于激活狀態(tài)，尤其是ILC2體積增大，功能被激活，炎癥因子產生增加，同時IL-13分泌也隨之增加，以拮抗炎癥介質生物活性，調節(jié)機體免疫功能。

體外刺激結果發(fā)現，在IL-2、IL-25和IL-33聯合刺激下，無論是健康人還是CRF患者，IL-13的水平顯著增高，且CRF組較健康對照組升高更為明顯，進一步證明IL-13的分泌主要來自于ILC2細胞功能的激活，而非T細胞。再加入激素干預后，健康對照組和CRF組IL-13的分泌量均較不加激素組下降，說明了激素對炎癥反應的抑制作用，也為臨床上慢性腎炎、慢性腎衰患者的激素治療提供了新的依據。

STAT是一種新型的轉錄因子家族，可與靶基因調控區(qū)DNA結合，且與酪氨酸磷酸化信號偶聯，發(fā)揮轉錄調控作用[16-17]。哺乳動物的STAT家族成員包括STAT1(αβ)、STAT2、STAT3(αβγ)、STAT4、STAT5a、STAT5b、STAT6等共7種[18]。新近研究發(fā)現，STAT6在Th2分化中起關鍵作用，而且是Th2分化的特異性轉錄因子，可促進Th2細胞增殖和產生IL-4、IL-13等細胞因子，使Th1/Th2比例失衡[19]。

STAT6在胞質內是作為一種潛在的單體形式存在。當IL-13同膜受體(IL-4Rα)結合，酪氨酸系統被激活后進而激活胞漿內STAT6，引起該蛋白Y641位點上的酪氨酸殘基磷酸化，激活的SH2區(qū)域發(fā)生同源或異源二聚化而形成二聚體；二聚體進入細胞核內與特定的DNA位點結合，引起相關基因(如IgE、IL-4R、eotaxin等)的表達。在生理情況下正常細胞STAT6的配體依賴性激活是一個短暫的過程，STAT6 蛋白的異常表達與許多疾病的發(fā)生密切相關。STAT6 不僅誘導并確保Th細胞分化為Th2，為細胞表型維持所必需，同時可使已經分化的Th1細胞重新表現出Th2的表型特征。

本實驗中正常人PBMC中p-STAT6隨時間的延長表達量逐漸增高，表明在刺激劑的作用下，p-STAT6逐漸被IL-13通過一系列反應激活，產生相應的抗炎作用。綜上，ILC2可能通過調控STAT6所介導的信號轉導系統來調控慢性腎衰患者免疫系統。

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(責任編輯： 林白霜， 余小慧)

ILC2 regulates chronic renal failure patients’ immunity by secretion of IL-13 through activating of STAT6

SUN Zhan-peng1, LI Xin2, 3, YANG Yan1, LI Bo1, WEI Hong-yan1, HU Chun-lin1, FU Qing-ling4, LIAO Xiao-xing1

(1DepartmentofEmergencyMedicine,TheFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,2DepartmentofEmergency&CriticalCareMedicine,GuangdongProvincialPeople’sHospital,Guangzhou510080,China;3ThePeople’sHospitalofLinzhiCity,Linzhi860000,China;4DepartmentofOtorhinolaryngology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China.E-mail:liaowens@163.com)

AIM: To explore the effect and possible mechanism of type 2 innate lymphoid cell (ILC2) on the development of chronic renal failure (CRF). METHODS: The patients with chronic renal failure (n=36) in the Fist Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University from March 2016 to December 2016 were selected, and 32 healthy persons in the same period were enrolled in the study for control. The proportion of ILC2 in the PBMC of CRF patients and healthy controls was detected by flow cytometry, IL-13 concentration in the plasma was measured by ELISA. The isolated PBMCs from the patients and healthy persons were divided into 3 groups (control group, cytokine group, intervention group) and culturedinvitrofor 3 days, respespestively， then IL-13 concentration was measured by ELISA. The protein levels of phosphorylated signal transducers and activators of transcription 6 (p-STAT6) in the PBMC of healthy controls before stimulation and after stimulation for 15 min, 30 min, 1 h, 2 h were determined by Western blot. RESULTS: The proportion of ILC2 in the PBMC and the plasma IL-13 concentration of CRF patients was higher than that in the healthy controls (P<0.05). In the culture supernatantinvitro, IL-13 concentration in the 3 subgroups of CRF patients (control group, cytokine group, intervention group) were all higher than that in the healthy controls (P<0.05), both the 2 groups showed a trend that the active IL-13 concentration in cytokine group was higher than that in control group, and that in intervention group was lower than that in cytokine group. The protein levels of p-STAT6 in cytokine stimulated-PBMC with a time dependent manner. CONCLUSION: The percentage of ILC2 in the PBMC is elevated in CRF patients. Furthermore, the ILC2 secret large amount of IL-13 to mediate the polarization of Th2 cells to regulate immunity through activating p-STAT6.

Type 2 innate lymphoid cells; Flow cytometry; Chronic renal failure; Signal transducers and activators of transcription 6; IL-13

1000- 4718(2017)07- 1301- 05

2016- 11- 28

2017- 03- 17

國家自然科學基金資助項目(No. 81671882; No. 81471832; No. 81272062)；廣東省自然科學基金資助項目(No. 2016A030311039)；廣東省科技計劃(No. 2015A020212012)；廣東省人民醫(yī)院人才引進項目

R392.32； R692.5

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.024

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