晏 蕭， 夏紀(jì)毅， 程 波， 朱永生， 姜 睿△

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 1泌尿外科， 2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 四川 瀘州 646000)

·實(shí)驗(yàn)技術(shù)·

靶向S1P2基因的siRNA有效片段慢病毒載體的篩選*

晏 蕭1， 夏紀(jì)毅2， 程 波1， 朱永生1， 姜 睿1△

(西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院1泌尿外科，2醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心， 四川 瀘州 646000)

目的： 篩選能顯著抑制原代培養(yǎng)的自發(fā)性高血壓大鼠(spontaneously hypertensive rats，SHR) 陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)1-磷酸鞘氨醇受體2(sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1P2)基因表達(dá)的siRNA慢病毒載體。方法: SHR及SD大鼠各5只用于原代培養(yǎng)陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞并分成6組，每組5個(gè)樣本，每個(gè)樣本約1.0×105個(gè)細(xì)胞，分別為攜帶靶向S1P2基因的siRNA-1～3號(hào)靶點(diǎn)的SHR慢病毒轉(zhuǎn)染組(SHR siRNA-1、SHR siRNA-2和SHR siRNA-3組)、 攜帶慢病毒空載體的SHR轉(zhuǎn)染組(SHR GFP組)、SHR未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(SHR control組)和SD大鼠對(duì)照組(SD control組)。將靶向S1P2的siRNA片段的慢病毒載體，以感染復(fù)數(shù)(MOI)= 60轉(zhuǎn)染各組SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞，于轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，用Western blot分析各組S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS在陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)變化，RT-PCR檢測(cè)各組陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA 的表達(dá)。結(jié)果: 熒光顯微鏡下觀察SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率均>80%；SHR GFP組與SHR control組相比，S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA和蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異， SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SD control組均顯著低于SHR control組(P<0.05)。而SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組eNOS蛋白表達(dá)與SHR control組相比均無(wú)顯著差別，但SD control組顯著高于SHR control組(P<0.05)。結(jié)論: 3組針對(duì)S1P2的siRNA慢病毒載體均能顯著抑制SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)S1P2的表達(dá)，下調(diào)ROCK1和ROCK2表達(dá)，其中靶向S1P2的siRNA-1抑制效率最高。

自發(fā)性高血壓大鼠； 1-磷酸鞘氨醇受體2； 小干擾RNA； 慢病毒載體

陰莖勃起是一個(gè)由血管、神經(jīng)共同調(diào)節(jié)的復(fù)雜生理過(guò)程，涉及多條信號(hào)通路，其中一氧化氮(nitric oxide，NO)/環(huán)磷酸鳥(niǎo)苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)信號(hào)通路障礙、RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的激活等原因都可導(dǎo)致勃起功能障礙(erectile dysfunction，ED)的發(fā)生。40歲以上男性中有近40%患有不同程度的ED，且ED患病率隨著年齡增加[1]。此外，心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)危險(xiǎn)因素(如血脂異常、高血壓、糖尿病、吸煙、肥胖、代謝綜合征等)與ED的發(fā)生顯著相關(guān)[2]。ED與CVD是2種具有不同表現(xiàn)形式的相同的系統(tǒng)性疾病，ED也是心血管疾病的早期臨床表現(xiàn)和導(dǎo)致心血管事件發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3-4]。

高血壓作為常見(jiàn)的CVD危險(xiǎn)因素，高血壓人群中ED的發(fā)病率超過(guò)正常血壓人群發(fā)病率的2倍[5]。高血壓可通過(guò)下調(diào)陰莖海綿體內(nèi)一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)表達(dá)，使NO合成減少，抑制內(nèi)皮型一氧化氮(endothelial nitric oxide synthase, eNOS)/NO 信號(hào)通路，以及通過(guò)激活RhoA/Rho激酶信號(hào)通路，增加陰莖海綿體平滑肌張力，從而導(dǎo)致ED[6-8]。5型磷酸二酯酶抑制劑(phosphodiesterase type 5 inhibitor, PDE5I)作為當(dāng)前治療ED的一線用藥，具有與cGMP類(lèi)似的結(jié)構(gòu)，可通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合PDE5的催化位點(diǎn)從而抑制eNOS/NO 信號(hào)通路中cGMP降解，以維持陰莖的勃起[9]。但部分糖尿病、心血管疾病引起的難治性ED在單獨(dú)應(yīng)用PDE5I治療時(shí)無(wú)效，其中西地那非在治療高血壓性ED時(shí)有效率僅為83.2%[5],表明包括RhoA/Rho激酶信號(hào)通路在內(nèi)的其它分子信號(hào)在高血壓性ED的發(fā)生中具有重要作用。我們前期研究發(fā)現(xiàn)自發(fā)性高血壓大鼠(Spontaneously hypertensive rats，SHR)陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中RhoA/Rho激酶信號(hào)通路激活，導(dǎo)致陰莖海綿體平滑肌張力增加[6-7]。此外，還發(fā)現(xiàn)高血壓導(dǎo)致的ED與1-磷酸鞘氨醇受體2(sphingosine-1-phosphate receptor 2，S1P2)上調(diào)相關(guān)[8]，認(rèn)為高血壓可通過(guò)上調(diào)S1P2激活RhoA/Rho激酶信號(hào)通路，從而引起ED。因此抑制SHR的S1P2表達(dá)，有望改善勃起功能，成為治療高血壓引起的ED新的治療方式。本研究通過(guò)構(gòu)建3條針對(duì)大鼠S1P2的小干擾RNA(small interfering RNA, siRNA)慢病毒載體，轉(zhuǎn)染至SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中，篩選出能夠顯著抑制S1P2表達(dá)的siRNA慢病毒載體，并觀察S1P2基因沉默對(duì)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路的影響。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

10周齡健康雄性SHR、SD大鼠各5只，分別購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司[許可證號(hào)為SCXK(京)2012-0001]、西南醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)為SCXK(川)2013-17]。

2 材料

攜帶靶向S1P2基因的siRNA慢病毒載體(上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司)；兔抗大鼠S1P2多克隆抗體和兔抗大鼠ROCK2多克隆抗體(Santa Cruz)；兔抗大鼠ROCK1多克隆抗體和小鼠抗大鼠eNOS多克隆抗體(Abcam)；小鼠抗大鼠GAPDH多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶(horseradish piroxidase，HRP)標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗小鼠IgG(碧云天公司)；總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；RT-PCR 試劑盒(TaKaRa)；DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、青-鏈霉素混合液和0.25%胰蛋白酶液(HyClone)；倒置熒光顯微鏡(Olympus)；恒溫細(xì)胞孵箱(Thermo)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)； PCR 擴(kuò)增儀(MyCycler)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)。

3 方法

3.1 大鼠陰莖海綿體平滑肌培養(yǎng)與鑒定 采用本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法對(duì)SHR和SD大鼠陰莖海綿體平滑肌進(jìn)行原代培養(yǎng)[10]，培養(yǎng)并純化至第4代，采用α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin, α-SMA)標(biāo)記陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞，應(yīng)用免疫熒光法與流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的性質(zhì)及純度鑒定。用臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)法對(duì)細(xì)胞存活率進(jìn)行細(xì)胞活力測(cè)定。

3.2 siRNA 慢病毒載體的制備 由上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司針對(duì)大鼠S1P2基因合成3條特異性siRNA。siRNA序列1為5’-GCTCTACGGCAGTGACAAA-3’，siRNA序列2為5’-GTGCCATCGTGGTGGAGAA-3’，siRNA序列3為5’-TGGAGAGAGGCTTGCATAT-3’，空載體為5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。并以此構(gòu)建、包裝3種慢病毒載體及空病毒載體。

3.3 慢病毒轉(zhuǎn)染 將5只SHR和5只SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞隨機(jī)分為6個(gè)組，分別為攜帶靶向S1P2基因siRNA-1～3號(hào)靶點(diǎn)的SHR慢病毒轉(zhuǎn)染組(SHR siRNA-1、SHR siRNA-2和SHR siRNA-3組)、 攜帶慢病毒空載體的SHR轉(zhuǎn)染組(SHR GFP組)、SHR未轉(zhuǎn)染對(duì)照組(SHR control組)和SD大鼠對(duì)照組(SD control組)。在病毒轉(zhuǎn)染前1 d消化細(xì)胞，并制成密度為5.0×107/L的細(xì)胞懸液，以2 mL每孔接種在6孔板上。接種后第2天，觀察細(xì)胞若細(xì)胞生長(zhǎng)良好，長(zhǎng)至約40%融合時(shí)可行慢病毒轉(zhuǎn)染。-80 ℃冰箱取出病毒，于冰上融化，按照每孔病毒轉(zhuǎn)染液最終體積1 mL，在完全培養(yǎng)基中加入Polybrene，使其最終濃度為50 mg/L, 以感染復(fù)數(shù)(MOI)=60加入病毒原液。用吸管洗盡每孔中培養(yǎng)基，將制備好的病毒轉(zhuǎn)染液混勻后加入相應(yīng)孔中，轉(zhuǎn)染12 h后吸出病毒轉(zhuǎn)染液，用完全培養(yǎng)基洗2次，加入含20%胎牛血清的完全培養(yǎng)基2 mL后繼續(xù)于5% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白表達(dá)情況，轉(zhuǎn)染效率低于80%的孔重新進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率大于80%的孔繼續(xù)培養(yǎng)4 d后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

3.4 RT-PCR檢測(cè)胞內(nèi)S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA水平 (1)引物設(shè)計(jì)合成：由上海生工生物有限公司采用Beacon Designer 2軟件設(shè)計(jì)并合成S1P2、ROCK1、ROCK2和GAPDH引物，序列見(jiàn)表1。(2)總RNA提?。翰《巨D(zhuǎn)染細(xì)胞后第7天，按照RNAsimple總RNA提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)說(shuō)明書(shū)提取各組細(xì)胞總RNA。每個(gè)樣本取1 μL，用紫外分光光度儀檢測(cè)RNA純度和濃度，吸光度(A)值介于1.8～2.0，濃度>84.22 μg/L為合格，并行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。(3)逆轉(zhuǎn)錄：按RT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)，加入dNTP Mixture 1 μL、Oligo dT Primer(2.5 μmol/L)1 μL和總RNA 1 μg，加RNase-free dH2O至10 μL，在PCR儀上進(jìn)行65 ℃ 5 min變性、退火反應(yīng)；再向以上變性退火反應(yīng)液中加入5× PrimeScript buffer 4 μL、RNase inhibitor 0.5 μL、PrimeScript RTase 0.5 μL和RNase-free dH2O 5 μL，在PCR儀上按30 ℃ 10 min、42 ℃ 25 min、95 ℃ 5 min進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為穩(wěn)定的cDNA。(4)PCR擴(kuò)增反應(yīng)及凝膠電泳：配制10× PCR buffer Ⅱ 5 μL、dNTP Mixture 2 μL、TaKaRa Ex Taq HS 0.5 μL、反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液5 μL、上游引物和下游引物各0.5 μL、H2O 36.5 μL的50 μL體系，94 ℃ 1 min、57 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。配制2%的瓊脂糖凝膠，加入0.1 mg/L Godview，PCR擴(kuò)增反應(yīng)后在110 V恒壓下電泳30 min。使用凝膠成像系統(tǒng)照相，并分析各組指標(biāo)灰度值。

表1 用于RT-PCR的引物序列

3.5 Western blot測(cè)定S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS在大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中的表達(dá) 吸出6孔板內(nèi)培養(yǎng)液后，PBS洗滌3次，每孔加入200 mL提前配置好的裂解液，將6孔板置于冰上充分裂解30 min，用刮棒將細(xì)胞刮于每孔一側(cè)，吸入EP管。4 ℃下15 000 r/min離心5 min，取上清液并加入5×上樣緩沖液后開(kāi)水煮沸5 min。制10%分離膠，取上述蛋白液上樣，電泳初始電壓80 V，當(dāng)溴酚藍(lán)染料的前緣進(jìn)入分離膠上緣后提高電壓至120 V，繼續(xù)電泳至溴酚藍(lán)到分離膠的下緣。0.4 A 恒流轉(zhuǎn)膜120 min，PVDF 膜以5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，兔抗大鼠ROCK1(1∶1 000)、ROCK2 (1∶500)，以及小鼠抗大鼠S1P2(1∶500)、eNOS(1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，羊抗兔IgG及羊抗小鼠IgG(1∶2 000)室溫孵育1 h。ECL化學(xué)發(fā)光，以Quantity One軟件進(jìn)行分析，結(jié)果以S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS灰度值與GAPDH灰度值進(jìn)行比較。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 19.0軟件處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，各組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，S1P2與ROCK1、ROCK2表達(dá)量的相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 大鼠陰莖海綿體平滑肌鑒定

培養(yǎng)、純化至第4代的SHR及SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞用α-SMA免疫熒光鑒定。在熒光顯微鏡下觀察，SHR和SD大鼠的細(xì)胞綠色熒光染色陽(yáng)性分別為(94.140±1.640)%和(94.180±1.281)%，見(jiàn)圖1。流式細(xì)胞術(shù)純度鑒定顯示，SHR和SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞純度分別達(dá)(95.382±1.383)%和(94.620±2.910)%，見(jiàn)圖2。臺(tái)盼藍(lán)進(jìn)行細(xì)胞染色，鏡下可見(jiàn)SHR和SD大鼠活細(xì)胞率分別為(98.280±0.691)%和(97.760±0.832)%。

Figure 1.Observation of the corpus cavernosum smooth muscle cells of the SHR and SD rats by immunofluorescence staining (×200). The experiments were repeated for 5 times.

圖1 SHR和SD大鼠的陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞免疫熒光鑒定

Figure 2.Identification of the corpus cavernosum smooth muscle cells of the SHR and SD rats by flow cytometry. The purity of the SHR and SD rat corpus cavernosum smooth muscle cells was 98.49% and 97.04%， respectively. Mean±SD.n=5.

圖2 SHR和SD大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞的FCM鑒定

2 病毒轉(zhuǎn)染后胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)

在病毒轉(zhuǎn)染后72 h于熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞綠色熒光蛋白表達(dá)情況，可見(jiàn)SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組細(xì)胞均能激發(fā)綠色熒光，且熒光陽(yáng)性細(xì)胞大于80%，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的慢病毒載體能成功轉(zhuǎn)入SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)。SHR control和SD control組細(xì)胞不能激發(fā)綠色熒光，此外，可見(jiàn)SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組細(xì)胞間雜質(zhì)增多，部分細(xì)胞出現(xiàn)皺縮，細(xì)胞呈多角形，形態(tài)不規(guī)則，少量細(xì)胞脫落，以SHR siRNA-3組最為明顯，見(jiàn)圖3。

Figure 3.Green fluorescence of the corpus cavernosum smooth muscle cells after transfection (×100).

圖3 轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)綠色熒光表達(dá)情況

3 RT-PCR測(cè)定各組大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞胞內(nèi)S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA表達(dá)

RT-PCR所測(cè)得SHR GFP組與SHR control組間S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但均顯著高于SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3及SD control組，SHR siRNA-1組被抑制效率最高(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

Figure 4.The mRNA expression of S1P2, ROCK1 and ROCK2 in the corpus cavernosum smooth muscle cells after transfection. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSHR control.

圖4 轉(zhuǎn)染后陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)S1P2、ROCK1和ROCK2 mRNA表達(dá)的變化

4 Western blot測(cè)定S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS在各組大鼠陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)

S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS蛋白在6組細(xì)胞中均有表達(dá)，其中S1P2、ROCK1和ROCK2在SHR GFP組與SHR control組間表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但顯著高于SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3及SD control組，SHR siRNA-1組抑制效率最高(P<0.05)。與SHR control組相比，eNOS在SHR siRNA-1、SHR siRNA-2、SHR siRNA-3和SHR GFP組表達(dá)水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，但顯著低于SD control組(P<0.05),見(jiàn)圖5。

Figure 5.The protein expression of S1P2, ROCK1, ROCK2 and eNOS in the corpus cavernosum smooth muscle cells after transfection. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsSHR control.

圖5 轉(zhuǎn)染后陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞內(nèi)S1P2、ROCK1、ROCK2和eNOS蛋白表達(dá)的變化

5 Western blot中S1P2與ROCK1、ROCK2表達(dá)量的相關(guān)性分析

S1P2與ROCK1的蛋白表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.887(P<0.05)。S1P2與ROCK2的蛋白表達(dá)量進(jìn)行相關(guān)性分析，相關(guān)系數(shù)r=0.894(P<0.05)。

討 論

在高血壓人群中ED發(fā)病率高于正常血壓人群，約為35%～50.6%，且高血壓引起的ED比正常血壓人群ED嚴(yán)重程度更嚴(yán)重，ED的發(fā)病率也隨高血壓病程的增加而增加[5, 11-12]。高血壓引起ED的機(jī)制包括：海綿體動(dòng)脈的部分功能和結(jié)構(gòu)異常，管壁增厚和膠原沉積使管腔直徑的減小是常見(jiàn)的結(jié)構(gòu)變化[13]；海綿體血管平滑肌細(xì)胞增殖和纖維化[13]；高血壓導(dǎo)致陰部?jī)?nèi)動(dòng)脈狹窄或閉塞導(dǎo)致其對(duì)陰莖的供血減少[14]；抗高血壓藥物的使用也是導(dǎo)致高血壓患者ED患病率增加的因素[11]；高血壓引起NO/cGMP、RhoA/Rho激酶、HO/CO等信號(hào)通路障礙是導(dǎo)致ED的重要機(jī)制[7-8, 15]。同時(shí)，ED也是高血壓患者血管損傷的臨床征兆，還意味著未來(lái)心血管事件的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加[16]。

RhoA/Rho激酶是種絲氨酸/蘇氨酸激酶,其有2種亞型：ROCKα[Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶2(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 2, ROCK2)]和ROCKβ[Rho關(guān)聯(lián)含卷曲螺旋蛋白激酶1(Rho-associated coiled-coil containing protein kinase 1, ROCK1)]。平滑肌細(xì)胞收縮主要是通過(guò)增加胞內(nèi)Ca2+濃度，使胞內(nèi)Ca2+與鈣調(diào)蛋白結(jié)合，活化肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase, MLCK)使肌球蛋白輕鏈(myosin light chain, MLC)磷酸化，導(dǎo)致肌球蛋白與肌動(dòng)蛋白發(fā)生交聯(lián)，從而引起平滑肌的收縮。而肌球蛋白輕鏈磷酸酯酶(myosin light chain phosphatase, MLCP)使磷酸化的MLC脫磷酸，轉(zhuǎn)化為MLC，引起平滑肌的舒張[17]。RhoA/Rho激酶可通過(guò)Ca2+增敏途徑抑制MLCP，增加MLC磷酸化，使平滑肌維持收縮狀態(tài)[18]。此外，動(dòng)脈粥樣硬化和血管炎的發(fā)展也涉及到調(diào)節(jié)平滑肌張力的RhoA/Rho激酶途徑[19]。我們前期研究發(fā)現(xiàn)在SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中RhoA/Rho激酶通路激活，參與高血壓性ED發(fā)生機(jī)制[6-7]。我們采用Rho激酶抑制劑法舒地爾通過(guò)抑制RhoA/Rho 激酶信號(hào)通路表達(dá)和降血壓作用，使SHR勃起功能得到改善[20]，還使用針對(duì)RhoA/Rho激酶亞型ROCK2基因的siRNA轉(zhuǎn)染至SHR海綿體平滑肌細(xì)胞后Rock2蛋白的表達(dá)受到抑制，顯著改善SHR勃起功能[6]。另一方面，我們還發(fā)現(xiàn)在SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中S1P2表達(dá)上調(diào)，而S1P2可通過(guò)激活RhoA/Rho激酶信號(hào)通路導(dǎo)致ED[8]。S1P2是一種與S1P高度親和的G蛋白偶聯(lián)受體，其最初從大鼠主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中克隆分離出來(lái)[21]，主要參與炎癥、腫瘤、動(dòng)脈粥樣硬化、平滑肌收縮及血管通透性等病理生理過(guò)程[22]。S1P2同時(shí)也是介導(dǎo)RhoA/Rho激酶信號(hào)通路激活的主要S1P受體[23]，S1P與S1P2結(jié)合后可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加和激活RhoA/Rho激酶信號(hào)通路引起不同類(lèi)型的平滑肌收縮，包括血管、支氣管、腸和膀胱平滑肌[24-26]。敲除S1P2基因的小鼠與正常小鼠相比平均動(dòng)脈壓和左心室的功能及血管形態(tài)無(wú)明顯改變異，但腎臟和腸系膜血管阻力降低，使血流增加[27],說(shuō)明S1P2能增加血管平滑肌的收縮性。S1P2同樣在陰莖海綿體組織中表達(dá)，且主要表達(dá)在陰莖海綿體平滑肌和血管內(nèi)皮細(xì)胞胞膜[8,16]。海綿體神經(jīng)損傷后陰莖組織纖維化就與S1P2活化，導(dǎo)致RhoA/ROCK1途徑上調(diào)相關(guān)[28]。在低雄激素狀態(tài)下，海綿體內(nèi)S1P2/RhoA/Rho激酶信號(hào)通路上調(diào)，引起大鼠ICPmax/MAP下降，導(dǎo)致ED[29]。血管內(nèi)皮細(xì)胞中S1P2抑制可通過(guò)操作磷酸化調(diào)節(jié)eNOS活性的蛋白激酶B(protein kinase B, Akt)，使通過(guò)eNOS產(chǎn)生的NO減少，從而降低血管屏障的破壞[30]。

在本研究中，SHR較SD大鼠對(duì)照組陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞中S1P2、ROCK1和ROCK2的mRNA和蛋白表達(dá)均顯著增加， eNOS蛋白表達(dá)顯著降低，通過(guò)針對(duì)大鼠S1P2設(shè)計(jì)的3條不同的siRNA慢病毒轉(zhuǎn)染SHR陰莖海綿體平滑肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)均能顯著抑制S1P2表達(dá)，而eNOS表達(dá)無(wú)顯著差異，表明高血壓對(duì)NO/cGMP通路影響不通過(guò)S1P2途徑；同時(shí)ROCK1和ROCK2表達(dá)均受到顯著抑制，并且S1P2 與ROCK1、ROCK2具有正相關(guān)性，表明高血壓可通過(guò)上調(diào)S1P2的表達(dá)而激活RhoA/Rho激酶信號(hào)，并且采用針對(duì)大鼠S1P2基因的siRNA可顯著抑制SHR海綿體平滑肌細(xì)胞S1P2/RhoA/Rho激酶信號(hào)通路，其中靶向S1P2基因的siRNA1慢病毒抑制效率最高，可作為抑制RhoA/Rho激酶信號(hào)通路而改善高血壓引起的ED的潛在靶點(diǎn)。

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(責(zé)任編輯： 盧 萍， 羅 森)

Screening of lentiviral vectors carrying effective siRNA targetingS1P2 gene

YAN Xiao1, XIA Ji-yi2, CHENG Bo1, ZHU Yong-sheng1, JIANG Rui1

(1DepartmentofUrology，2CenterofExperimentalMedicine,TheAffiliatedHospitalofSouthwestMedicalUniversity,Luzhou646000,China.E-mail:jiangrui@126.com)

AIM: To screen the lentiviral vector carrying siRNA with higher efficiency of suppressing the sphingosine-1-phosphate receptor 2 (S1P2) gene expression in the primarily cultured corpus cavernosum smooth muscle cells of spontaneously hypertensive rats (SHR). METHODS: SHR and SD rats (n=5 each) were used for primarily culturing corpus cavernosum smooth muscle cells. The cells were randomly divided into 6 groups： SHR siRNA-1, SHR siRNA-2, SHR siRNA-3, SHR GFP, SHR control (SHR non-transfection group), and SD control (SD rat control group). Each group had 5 samples with 1.0×105cells of each sample. At 72 h after transfection (MOI=60) with lentiviral vectors carryingS1P2 siRNA into the SHR corpus cavernosum smooth muscle cells, the expression of GFP was observed under fluorescence microscope. The protein expression of S1P2, ROCK1, ROCK2 and eNOS in the corpus cavernosum smooth muscle cells， and the mRNA expression of S1P2, ROCK1 and ROCK2 were determined by by Western blot and RT-PCR. RESULTS: The transfection efficiency of the corpus cavernosum smooth muscle cells in SHR siRNA-1, SHR siRNA-2, SHR siRNA-3 and SHR GFP groups were>80%. Compared with SHR control group， the mRNA levels and the protein expression of S1P2, ROCK1 and ROCK2 in SHR GFP group showed no remarkable changes, while those in SHR siRNA-1, SHR siRNA-2, SHR siRNA-3 and SD control groups were significantly lower than those in SHR control group (P<0.05). The protein expression of eNOS in SHR siRNA-1, SHR siRNA-2, SHR siRNA-3 and SHR GFP groups were not significantly changed as compared with SHR control group, but that in SD control group was significantly higher than that in SHR control group. CONCLUSION: Three groups of siRNA lentiviral vectors targetingS1P2 inhibit the expression of S1P2 in the corpus cavernosum smooth muscle cells of SHR, and by silencing theS1P2 expression, the expression of ROCK1 and ROCK2 is inhibited. Among them， siRNA-1 has the highest inhibitory efficiency.

Spontaneously hypertensive rats; Sphingosine-1-phosphate receptor 2; Small interfering RNA; Lentiviral vector

1000- 4718(2017)07- 1338- 07

2016- 11- 18

2017- 05- 05

四川省科技廳基金資助項(xiàng)目(No. 14JC0803)；四川省教育廳基金資助項(xiàng)目(No. 15ZA0164)；四川省人力資源和社會(huì)保障廳留學(xué)回國(guó)人員科技項(xiàng)目(川人社辦發(fā)[2016-64]號(hào))

R698： R393； Q-33

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2017.07.031

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