杜朝陽，楊如玉，李 超，段麗娟

(河南省南陽市中心醫(yī)院血液科，河南 473001)

miR-214通過靶向調(diào)控E2F3抑制肝癌細胞的增殖

杜朝陽，楊如玉，李 超，段麗娟

(河南省南陽市中心醫(yī)院血液科，河南 473001)

目的 探討miR-214通過靶向調(diào)控E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2F3)抑制肝癌細胞的增殖。方法 RT-PCR法檢測細胞株SMMC-7721、HepG2、SK-Hep-1和Huh 7中miR-214的表達量，并利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染miR-214 NC及miR-214 mimics。采用MTT法檢測miR-214對肝癌細胞活力的影響；Hoechst染色試劑盒檢測miR-214對細胞凋亡的影響，流式細胞術(shù)檢測miR-214對細胞周期的影響；Western blot及RT-PCR法檢測miR-214對肝癌細胞中E2F3蛋白及mRNA表達量的影響，并通過熒光素酶報告基因進行驗證。結(jié)果 SMMC-7721、SK-Hep-1、Huh 7及HepG2中miR-214的表達量分別為(0.83±0.08)、(0.32±0.03)、(0.33±0.03)、(0.08±0.01)，其中HepG2中miR-214表達量最低，因此選用HepG2作為后續(xù)實驗細胞株。HepG2細胞轉(zhuǎn)染miR-214 NC及miR-214 mimics、miR-214 mimics組中miR-214表達量(0.65±0.06)明顯高于miR-214 NC組(0.14±0.01)，miR-214 mimics組細胞活力(0.35±0.03)明顯低于miR-214 NC組(0.69±0.06)，miR-214 mimics組細胞凋亡率(36.37±3.43)%明顯高于miR-214 NC組(3.74±0.34)%，miR-214 mimics組G1期明(57.79±5.78)顯長于miR-214 NC組(45.319±4.53)，miR-214 mimics組中E2F3蛋白[(0.23±0.02)、(0.24±0.02)]及mRNA表達量明顯低于miR-214 NC組[(0.98±0.09)、(0.99±0.10)]，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論 miR-214過表達能通過下調(diào)E2F3表達抑制肝癌細胞的增殖。

miR-214，肝癌細胞；E2F3；增殖

原發(fā)性肝癌是肝細胞或肝內(nèi)管細胞發(fā)生的惡性腫瘤，其中90%為肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)，是位居世界第五位及致死率第3位的腫瘤[1, 2]。目前，手術(shù)切除和肝移植是HCC最為有效的治療方法，然而，臨床研究表明超過50%的接受肝切除術(shù)的HCC患者出現(xiàn)術(shù)后復(fù)發(fā)[1, 2]。因此，探討肝癌的發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機制，對于肝癌的診斷，治療及預(yù)后具有重要的意義。

MicroRNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，能夠結(jié)合于靶基因mRNA的3’-UTR區(qū)域，降解或者阻遏靶基因的翻譯，從而抑制靶基因的表達。近些年大量研究證實miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用，包括肝癌[3]。miRNA微陣列研究顯示，miR-214在肝癌組織中的表達明顯低于正常肝組織[4]。同時恢復(fù)肝癌細胞中miR-214的表達，能顯著的抑制細胞的增殖，但具體的作用機制未知。而miRNA對細胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用，大部分源于其對靶基因的調(diào)控作用[5, 6]。研究表明E2F家族基因E2F轉(zhuǎn)錄因子3(E2F3)在肝癌組織中高表達，并與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且有研究顯示miR-214與E2F3在多種病理情況下的表達具有相關(guān)性[7, 8]，提示miR-214可能通過調(diào)控E2F3調(diào)控細胞的生物學(xué)行為。所以本研究將在此基礎(chǔ)上，探討miR-214在肝癌細胞株中的表達，及恢復(fù)其表達后對細胞的增殖、凋亡行為的影響及具體機制。

1 材料和方法

1.1 細胞株

人SK-Hep-1購于中國科學(xué)院細胞庫。人HepG2、SMCC-7721、Huh 7購于美國菌種保藏中心(ATCC)。

1.2 試劑及主要儀器

四唑鹽試劑(MTT)(美國Sigma公司)；兔抗E2F3、GAPDH單克隆抗體(美國Epitmics公司)；trizol試劑盒(美國Corning 公司)；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L)，Hoechst染色試劑盒，細胞周期檢測試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所)；胎牛血清，DMEM培養(yǎng)基，胰蛋白酶(Gibco公司)；結(jié)晶紫(Sigma公司)。CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(美國Thermo Scientific公司)；TS100倒置顯微鏡(日本Nikon公司)；FACS Calibur型流式細胞儀(美國BD 公司)；迷你雙垂直電泳儀，迷你轉(zhuǎn)印電泳儀，ChemiDocTM XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)。

1.3 miRNA合成、配制、存儲及轉(zhuǎn)染

在廣州市銳博生物科技有限公司訂購合成miR-214 mimic及對照mimic negative control(miR-214 NC)。合成樣品先離心，然后每5 nmol miRNA中加入250 μL DEPC水稀釋，配成20 μmol/L母液，分裝，-20℃保存?zhèn)溆?。轉(zhuǎn)染前1 d，在無雙抗培養(yǎng)基中接種細胞(6孔板，每孔加2000 μL，其他按比例增加或減少)，轉(zhuǎn)染時細胞的匯合度要達到50%；用適量無血清Opti-MEM? I培養(yǎng)基稀釋miRNA (250 μL)，輕輕混勻。搖勻Lipofectamine 2000，取適量用Opti-MEM? I稀釋并輕輕混勻后室溫孵育5 min。將稀釋的Lipofectamine 2000和稀釋的miRNA輕輕混合，室溫孵育(20～30) min；將miRNA/Lipofectamine 2000復(fù)合物加入6孔板，前后輕輕搖動混合；6 h以后換成含10%血清的DMEM培養(yǎng)基，于37℃，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，并用RT-PCR檢測miR-214的表達。

1.4 MTT檢測細胞活力

將處于生長對數(shù)期的HepG2細胞消化，細胞濃度調(diào)整為2×104個/ mL，接種于96孔板，每孔200 μL，轉(zhuǎn)染48 h后，加入20 μL終濃度為5 mg/mL的MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，加150 μL 二甲基亞砜，震蕩10 min，采用酶標儀于570 nm處測吸光度(A)值，每個實驗組三個平行復(fù)孔。

1.5 Hoechst染色檢測細胞凋亡

將處于生長對數(shù)期的HepG2細胞接種于6孔板，細胞濃度調(diào)整為1×104個/ mL，接種于6孔板，每孔1 mL，轉(zhuǎn)染48 h后，用不含EDTA的胰蛋白酶消化收集細胞，4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗滌3次，加入Hoechst 33258染色液避光染色15 min，PBS洗滌3次，在熒光顯微鏡下觀察并拍照。每個實驗組三個平行復(fù)孔。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞周期

將處于生長對數(shù)期的HepG2細胞接種于6孔板，細胞濃度調(diào)整為1×104個/ mL，接種于6孔板，每孔1 mL，轉(zhuǎn)染48 h后，按細胞周期檢測試劑盒說明書進行檢測：用不含EDTA的胰蛋白酶消化細胞，離心，并重懸，接著加入5 μL終濃度為10 mg/mL 的Rnase，37℃孵育1 h，再加入 碘化丙啶染液，室溫下避光染色 30 min，用流式細胞儀進行細胞周期檢測分析。每個實驗組三個平行復(fù)孔。

1.7 RT-PCR驗證miR-214在不同肝癌細胞株中的表達

參考trizol試劑盒使用說明書提取總RNA，并用微量紫外分光光度計檢測RNA的純度，通過一步法RT-PCR試劑盒將逆轉(zhuǎn)錄RNA，并進行PCR擴增，最后將擴增產(chǎn)物用于2%的瓊脂糖膠電泳。引物分別加入25 μL PCR反應(yīng)體系中，反應(yīng)條件為94℃變性45 s，59℃復(fù)性45 s，72℃延伸60 s，共35個循環(huán)。miR-214上游引物：5’-GGACAGGACGCACAGTCA-3’，下游引物：5’- CAGACGAGGCTCCGTGGT-3’，E2F3上游引物：5’- AGAAAGCGGTCAATCAGTACCT-3’，下游引物：5’- TGGACTTCGTAGTGCAGCTCT-3’，GAPDH上游引物：5’-AGCCACATCGCTCAGACA-3’，下游引物：5’- TGGACTCCACGACGTACT-3’。

1.8 Western blot檢測E2F3的表達

將處于生長對數(shù)期的HepG2細胞接種于6孔板，細胞濃度調(diào)整為1×104個/ mL，接種于6孔板，每孔1 mL，轉(zhuǎn)染48 h后，刮下細胞，離心，后加入適量的RIPA裂解液，裂解30 min，離心，小心吸取上清液，即可獲得總蛋白。根據(jù)BCA試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳，后濕法轉(zhuǎn)膜30 min左右。將膜浸入一抗溶液(兔抗E2F3，GAPDH單克隆抗體，稀釋度1:100)孵育，4℃過夜；次日二抗溶液(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG(H+L))中室溫孵育1～2 h。將膜取出漂洗，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。用“Quantity one”軟件統(tǒng)計分析各抗體條帶灰度值。每個實驗組三個平行復(fù)孔。

1.9 熒光素酶報告基因表達分析

miR-214及E2F3重組載體共轉(zhuǎn)染到HepG2細胞中。分組如下： miR-214 mimics+Wt E2F3，miR-214 NC+ Wt E2F3，miR-214 mimics+Mut E2F3，miR-214 NC+ Mut E2F3。應(yīng)用雙熒光素酶檢測系統(tǒng)檢測轉(zhuǎn)染好的熒光素酶活性，計算公式：相對熒光值=螢火蟲熒光素酶熒光值/海腎熒光素酶熒光值。每個實驗組三個平行復(fù)孔。

1.10 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四株肝癌細胞中miR-214的表達情況

如圖1，RT-PCR結(jié)果顯示，miR-214在SMMC-7721、SK-Hep-1、Huh 7及HepG2細胞中的表達情況分別為(0.83±0.08)，(0.32±0.03)，(0.33±0.03)，(0.08±0.01)，其中HepG2中miR-214表達量最低，因此選用HepG2作為后續(xù)實驗細胞株。

2.2 miR-214 mimics對HepG2肝癌細胞中miR-214表達量的影響

如圖2所示，RT-PCR結(jié)果顯示，miR-214 NC及miR-214 mimics在HepG2細胞中的表達量分別為(0.14±0.01)，(0.65±0.06)，二者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.3 miR-214 mimics對肝癌細胞活力的影響

HepG2細胞轉(zhuǎn)染miR-214 NC及miR-214 mimics，經(jīng)MTT實驗發(fā)現(xiàn)，二者細胞活力分別為為(0.69±0.06)，(0.35±0.03)，二者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 miR-214 mimics對肝癌細胞凋亡情況的影響

如圖3所示，HepG2細胞轉(zhuǎn)染miR-214 NC及miR-214 mimics，經(jīng)annexin V/PI流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，二者細胞凋亡率分別為(3.74±0.34)%，(36.37±3.43)%，二者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.5 miR-214對肝癌細胞周期的影響

如圖4所示，HepG2細胞轉(zhuǎn)染miR-214 NC及miR-214 mimics，二者G1期細胞數(shù)目分別為(45.319±4.53)，(57.79±5.78)，二者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.6 miR-214對HepG2肝癌細胞中E2F3表達量的影響

如圖5所示，HepG2細胞轉(zhuǎn)染miR-214 NC及miR-214 mimics，二者細胞中E2F3的mRNA及蛋白表達量分別為(0.98±0.09)，(0.24±0.02)及(0.99±0.10)，(0.23±0.02)，二者比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.7 熒光素酶報告基因表達分析

將miR-214 mimics、miR-214 NC及野生型載體pMir E2F3 3’UTR-Wt、及突變型載體pMir E2F3 3’UTR-Mut轉(zhuǎn)入HepG2細胞中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-214 mimics與野生型載體pMir E2F3 3’UTR-Wt共轉(zhuǎn)染組的熒光信號強度明顯弱于其它轉(zhuǎn)染組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。而對于突變型載體pMir E2F3 3’UTR-Mut來說，各組間熒光強度無任何差別(P>0.05)，說明E2F3是miR-214下游靶基因。見圖6。

3 討論

原發(fā)性肝癌在惡性腫瘤發(fā)病中居世界前五，也是世界第三大致死性癌癥[1, 2]。研究表明，在各種病理、生理過程，包括癌癥過程中，許多miRNAs異常表達[3]。miRNAs作為一類新型的調(diào)節(jié)因子，既可以作為原癌基因發(fā)揮作用，也可以作為抑癌基因進而調(diào)節(jié)細胞的生物學(xué)特性[3]。miR-214是在小鼠，大鼠及雞等種屬中高度保守的非編碼RNA分子，位于染色體1q24.3。最初把miRNAs和癌癥聯(lián)系在一起是在慢性淋巴細胞白血病的研究中，研究發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)的這類病人中miR-15a和miR-214-1的表達是下調(diào)或是缺失的[9]。后續(xù)miRNA微陣列進一步的證實肝癌組織中miR-214的表達低于癌旁組織[4]。提示miR-214在肝癌組織中是作為抑癌基因存在的，并參與肝癌的發(fā)生發(fā)展過程。因此本研究在此基礎(chǔ)上首先通過RT-PCR法檢測4株肝癌細胞株SMMC-7721、SK-Hep-1、Huh 7及HepG2中miR-214的表達，結(jié)果表明miR-214在HepG2的表達量最低，因而選為后續(xù)實驗細胞株。接著通過RT-PCR法證實了miR-214 NC及miR-214 mimics成功轉(zhuǎn)染HepG2細胞。所以進一步采用MTT法，Hoecsht染色法檢測miR-214 mimics對HepG2細胞活力及凋亡情況的影響，結(jié)果表明miR-214 mimics能顯著的降低細胞活力，并提高細胞凋亡率，與Xu等[5]在骨肉瘤細胞，Yang等[6]在胃癌細胞株的研究結(jié)果一致，從而說明恢復(fù)miR-214的表達能顯著的抑制HepG2的增殖，并誘導(dǎo)細胞凋亡。而腫瘤細胞的不可控制的生長增殖源于細胞周期的紊亂，其中細胞周期一般分為G1、G2/M及S期，且G1期及G2期是多數(shù)抗癌藥物作用腫瘤細胞的靶點[10]。miR-214能夠通過調(diào)控細胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1，CDK3及CDK6的表達，從而使細胞周期阻滯于G1期，最后使肝癌細胞DNA復(fù)制及有絲分裂阻斷，最終導(dǎo)致細胞增殖受阻[11, 12]。所以本研究采用流式細胞術(shù)檢測miR-214 mimics對HepG2細胞周期的影響，結(jié)果與上述報道一致[11, 12]，miR-214 mimics能顯著的延長HepG2細胞的G1期，使細胞周期阻滯于G1期，最終導(dǎo)致細胞增殖阻斷。

注：1：miR-214 NC；2：miR-214 mimics圖5 miR-214 mimics對HepG2肝癌細胞中E2F3表達量的影響Fig.5 Effect of miR-214 mimics on expression of E2F3 in the HepG2 cells

注：1：SMMC-7721；2：SK-Hep-1；3：Huh 7；4：HepG2圖1 四株肝癌細胞中miR-214的表達情況Fig.1 Expression of miR-214 in the four hepatocellular carcinoma cells

注：1：miR-214 NC；2：miR-214 mimics圖2 miR-214 mimics對HepG2肝癌細胞中miR-214表達量的影響Fig.2 Effect of miR-214 mimics on expression of miR-214 in the HepG2 cells

注：1：miR-214 NC；2：miR-214 mimics圖3 miR-214 mimics對HepG2肝癌細胞凋亡情況的影響(×200)Fig.3 Effect of miR-214 mimics on cell apoptosis in the HepG2 cells

注：1：miR-214 NC；2：miR-214 mimics圖4 miR-214 mimics對HepG2肝癌細胞周期的影響Fig.4 Effect of miR-214 mimics on cell cycle in the HepG2 cells

1：pMir E2F3 3’UTR-Wt；2：pMir E2F3 3’UTR-Mut圖6 熒光素酶報告基因表達分析Fig.6 Luciferase reporter gene expression analysis與miR-214 NC比較，**P<0.01Compared with the miR-214 NC,**P<0.01

miRNAs對腫瘤細胞生物學(xué)行為的影響，一般是通過調(diào)控靶蛋白表達量來實現(xiàn)的，有報道證實1/3蛋白的轉(zhuǎn)錄表達是由miRNAs所調(diào)控的[13]。E2F家族最初是在腺病毒E2基因的研究中發(fā)現(xiàn)的，后面陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了8個的E2F家族成員，這8個E2F家族成員，由于結(jié)構(gòu)上的差異，導(dǎo)致了功能上的不同。其中E2F3屬于激活的亞群，能夠促使靜息細胞快速的從G1期進入S期，在細胞的增殖與凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用。同時研究已經(jīng)顯示E2F3在肝癌組織中高表達，且通過下調(diào)E2F3表達，能促使肝癌細胞周期阻滯在G1期[8, 14]。另外研究已經(jīng)表明miR-214與E2F3在多種病理過程中的表達量具有相關(guān)性，且有研究也發(fā)現(xiàn)E2F3是miR-214的靶基因[14, 15]。所以本研究利用熒光素酶報告基因檢測E2F3是否是miR-214的靶基因，結(jié)果表明野生型的E2F3活性被miR-214 mimics顯著下調(diào)，提示E2F3是miR-214的靶基因，接著采用western blot檢測miR-214 mimics對E2F3蛋白及mRNA表達量的影響，結(jié)果表明miR-214 mimics能顯著的降低E2F3蛋白及mRNA的表達，進一步的證實了E2F3確實是miR-214的靶基因。

綜上所述，提高肝癌細胞HepG2中miR-214的表達，能顯著的降低細胞活力，提高細胞凋亡率，并使細胞周期阻滯在G1期，同時能夠靶向的下調(diào)E2F3表達。

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Inhibition of the proliferation of hepatocellular carcinoma cells by miR-214 via regulation of E2F3 expression

DU Zhao-yang, YANG Ru-yu, LI Chao, DUAN Li-juan

(Department of Hematology, Nanyang Central Hospital, Nanyang, Henan Province 473001, China)

Objective To explore the effect of inhibition of miR-214 expression on the proliferation of hepatocellular carcinoma cells via regulation of E2F3 expression. Methods The expression of miR-214 in SMMC-7721, HepG2, SK-Hep-1 and Huh 7 cells was examined by RT-PCR. Hepatocellular carcinoma cells were transfected with miR-214 NC and miR-214 mimics with liposomes. The expression of miR-214 was detected by RT-PCR. The cell viability was detected by MTT assay. Cell apoptosis was detected by Hoechst staining. Cell cycle was detected by flow cytometry. Western blot, RT-PCR and dual luciferase reporter gene assay were used to detect whether E2F3 was a downstream target gene of miR-214. Results The expression of miR-214 in SMMC-7721, HepG2, SK-Hep-1 and Huh 7 cells was 0.83±0.08, 0.32±0.03, 0.33±0.03, and 0.08±0.01, respectively. The expression of miR-214 in the HepG2 cells was the lowest, so HepG2 cells were selected as the subsequent experimental cell line. Compared with the miR-214 NC group, the expression of miR-214 (0.65±0.06 vs. 0.14±0.01) was up-regulated, the cell viability (0.35±0.03 vs. 0.69±0.06) was decreased, cell apoptosis rate [(36.37±3.43)% vs. (3.74±0.34)%] was increased, the G1 phase of the cell cycle (57.79±5.78 vs. 45.319±4.53) was prolonged, the expression of E2F3 protein (0.23±0.02 vs. 0.98±0.09) and mRNA (0.24±0.02 vs. 0.99±0.10) was significantly down-regulated in the miR-214 mimics group (P<0.01). Conclusion miR-214 mimics suppress the HepG2 cell proliferation via targeted down-regulation of E2F3 expression.

miR-214; Hepatocellular carcinoma; E2F3; Proliferation

杜朝陽(1974-)，女，主治醫(yī)師，主要研究方向：血液內(nèi)科E-mail： doctor681@163.com。

研究報告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0027-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.006

2016-10-26