韋榮飛，李夢(mèng)媛，徐大模，高 苒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

鼠傷寒沙門(mén)氏菌S.Typhimurium感染C57BL/6小鼠腸道模型的建立及表型分析

韋榮飛，李夢(mèng)媛，徐大模，高 苒

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院比較醫(yī)學(xué)中心，北京 100021)

目的 建立鼠傷寒沙門(mén)氏菌S.Typhimurium感染C57BL/6小鼠腸道模型。方法 先用5% NaHCO3溶液灌胃，中和部分胃酸，提高鼠傷寒沙門(mén)氏菌S.Typhimurium的感染能力，隨后進(jìn)行鼠傷寒沙門(mén)氏菌S.Typhimurium灌胃攻毒。觀察小鼠的臨床癥狀，對(duì)小鼠的生存情況及體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并通過(guò)組織病理切片分析小鼠腸道組織病理變化等。結(jié)果 鼠傷寒沙門(mén)氏菌S.Typhimurium攻毒后C57BL/6小鼠出現(xiàn)體重下降、萎靡不振、寒顫及死亡等表型，解剖學(xué)水平顯示小鼠腸道充血膨脹。病理分析結(jié)果顯示小鼠小腸絨毛間質(zhì)水腫、腸粘膜層壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等。結(jié)論 成功建立鼠傷寒沙門(mén)氏菌S.Typhimurium感染C57BL/6小鼠腸道模型，該模型在研究相關(guān)免疫分子或細(xì)胞因子在S.Typhimurium引發(fā)腸炎過(guò)程中的生物學(xué)功能及治療等方面具有重要的科學(xué)意義。

腸道感染；S.Typhimurium；C57BL/6；組織病理

鼠傷寒沙門(mén)氏菌是一種能夠感染多種宿主的革蘭氏陰性病原體，能夠躲避宿主的天然免疫系統(tǒng)，在宿主體內(nèi)進(jìn)行復(fù)制并引發(fā)疾病[1]。鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染畜禽造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康，沙門(mén)氏菌是經(jīng)食物傳播的疾病中主要的病原菌。鼠傷寒沙門(mén)氏菌S.Typhimurium與沙門(mén)氏菌Paratyphi感染人類(lèi)的途徑相似，S.Typhimurium感染能夠引起急性腸胃炎。目前，對(duì)于鼠傷寒沙門(mén)氏菌引發(fā)腸炎的發(fā)病機(jī)制及免疫、病理生理特征等方面的研究尚淺，需要構(gòu)建合適的小鼠模型進(jìn)行深入研究。然而，鼠傷寒沙門(mén)氏菌入侵小鼠體內(nèi)后可造成類(lèi)似人類(lèi)傷寒樣全身系統(tǒng)性感染，因此，構(gòu)建鼠傷寒沙門(mén)氏菌急性感染模型將為研究沙門(mén)氏菌感染疾病的發(fā)病機(jī)制等提供便利。前期已有報(bào)道基于使用鏈霉素預(yù)處理方法建立鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染小鼠模型[2]，然而模型建立時(shí)間較長(zhǎng)，容易導(dǎo)致腸道免疫系統(tǒng)損傷而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。本研究利用5% NaHCO3溶液灌胃中和胃酸從而減少胃酸對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌的影響，避免對(duì)腸道免疫系統(tǒng)的影響，同時(shí)增加了鼠傷寒沙門(mén)氏菌的感染活性，且有效縮短了建模周期。

利用S.Typhimurium建立C57BL/6小鼠腸道感染模型對(duì)于研究沙門(mén)氏菌病原體入侵宿主的作用機(jī)制和疾病治療，以及相關(guān)免疫調(diào)控分子在沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中的免疫學(xué)功能及其C57BL/6轉(zhuǎn)基因小鼠在沙門(mén)氏菌感染引發(fā)疾病過(guò)程中的病理變化分析等具有重要的科學(xué)意義，同時(shí)也為抗沙門(mén)氏菌感染藥物的臨床前試驗(yàn)提供保障[3-6]。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及菌種：SPF級(jí)C57BL/6小鼠，6～8周齡，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司【SCXK(京)2014-0004】，飼養(yǎng)于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK(京)2014-002】。鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonella typhimurium，S.Typhimurium)標(biāo)準(zhǔn)菌種為英國(guó)格拉斯哥大學(xué)惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑：胰蛋白胨、酵母提取物、瓊脂購(gòu)自英國(guó)Oxiod公司，NaCl、NaHCO3購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；蘇木精、伊紅購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；PCNA抗體購(gòu)自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng)：鼠傷寒沙門(mén)氏菌劃線(xiàn)接種于固體無(wú)抗LB平板，37℃，過(guò)夜培養(yǎng)。隨后挑取單菌落培養(yǎng)于無(wú)抗液體LB培養(yǎng)基，37℃，過(guò)夜靜置培養(yǎng)，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，5 000 r/min，10 min，離心收集菌體，用PBS緩沖液調(diào)節(jié)濃度至108cfu/mL，用于小鼠攻毒。

1.2.2 鼠傷寒沙門(mén)氏菌S.Typhimurium感染小鼠模型的建立: PBS組和實(shí)驗(yàn)組各9只C57BL/6小鼠，鼠傷寒沙門(mén)氏菌攻毒前，每只小鼠灌胃5% NaHCO3溶液100 μL，中和胃酸后，采用PBS緩沖液調(diào)節(jié)濃度至108cfu/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌，每只小鼠灌胃200 μL，對(duì)照組小鼠給予相同體積5% 的NaHCO3溶液和PBS緩沖液。正常條件飼養(yǎng)小鼠8 d。本研究相關(guān)實(shí)驗(yàn)均在生物安全2級(jí)(P2，BSL-2)實(shí)驗(yàn)室開(kāi)展，IACUC批準(zhǔn)號(hào)GR2016001。

1.2.3 動(dòng)物表型分析：鼠傷寒沙門(mén)氏菌灌胃時(shí)(即0 d)和3 d后每天稱(chēng)量小鼠體重并觀察小鼠的臨床癥狀和死亡情況。并解剖瀕臨死亡小鼠，觀察腸道病理形態(tài)，并進(jìn)行石蠟切片和病理分析。

1.2.4 石蠟切片:組織固定：4%甲醛溶液固定48 h以上；酒精梯度脫水：70%、80%、90% Ⅰ、90% Ⅱ、95% Ⅰ、95% Ⅱ各20 min，100% Ⅰ、100% Ⅱ各15 min；透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min；浸蠟：蠟缸Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各30 min；包埋：用包埋機(jī)操作，將組織包埋于蠟中，制成蠟塊；切片：調(diào)整適當(dāng)厚度(5 μm)，切片機(jī)切片；經(jīng)攤片機(jī)攤片，后經(jīng)烤片機(jī)烤片，制成白片。

1.2.5 免疫組化:白片脫蠟：將白片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min；復(fù)水：100% Ⅰ、100% Ⅱ、95%、90%、80%、75%的酒精各放8 min；雙蒸水洗滌3次，每次2 min；3%的雙氧水去除內(nèi)源過(guò)氧化物酶15 min，注意避光；PBS洗3次，每次2 min；抗原修復(fù)：微波爐中高火將檸檬酸鹽修復(fù)液煮沸，將片子浸入煮沸的檸檬酸鹽修復(fù)液中，小火13 min，完畢后自然冷卻至室溫；蒸餾水洗1次，PBS洗3次，每次3 min；37℃，10%山羊血清封閉30 min；甩掉山羊血清，加PBS配制的PCNA抗體，4℃過(guò)夜；PBS洗3次，每次3 min；加二抗輔助劑，37℃，30 min；PBS洗3次，每次3 min；加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37℃，30 min；PBS洗3次，每次3 min；DAB顯色，鏡下觀察；蒸餾水沖洗，蘇木素染核10～30 s，自來(lái)水沖洗2 min，酒精鹽酸分化5 s，自來(lái)水沖洗；脫水：70%、75%、80%、90%、95%、100%各2 min；透明：二甲苯Ⅰ、Ⅱ各4 min；中性樹(shù)脂封片。

1.2.6 HE染色:按照免疫組化復(fù)水步驟將白片進(jìn)行復(fù)水；雙蒸水洗滌3次，每次2 min；蘇木素染色2 min；自來(lái)水洗2 min；酒精鹽酸分化10 s；自來(lái)水洗2 min；伊紅染色2 min；自來(lái)水洗2 min；90%酒精1 min；100%酒精1 min；二甲苯I、II各4 min；中性樹(shù)脂封片。

2 結(jié)果

2.1 鼠沙門(mén)氏菌感染降低C57BL/6小鼠的生存率

200 μL濃度為107cfu/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌攻擊C57BL/6小鼠3 d后，小鼠開(kāi)始出現(xiàn)明顯的臨床癥狀，主要表現(xiàn)為萎靡不振、寒顫、被毛粗亂等；感染第4天，小鼠開(kāi)始出現(xiàn)死亡，且8 d內(nèi)全部死亡(圖1)。對(duì)照組未見(jiàn)任何異常。

圖1 鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染降低C57BL/6小鼠的生存率Fig.1 S. Typhimurium decreased the survival rate of the S. Typhimurium-uinfected C57BL/6 mice

2.2 鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染導(dǎo)致C57BL/6小鼠的體重減少

從鼠傷寒沙門(mén)氏菌攻擊C57BL/6小鼠開(kāi)始(第0天)直至第7天，對(duì)小鼠的體重進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果如圖2所示，對(duì)照組在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中體重呈增加趨勢(shì)，而鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染組小鼠體重逐漸減少。

圖2 鼠傷寒沙門(mén)氏菌攻擊C57BL/6小鼠后小鼠的體重隨時(shí)間而減輕Fig.2 Loss of body weight of the S. Typhimurium-infected mice

2.3 病理形態(tài)分析結(jié)果

鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染C57BL/6小鼠4或7 d后處死小鼠，體外分離小腸，觀察其形態(tài)變化，并對(duì)小腸進(jìn)行石蠟切片和HE染色。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染后，腸道出現(xiàn)明顯的充血膨脹(圖3A)。與對(duì)照組相比(圖3B)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染C57BL/6小鼠7 d后，小鼠小腸呈現(xiàn)明顯的局部腸粘膜層壞死(圖3C)，且腸絨毛間質(zhì)水腫嚴(yán)重(圖3C和D)。此外，腸粘膜固有層炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及小腸腺上皮細(xì)胞點(diǎn)狀壞死等(圖3E)。

2.4 小鼠腸道細(xì)胞增殖檢測(cè)

利用PCNA抗體檢測(cè)鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染C57BL/6小鼠后小腸腺上皮細(xì)胞的增殖情況。結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比(圖4A)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染4 d后，小鼠小腸腺上皮細(xì)胞增殖明顯減少

注： A:S. Typhimurium感染4 d后小腸病理形態(tài)觀察；B:對(duì)照組(100×)；C和D:鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染7 d(100×)；E圖為鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染4 d(400×)，紅色箭頭指示炎性細(xì)胞。圖3 鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染C57BL/6小鼠后小腸組織學(xué)及病理學(xué)分析結(jié)果Note. A. Small intestine of a normal control mouse (upper) and a mouse at 4 days after S. Typhimurium infection (lower). B. Histological changes in the intestine of a normal control mouse, ×100); C and D indicate the histological changes in the intestine of mice at 7 days after S. Typhimurium infection, ×100; E. indicates histological changes in the intestine of a mouse at 4 days after S. Typhimurium infection. The red arrows indicate inflammatory cell infiltration. ×400.Fig.3 Pathological changes in the intestine of S. Typhimurium-infected mice. HE staining 。

注： A圖為對(duì)照組(400×)；B圖為鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染4 d(400×)。圖4 鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染C57BL/6小鼠后小腸腺上皮細(xì)胞增殖減少Note. A: A control mouse. B: A mouse at 4 days after S. Typhimurium infection. Immunohistochemical staining with PCNA antibody. ×400.Fig.4 Proliferation of intestinal glandular epithelial cells is reduced in the C57BL/6 mice after S. Typhimurium infection.

3 討論

鼠傷寒沙門(mén)氏菌具有沙門(mén)氏菌的普遍特性，能夠引起諸多宿主特異性的感染性疾病，包括感染小鼠導(dǎo)致類(lèi)似人類(lèi)傷寒的系統(tǒng)性疾病[7]。鼠傷寒沙門(mén)氏菌是對(duì)人類(lèi)健康產(chǎn)生威脅的重要傳染病源，其感染引起的沙門(mén)氏菌病對(duì)于人畜共患病的研究具有重要的意義[8]。

為更好地研究鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染引起的疾病及后續(xù)研究相關(guān)免疫分子在沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中的免疫學(xué)功能，我們成功構(gòu)建了鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染C57BL/6小鼠模型。為提高C57BL/6小鼠對(duì)鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染的敏感性，鼠傷寒沙門(mén)氏菌攻毒前，先對(duì)小鼠進(jìn)行5% NaHCO3溶液灌胃處理，中和部分胃酸。隨后，每只小鼠灌胃107cfu/mL的鼠傷寒沙門(mén)氏菌200 μL。統(tǒng)計(jì)分析小鼠的生存情況及體重變化情況。病理分析小腸組織結(jié)構(gòu)變化及免疫組化分析小腸細(xì)胞增殖情況。我們發(fā)現(xiàn)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染后，C57BL/6小鼠萎靡嗜睡，第4天開(kāi)始出現(xiàn)死亡，且8 d內(nèi)全部死亡；小鼠體重逐漸減少；小腸絨毛間質(zhì)水腫、腸粘膜層壞死及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；小腸腺上皮細(xì)胞增殖減少等。該模型可為臨床研究奠定基礎(chǔ)，同時(shí)，該模型也可用于抗沙門(mén)氏菌藥物臨床前試驗(yàn)藥效評(píng)價(jià)等。此外，本研究為基于相關(guān)免疫分子C57BL/6基因敲除或轉(zhuǎn)基因小鼠建立鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染模型奠定了重要的基礎(chǔ)，對(duì)于研究相關(guān)免疫分子在鼠傷寒沙門(mén)氏菌感染過(guò)程中發(fā)揮的免疫生物學(xué)功能具有重要的科學(xué)意義和價(jià)值。

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Etablishment and phenotypic analysis of a C57BL/6 mouse model ofS.Typhimuriuminfection

WEI Rong-fei, LI Meng-yuan, XU Da-mo, GAO Ran

( Institute of Laboratory Animal Science, Chinese Academy of Medical Sciences & Comparative Medical Center, Peking Union Medical College, Beijing 100021，China)

Objective To establish a C57BL/6 mouse model of intestinal infection induced byS.Typhimurium. Methods In order to improve the infectious sensitivity ofS.Typhimurium, C57BL/6 mice were intragastrically given 5% (w/v) NaHCO3.Then mice were challenged withS.Typhimurium. The health condition, survival and body weight of mice were observed from day 0 to day 7 after the bacterial infection. The pathological changes were also examined. Results the mice challenged withS.Typhimuriumshowed decreased body weight and typical clinical signs, including in appetence, piloerection and low survival rate. Macroscopic dissection revealed that intestinal hyperemia and swelling were founded in the mice challenged withS.Typhimurium. Histopathology showed intestinal epithelial and mucosal damages. Conclusions We have successfully established a C57BL/6 mouse model ofS.Typhimuriuminfection. This model may be of crucial significance for studying the biological functions of associated immunological molecules or cytokines in the process of inflammatory bowel disease induced byS.Typhimurium.

Intestinal infection;S.Typhimurium; C57BL/6 mouse; Histopathology

國(guó)家自然科學(xué)基金(81601375)，協(xié)和青年基金資助，中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資金資助(3332016077)，中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專(zhuān)項(xiàng)資助(2016ZX310033)。

韋榮飛(1990-)，女，助理研究員，研究方向：免疫與腫瘤。E-mail: weirongfei2010@163.com。

高苒(1980-)，女，副研究員，研究方向：腫瘤學(xué)、免疫學(xué)。E-mail: gaoran26@Hotmail.com。

研究報(bào)告

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】 A 【文章編號(hào)】1671-7856(2017) 06-0033-04

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.007

2017-02-15