陳 亮，潘永明，朱科燕，徐孝平，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053)

五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬對(duì)外源性脂肪的敏感性觀察

陳 亮，潘永明，朱科燕，徐孝平，徐劍欽，陳民利

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053)

目的 觀察五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬對(duì)外源性脂肪的敏感性。方法 取雄性五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬各5只，分別采用靜脈注射脂肪乳和飼喂高脂飼料，分別檢測(cè)靜脈注射脂肪乳后0.5、1、1.5、2、2.5、3 h和飼喂高脂飼料后12、24、36、48、60、72、84、120 h的血清膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(LDL-C)和甘油三酯(TG)水平，并計(jì)算曲線下面積變化ΔAUC值。結(jié)果 注射脂肪乳后3種小型豬甘油三酯(TG)均明顯升高(P<0.01)，在注射后0.5 h達(dá)到峰值，其升高程度和ΔAUC值高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬，而TC、LDL-C和HDL-C則無明顯變化(P>0.05)；高脂飼料飼喂飲食誘導(dǎo)后3種小型豬TC、LDL-C、HDL-C和TG均明顯升高(P<0.05，P<0.01)，其中，五指山小型豬TC、LDL-C在飼喂后36 h、HDL-C在飼喂后48 h、TG在飼喂后24 h達(dá)到峰值，巴馬小型豬和西藏小型豬TC、LDL-C、HDL-C在飼喂后48-60 h、TG在飼喂后36 h達(dá)到峰值，TC、LDL-C、HDL-C的ΔAUC值高低依次為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬。結(jié)論 靜脈注射脂肪乳3種小型豬對(duì)TG敏感，脂耐量值高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬；高脂飼料飼喂對(duì)3種小型豬TC、LDL-C、HDL-C敏感，脂耐量值高低依次為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬。

小型豬；血脂代謝；脂耐量；敏感性

血脂異常是引起動(dòng)脈粥樣硬化、心腦血管疾病和高血壓的重要危險(xiǎn)因素。隨著人類物質(zhì)生活水平和生活方式的改變，血脂異常的患病率呈逐漸上升趨勢(shì)，已成為21世紀(jì)人類健康普遍關(guān)注的問題[1]。血脂代謝異常主要包括膽固醇和甘油三酯水平的異常改變，其敏感性可能與遺傳因素有關(guān)。

小型豬是研究心腦血管疾病的一個(gè)重要模型，其循環(huán)系統(tǒng)和代謝系統(tǒng)與人類極為相似[2]。在脂質(zhì)成分的比例與人類十分接近，如小型豬血脂中LDL-C成分比例占主導(dǎo)，而兔和大小鼠LDL-C成分所占比例極少，與人類差異較大[3]。我國有豐富的小型豬種質(zhì)資源，如五指山小型豬、廣西巴馬小型豬、西藏小型豬、版納小型豬、貴州香豬等，但在許多生理及其應(yīng)用特點(diǎn)尚未清楚，在人類疾病動(dòng)物模型復(fù)制和評(píng)價(jià)中具有較好的應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)前除采用糖耐量和胰島素耐量篩選評(píng)價(jià)糖代謝和胰島素代謝的敏感性外，未見小型豬血脂耐量的相關(guān)研究方法。選擇和篩選對(duì)某些指標(biāo)易感性強(qiáng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，關(guān)系到疾病動(dòng)物模型是否成功的關(guān)鍵因素之一。我們?cè)谇捌谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)在同樣的高脂環(huán)境下，巴馬小型豬、西藏小型豬、五指山小型豬的血脂水平和動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成進(jìn)度存在差異，推測(cè)可能與血脂的敏感性和耐量有關(guān)。目前有采用糖耐量和胰島素耐量篩選評(píng)價(jià)糖代謝和胰島素代謝的敏感性。為此，本實(shí)驗(yàn)采用注射脂肪乳和飼喂高脂飼料，觀察巴馬小型豬、西藏小型豬、五指山小型豬在血脂代謝敏感性，為這3種小型豬在心腦血管疾病模型中的應(yīng)用和動(dòng)物選擇提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

普通級(jí)五指山小型豬(WZS)和西藏小型豬(Tibetan)各5只，雄性，體重為(14～18) kg，分別購于廣東大華動(dòng)物保健品股份有限公司提供【SCXK(粵)2008-0022】和南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 【SCXK(粵)2011-0015】；普通級(jí)巴馬小型豬5只，雄性，體重為14～18 kg，購于上海市南匯區(qū)老港鎮(zhèn)華新特種養(yǎng)殖場(chǎng)提供【SCXK(滬)2012-0013】。飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心普通級(jí)實(shí)驗(yàn)室【SYXK(浙)2008-0116】，環(huán)境溫度為(22±1)℃，相對(duì)濕度為45%～65%。飼喂全價(jià)營養(yǎng)飼料和自由飲水，12 h/12 h明暗交替，所有小型豬在實(shí)驗(yàn)過程中按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的“3R”原則給予人道的關(guān)懷，并在適應(yīng)性恢復(fù)8周后開始正式試驗(yàn)。

1.2 主要儀器及試劑

7020全自動(dòng)生化分析儀，日本日立公司；甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白(LDL-C)均由上海申能德賽診斷技術(shù)有限公司提供。30%脂肪乳注射液(英脫利匹特)，華瑞制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào)：80EA153。高脂飼料：15%油脂、10%蛋黃粉、1.5%膽固醇、73.5%基礎(chǔ)飼料。

1.3 方法

1.3.1 靜脈注射脂肪乳對(duì)小型豬血脂代謝的影響：實(shí)驗(yàn)前將五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬禁食12 h后，稱重并行頸靜脈穿刺取血1 mL，而后耳緣靜脈注射1 mL/kg的脂肪乳，分別在靜脈注射前、注射后0.5、1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)取血，分離血清，測(cè)定血清TG、TC、LDL-C和HDL-C的變化，并計(jì)算各指標(biāo)的變化幅度(Δ)及曲線下面積AUC(脂耐量值)。

1.3.2 高脂飲食對(duì)小型豬血脂代謝的影響：實(shí)驗(yàn)前將五指山小型豬、西藏小型豬和巴馬小型豬禁食12 h，稱重并行頸靜脈穿刺取血1 mL，然后按3%體重給予高脂飼料，分別在高脂飲食前、給予后12、24、36、48、60、72、84、120 h時(shí)取血，測(cè)定血清TG、TC、LDL-C和HDL-C指標(biāo)的變化，并計(jì)算各指標(biāo)的變化幅度及曲線下面積AUC(脂耐量值)。其中在高脂飲食24 h后開始飼喂基礎(chǔ)飼料300 g/d，分成上午9:00和下午15:00兩次飼喂。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1 靜脈注射脂肪乳對(duì)3種品系小型豬血脂代謝的影響

注射脂肪乳后，3種小型豬的血清TC、LDL-C和HDL-C水平給藥前后均無明顯變化(P>0.05)，僅見血清TG水平出現(xiàn)顯著性升高(P<0.01)，并在注射0.5 h后達(dá)到峰值，隨后開始逐漸降低，且在注射后(2.5～3)h時(shí)間點(diǎn)恢復(fù)到基礎(chǔ)水平；另外，3種小型豬的AUC_ΔTG的曲線面積從高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬，但各品種間無明顯差異(P>0.05)，見圖1。

注：與西藏小型豬比較，*P<0.05，**P<0.01；與巴馬小型豬比較，△P<0.05，△△P<0.01；與注射前(0h)比較，#P<0.05，##P<0.01.圖1 靜脈注射脂肪乳對(duì)3種品系小型豬血脂代謝的影響Note. Compared with the Tibetan minipigs,*P<0.05,**P<0.01; Compared with the Bama minipigs, △P<0.05,△△P<0.01; Compared with that before injection (0 h),#P<0.05,##P<0.01.Fig.1 Effect of intravenous injection of fat emulsion on lipid metabolism in the three stocks of minipigs

2.2 高脂飲食對(duì)3種品系小型豬血脂代謝的影響

飼喂高脂飼料后，五指山小型豬TC水平明顯升高，其中在(24～72)h時(shí)升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在36 h時(shí)達(dá)到峰值，此后開始降低，直至120 h仍高于基礎(chǔ)水平；而西藏小型豬和巴馬小型豬TC水平亦升高顯著，分別在(24～72)h和(24～84)h時(shí)升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在48 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后開始降低并直至120 h時(shí)仍高于基礎(chǔ)水平；從AUC_ΔTC來看，其高低依次分別為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬，其中西藏小型豬AUC_ΔTC明顯低于五指山小型豬(P<0.05)，見圖2A。另外，五指山小型豬和西藏小型豬的HDL-C水平亦明顯升高，其中(24～120)h時(shí)升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在(48～60)h時(shí)達(dá)到峰值，此后降低并直至120 h；巴馬小型豬HDL-C水平亦有升高，其中(24～84)h時(shí)升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在48～60 h左右達(dá)到峰值，此后下降直至120 h，從AUC_ΔHDL-C來看，其高低依次分別為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬，但品種間差異不顯著(P>0.05)，見圖2B。此外，五指山小型豬LDL-C水平明顯升高，其中在(24～72)h時(shí)升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在36h時(shí)達(dá)到峰值，此后逐漸降低并至120 h；而西藏小型豬和巴馬小型豬LDL-C水平亦升高顯著，分別在(24～72)h和(24～60)h時(shí)升高顯著(P<0.05，P<0.01)，且分別在60 h和48 h時(shí)達(dá)到峰值，隨后開始降低并直至120 h；從AUC_ΔLDL-C來看，其高低依次分別為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬，其中西藏小型豬AUC_ΔLDL-C明顯低于五指山小型豬(P<0.05)，見圖2C。同樣，五指山小型豬的TG出現(xiàn)升高，并在飼喂后(84～120)h時(shí)升高顯著(P<0.05，P<0.01)，并在120 h時(shí)達(dá)到峰值；而西藏小型豬和巴馬小型豬的TG亦有上升，并在飼喂后(24～36)h時(shí)升高顯著，且分別在36 h和24 h時(shí)達(dá)到峰值，此后有所下降，并在48～120 h間維持一定的水平，從AUC_ΔTG來看，其高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬，但品種間無明顯差異(P>0.05)，見圖2D。

注：與西藏小型豬比較，*P<0.05，**P<0.01；與巴馬小型豬比較，△P<0.05，△△P<0.01；與高脂飼喂前(0 h)比較，#P<0.05，##P<0.01. 圖2 單次飼喂高脂飼料三種品系小型豬血脂代謝的影響Note. compared with the Tibetan minipigs,*P<0.05,**P<0.01; compared with the Bama minipigs, △P<0.05,△△P<0.01; compared with that before fed with high fat diet (0 h),#P<0.05,##P<0.01.Fig.2 Effect of high-fat-diet feeding on lipid metabolism in the three stocks of minipigs

3 討論

疾病動(dòng)物模型的建立和評(píng)價(jià)是研究和探討人類疾病病理機(jī)制和藥物干預(yù)的有效手段。近來，以高脂血癥為主的血脂代謝紊亂和脂質(zhì)過氧化是動(dòng)脈粥樣硬化形成和發(fā)展的重要因素，其中血脂代謝紊亂主要表現(xiàn)為TC、LDL-C、TG水平升高或HDL-C水平降低[4]。最近Ridker P M[5]提出，餐后甘油三脂濃度的可變性，正是反映了個(gè)體代謝水平的相關(guān)信息，更能反映心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，未來在冠心病患者中有必要進(jìn)行脂耐量試驗(yàn)，評(píng)價(jià)其血脂的耐受情況。但目前對(duì)于脂耐量試驗(yàn)的相關(guān)研究甚少，包括動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[6]。因此，開展脂耐量試驗(yàn)相關(guān)方法學(xué)的研究，有助于篩選和評(píng)價(jià)機(jī)體對(duì)脂質(zhì)代謝的耐受情況，對(duì)于疾病的預(yù)防具有重要的參考價(jià)值。

脂肪乳為復(fù)制大小鼠、兔等高脂血癥模型的誘導(dǎo)劑[7]。本研究在靜脈注射脂肪乳后，小型豬TG水平出現(xiàn)明顯的升高，而其它指標(biāo)則未見明顯的改變。這與脂肪乳中主要含有甘油三酯、磷脂成分有關(guān)[8]。同時(shí)，注射脂肪乳后可見小型豬機(jī)體TG水平迅速在30 min內(nèi)升高到峰值，在2.5 h后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平?？梢?，脂肪乳對(duì)小型豬體內(nèi)TG代謝反應(yīng)敏感，有助于評(píng)估機(jī)體對(duì)甘油三酯水平的吸收利用情況，且其反應(yīng)迅速、恢復(fù)時(shí)間快、是篩選TG水平敏感性較好的研究方法。同時(shí)，本研究也發(fā)現(xiàn)，注射脂肪乳后ΔTG曲線面積結(jié)果表明，相比巴馬小型豬，西藏小型豬和五指山小型豬對(duì)脂肪乳的耐受能力較差，其中西藏小型豬對(duì)甘油三酯的排泄能力最差，注射脂肪乳半小時(shí)后血清TG水平上升最高，且下降也較為緩慢。

高脂飲食在形成高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化、脂肪肝以及相關(guān)疾病并發(fā)癥等動(dòng)物模型中是最常見和重要的誘導(dǎo)劑。本研究結(jié)果表明，單次飼喂高脂飼料后小型豬體內(nèi)血脂代謝水平均出現(xiàn)明顯的升高，其中膽固醇指標(biāo)在誘導(dǎo)12 h后即可升高，(24 h～72)h時(shí)出現(xiàn)顯著性變化，72 h后逐漸下降，并至120 h后恢復(fù)到基礎(chǔ)水平，而HDL-C成分的升高可能與TC整體水平的升高有關(guān)。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)五指山小型豬的循環(huán)中膽固醇代謝指標(biāo)曲線下面積最高，西藏小型豬則最低，同樣本結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，高脂飲食后3種小型豬機(jī)體TG水平的升高，其中巴馬小型豬和西藏小型豬升高相對(duì)迅速，五指山升高相對(duì)緩慢，但ΔTG曲線下面積也證實(shí)西藏小型豬最高，巴馬小型豬較低，這與本試驗(yàn)注射脂肪乳的反應(yīng)結(jié)果較為一致。

綜合上述結(jié)果，注射脂肪乳和飼喂高脂飼料均可觀察到小型豬脂質(zhì)耐受性的變化，其中脂肪乳側(cè)重于反映TG水平的變化，高脂飲食則可同時(shí)反映TG和TC的變化，兩種方式均可用于評(píng)估小型豬脂質(zhì)代謝反應(yīng)的敏感性。但是，不同品系的小型豬對(duì)脂質(zhì)敏感性存在明顯的差異，其中，靜脈注射脂肪乳3種小型豬對(duì)TG敏感，TG脂耐量值高低依次為西藏小型豬>五指山小型豬>巴馬小型豬；高脂飼料飼喂對(duì)3種小型豬TC、LDL-C、HDL-C敏感，脂耐量值高低依次為五指山小型豬>巴馬小型豬>西藏小型豬。因此，在選擇小型豬時(shí)，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求和目的進(jìn)行選擇。

[1] 張慶國. 血脂異常的藥物治療進(jìn)展 [J]. 臨床進(jìn)展，2011，23(5): 5-6.

[2] Svendsen O. The minipig in toxicology [J]. Exp Toxicol Pathol, 2006, 57: 335-339.

[3] Kawaguchi H, Miyoshi N, Miura N, et al. Microminipig, a non-rodent experiment animal optimized for life science research: novel atherosclerosis model induced by high fat and cholesterol diet [J]. J Pharmacol Sci, 2011, 115(2): 115-121.

[4] 王特，劉運(yùn)海. Ox-LDL與動(dòng)脈粥樣硬化的研究進(jìn)展[J]. 中國醫(yī)藥指南，2011，9(29): 230-231.

[5] Ridker PM. Fasting versus nonfasting triglycerides and the prediction of cardiovascular risk: do we need to revisit the oral triglyceride tolerance test？ [J]. Clin Chem, 2008, 54(1): 11-13.

[6] 王宇輝，劉國慶. 膽固醇和甘油三酯代謝紊亂與代謝性心血管病的研究進(jìn)展 [J]. 中國醫(yī)學(xué)前沿雜志，2012，4(8): 19-22.

[7] 韓榮，王茜，張海英，等. 阿魏膠囊對(duì)高脂血癥大鼠及家兔的預(yù)防作用 [J]. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2009, 32(3): 174-177.

[8] 陳潔. 脂肪乳的特點(diǎn)及臨床應(yīng)用 [J]. 中國醫(yī)學(xué)創(chuàng)新, 2012, 9(4): 158-161.

Observation on the sensitivity of Wuzhishan, Tibetan and Bama minipigs to exogenous fats

CHEN Liang, PAN Yong-ming, ZHU Ke-yan, XU Xiao-ping, XU Jian-qin, CHEN Min-li

(Zhejiang Chinese Medical University, Hangzhou 310053, China)

Objective To observe the sensitivity of Wuzhishan, Tibetan and Bama minipigs to exogenous fats. Methods A total of 15 male minipigs including 5 WZS minipigs, 5 Tibetan minipigs and 5 Bama minipigs, were used in this study. The minipigs were intravenously injected with fat emulsion and fed with high-fat diet, and the changes of serum total cholesterol (TC), low density lipoprotein (LDL-C), high density lipoprotein (HDL-C) and triglyceride (TG) levels were detected at 0.5 h, 1 h, 1.5 h, 2 h, 2.5 h and 3 h after intravenous injection of fat emulsion and at 3 h and 12 h, 24 h, 36 h, 48 h, 60 h, 72 h and 84 h after fed with high-fat diet, respectively, and calculated the changes of area under the curve (ΔAUC) values. Results The triglyceride (TG) in the three kinds minipigs were significantly increased (P<0.01), and reached a peak at 0.5 h after injection. The degree of elevation of ΔAUC values were different showing on increasing order: Tibetan minipig > Wuzhishan minipig > Bama minipig, while TC, LDL-C and HDL-C showed no significant changes (P>0.05). Moreover, TC, LDL-C, HDL-C and TG were significantly increased in the three stocks of minipigs induced by feeding with high-fat diet (P<0.05,P<0.01). Among them, the TC and LDL-C of Wuzhishan minipigs peaked at 36 h, HDL-C peaked at 48 h and TG peaked at 24 h after feeding, respectively. TC, LDL-C and HDL-C in the Bama minipigs and Tibetan minipigs peaked at 48-60 h and TG peaked at 36 h after feeding, and the ΔAUC values of TC, LDL-C and HDL-C were in an increasing order of Wuzhishan minipigs > Bama minipigs > Tibetan minipigs. Conclusions The three stocks of minipigs are sensitive to TG after intravenous injection of fat emulsion, and the lipid tolerance values are in an order of Tibetan minipig > Wuzhishan minipigs > Bama minipigs. Meanwhile, the three stocks of minipigs are also sensitive to TC, LDL-C and HDL-C after feeding with high-fat diet, and the lipid tolerance values are in an increasing order of Wuzhishan minipig > Bama minipigs > Tibetan minipigs.

Minipig; Blood lipid metabolism; Lipid tolerance; Sensitivity

浙江省科技廳實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技計(jì)劃項(xiàng)目(2012C37078)，浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)(XTD201301)。

陳亮(1982-)，男，助理研究員，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: chl810@foxmail.com。

陳民利(1963-)，女，教授，研究方向?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物與比較醫(yī)學(xué)。E-mail: cmli991@ aliyun.com。

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0012-05

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.003

2016-12-27