孫 虎， 張 亮， 徐志新

(1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科， 海口 570311；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院麻醉科， 廣州 511447)

右美托咪定鞘內(nèi)注射對(duì)慢性神經(jīng)痛模型大鼠行為能力、疼痛程度和脊髓背角蛋白激酶C表達(dá)的影響

孫 虎1， 張 亮2， 徐志新1

(1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院麻醉科， 海口 570311；2. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院麻醉科， 廣州 511447)

目的 分析右美托咪定鞘內(nèi)注射對(duì)于慢性神經(jīng)痛模型鼠的行為、疼痛程度脊髓背角蛋白激酶C (protein kinase C，即PKC)的影響，初步探討右美托咪定的鎮(zhèn)痛機(jī)制。方法 將50只成功建立模型的大鼠隨機(jī)分為觀察組、模型組，另選取25只健康大鼠作為對(duì)照組，觀察組和模型組大鼠建立慢性坐骨神經(jīng)損傷模型，在建模后，觀察組應(yīng)用右美托咪定鞘內(nèi)注射干預(yù)，模型組應(yīng)用生理鹽水注射，對(duì)照組不接受干預(yù)，在建模前、給藥后3、5、7、14 d時(shí)分別進(jìn)行行為能力評(píng)價(jià)(累積評(píng)分法和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià))和疼痛程度評(píng)價(jià) (機(jī)械性縮足反射法和熱縮足反射潛伏期法檢測(cè)痛閾值)，同時(shí)進(jìn)行PKC免疫染色評(píng)分 (免疫組化SABC法)、PKCmRNA檢測(cè)(RT-PCR法)和PKC蛋白(Western blot法)表達(dá)，利用統(tǒng)計(jì)方法分析組間數(shù)據(jù)。結(jié)果 (1)建模前，各組大鼠行為累積評(píng)分、運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、機(jī)械性縮足反射法(MWT)、熱縮足反射潛伏期法(TWL)差異無(wú)顯著性 (P>0.05)，在建模后，模型組和觀察組大鼠累積評(píng)分和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分顯著升高，MWT和TWL明顯下降，其中觀察組變化幅度顯著低于模型組，建模后，組間累積評(píng)分、運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、MWT、TWL具有明顯差異(P<0.05)；(2)對(duì)照組PKC為陰性表達(dá)，模型組PKC呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，觀察組建模后初期PKC為強(qiáng)陽(yáng)性，隨著治療時(shí)間延長(zhǎng)，PKC表達(dá)強(qiáng)度降低，第14天時(shí)PKC為弱陽(yáng)性表達(dá)；(3)建模后，觀察組和模型組PKCmRNA和PKC蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組 (P<0.05)；隨著不斷給藥，觀察組PKCmRNA和PKC下降，在給藥14 d時(shí)，PKCmRNA和PKC接近對(duì)照組，建模后3 d起，在相同時(shí)間點(diǎn)，觀察組PKC表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)。結(jié)論 右美托咪定鞘內(nèi)注射能夠改善慢性神經(jīng)痛模型大鼠行為能力、降低疼痛程度，可能與其抑制脊髓背角蛋白激酶 C 的表達(dá)相關(guān)。

鞘內(nèi)注射；右美托咪定；慢性神經(jīng)痛；脊髓背角蛋白激酶C

脊髓背角蛋白激酶C(protein kinase C)(PKC)作為細(xì)胞內(nèi)重要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，在細(xì)胞中分布極為廣泛，由于組成PKC的同工酶在生物學(xué)功能有一定的差異性，因此，PKC的生物學(xué)功能極為復(fù)雜。近年來(lái)，隨著PKC研究的不斷深入，普遍認(rèn)為[1，2]PKC可能與機(jī)體痛敏具有一定關(guān)聯(lián)，其能夠通過干預(yù)激素表達(dá)、調(diào)節(jié)傳到疼痛活性參與疼痛發(fā)病機(jī)制。右美托咪啶作為新型鎮(zhèn)痛藥物，臨床實(shí)踐雖然證實(shí)了其對(duì)于慢性神經(jīng)痛具有高效鎮(zhèn)痛效果，但是相關(guān)作用機(jī)制的研究卻十分少見。因此，本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)不同干預(yù)下慢性神經(jīng)痛模型大鼠的行為能力、痛閾值、PKC表達(dá)進(jìn)行觀察分析，旨在初步確定右美托咪定的鎮(zhèn)痛機(jī)制及其對(duì)PKC的干預(yù)效果。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和分組

選取健康清潔級(jí)成年雄性SD大鼠，體重(200～250)g，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)【SCXK(粵)2013-0034】，使用許可證號(hào)【SYXK(粵)2010-0104】，適應(yīng)性飼養(yǎng)(自由進(jìn)食、溫度22℃～25℃，濕度55%左右，晝夜比為1∶1) 7 d后，根據(jù)隨機(jī)原則，選取25只正常對(duì)照組不接受任何干預(yù)，在建模后將建模成功大鼠隨機(jī)選取50只分為2組，每組各25只，模型組和觀察組均需建立慢性神經(jīng)痛模型并在建模后給予相應(yīng)干預(yù)措施。各組間在鼠齡、體質(zhì)量、飼養(yǎng)條件方面均無(wú)明顯差異(P>0.05)。

1.2 主要試劑和儀器

Invitrogen公司生產(chǎn)的Trizol試劑；Takara 公司生產(chǎn)的SYB PremixTMII 試劑盒、購(gòu)自于北京海誠(chéng)遠(yuǎn)宏公司的RIPA蛋白裂解液；美國(guó)Sigma公司生產(chǎn)的PKC 單克隆抗體(一抗和二抗)；購(gòu)自于天津?yàn)蠊镜拿庖呓M化LAB-SA試劑盒和DAB顯色劑(濃縮型); 意大利IITC Life Science Inc 公司制造的l2390 Series von Frey測(cè)痛儀；中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院設(shè)計(jì)制造的熱痛刺激儀(型號(hào)為BME-410A)；萊比信生物技術(shù)公司制造的石蠟切片機(jī)；GAPDH 內(nèi)參和正反向引物序列合成由上海生工生物工程公司完成。

1.3 建立慢性神經(jīng)痛模型

依據(jù)臨床公認(rèn)的Bennet法[3]建立慢性神經(jīng)痛動(dòng)物模型，具體步驟如下：經(jīng)腹腔注射戊巴比妥鈉 (劑量為40 mg/kg)，麻醉起效后，以側(cè)臥位(術(shù)側(cè)在上)固定SD大鼠，常規(guī)消毒術(shù)區(qū)，距離股骨下1 cm處沿著股骨走形切開皮膚，通過股二頭肌的肌肉間隙對(duì)肌組織進(jìn)行鈍性分離以充分顯露術(shù)側(cè)坐骨神經(jīng)，用玻璃鉤針緩慢、輕輕的分離將坐骨神經(jīng)和周圍組織， 將坐骨神經(jīng)主干分叉部位以前神經(jīng)游離8 mm，并在神經(jīng)起始點(diǎn)上2 mm位置利用 含鉻羊腸線將坐骨神經(jīng)結(jié)扎(4道，每道相隔1 mm)，局部注射生理鹽水沖洗，將肌肉、筋膜、皮下組織、皮膚進(jìn)行間斷縫合。為了避免人為因素感染，所有上述操作均由研究者一人獨(dú)立完成。實(shí)驗(yàn)以小鼠出現(xiàn)縮足、舔尾等行為學(xué)疼痛陽(yáng)性反應(yīng)為建模成功標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 鞘內(nèi)注射

參照張世棟等[4]記錄的鞘內(nèi)注射給藥方法對(duì)慢性神經(jīng)痛模型大鼠進(jìn)行鞘內(nèi)置管給藥，所有建模成功的大鼠，在建模后2 h以吸入異氟烷麻醉滿意后，呈俯臥位擺放，觸摸到兩側(cè)髂棘，對(duì)術(shù)區(qū)進(jìn)行備皮和消毒，選取L3與L4間隙作為切口位置，縱形切口長(zhǎng)度為3 cm左右，鈍性分離肌肉組織，顯露示L3-L4的脊突間隙，利用25G 針刺穿黃韌帶和硬脊膜，待清亮液體(即腦脊液)流出后視為穿刺成功。將導(dǎo)管經(jīng)硬脊膜口緩慢插入8 cm左右，將開口端固定在L1-L2，另一端經(jīng)皮下隧道在頸背部引出，在外露出2 cm后將導(dǎo)管口夾閉并固定。待大鼠麻醉失效后，微量注射10 μL利多卡因，以10 s內(nèi)雙肢出現(xiàn)無(wú)法負(fù)重、無(wú)逃避反應(yīng)且在20 min可恢復(fù)為實(shí)驗(yàn)成功。本實(shí)驗(yàn)中未見脫管情況出現(xiàn)。

1.5 觀察指標(biāo)及評(píng)價(jià)方法

在建模前、給藥后3 d、5 d、7 d、14 d時(shí)分別對(duì)各組SD大鼠的行為學(xué)效應(yīng)進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)在各時(shí)間點(diǎn)每組分別處死5大鼠，進(jìn)行PKC表達(dá)水平測(cè)定。

1.5.1 行為學(xué)能力評(píng)分：行為能力評(píng)價(jià)采用累積評(píng)分法(Cumulative scoring)和運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分(Motor function score)進(jìn)行。累積評(píng)分具體方法[5]為：根據(jù)大鼠的后爪著地和負(fù)重水平進(jìn)行計(jì)分，其中后爪壓迫變白代表負(fù)重，采取0-2計(jì)分法，2分為后爪不著地且不負(fù)重；1分為后爪不負(fù)重但可著地；0分為后爪著地且負(fù)重，每5 min評(píng)鑒一次，將1 h內(nèi)術(shù)側(cè)和檢測(cè)累積分?jǐn)?shù)差即為最后的累積疼痛評(píng)分。運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分依照Hwang法[6]： 0分為運(yùn)動(dòng)功能無(wú)改變，可以正常行走；1分為運(yùn)動(dòng)輕度受限，足底刺激可出現(xiàn)正?？s爪反應(yīng)；2分為自主運(yùn)動(dòng)能力減低，中度運(yùn)動(dòng)受限，雖能正常行走，但是足底刺激縮爪反應(yīng)減弱；3分為自主活動(dòng)完全受限，無(wú)法行走，出現(xiàn)明顯的拖爪現(xiàn)象，足底刺激無(wú)反應(yīng)。

1.5.2 痛閾值檢測(cè)： 機(jī)械性縮足反射法[7](即MWT)：將大鼠放置在金屬網(wǎng)格網(wǎng)上并蓋上透明有機(jī)玻璃罩，升高網(wǎng)格網(wǎng)，適應(yīng)30 min后，在下方用纖維細(xì)絲垂直刺激大鼠的手術(shù)側(cè)的足底中部，不斷加大刺激力度，記錄大鼠出現(xiàn)抬腿、舔足行為情況是測(cè)痛儀顯示的數(shù)值，每只動(dòng)物測(cè)5次(間隔60 s)，將取平均值作為最終結(jié)果。熱縮足反射潛伏期法[8](即TWL)：把老鼠放置在有機(jī)玻璃箱之中，將玻璃箱放置到玻璃板上，適應(yīng)30 min后，通過儀器中的紅外線光束對(duì)大鼠術(shù)側(cè)足底中部進(jìn)行照射，從開始照射計(jì)時(shí)，至大鼠表現(xiàn)出逃避性行為截止，熱刺激基礎(chǔ)強(qiáng)度設(shè)定10 s，自動(dòng)切斷時(shí)間設(shè)定20 s，每只大鼠分測(cè)5次，間隔時(shí)間為5 min，將平均值作為結(jié)果。

1.5.3 PKC免疫染色： 獲取L5節(jié)段進(jìn)行固定、石蠟包埋、切片等處理后，應(yīng)用免疫組化SABC法進(jìn)行組織染色處理，將PKC單克隆抗體作為一抗(配比為1:50)，將PBS作為陰性對(duì)照，利用電子顯微鏡和醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。在高倍鏡下(×200)抽取6個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)PKC陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)(計(jì)數(shù)100個(gè))，陽(yáng)性者在胞漿內(nèi)可見黃色或棕黃色顆粒，根據(jù)參照文獻(xiàn)[9]通過雙盲法，依照陽(yáng)性細(xì)胞比(10%以下計(jì)0分，10%～30%計(jì)1分，31%～50%計(jì)2分，51%～70%計(jì)3分，70%以上計(jì)4分)和染色強(qiáng)度(未見黃色顆粒0分，黃色1分，深黃色2分，棕黃色3分)進(jìn)行PKC免疫組化評(píng)分(二者相乘)，其中0分代表(-)，1～4分代表(+)，5～8分代表(++)，9～12分代表(+++)。

1.5.4 RT-PCR(實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè))： 在各檢測(cè)點(diǎn)，分別提取大鼠脊髓背角組織，通過液氮冷凍法進(jìn)行碾磨之后，添加Trizol試劑進(jìn)行總RNA提取，嚴(yán)格依照試劑盒完成反轉(zhuǎn)錄制取cDNA，添加SYBR green I，對(duì)組織PKC mRNA進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.5.5 Western blot：取新鮮脊髓背角組織，無(wú)需固定處理，直接進(jìn)行冷凍碾磨，添加蛋白裂解液，高速離心去除沉淀，高溫煮10 min完成蛋白質(zhì)變性，接受電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉處理后，添加PKC一抗(配比1:500)在 4℃環(huán)境中孵育12 h，取出后添加二抗(配比為1:2000)，在室溫下再次孵育45 min，利用TBS進(jìn)行洗膜，添加ECL進(jìn)行化學(xué)發(fā)光。內(nèi)參為Tubulin (配比為1:1000)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

雙輸入方法建立實(shí)驗(yàn)電子數(shù)據(jù)信息，利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)程序完成數(shù)據(jù)分析，方差檢驗(yàn)齊性后，組間計(jì)量資料比較為單因素方差分析，組內(nèi)前后比較為配對(duì)t檢驗(yàn)，若P<0.05，則差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組間行為學(xué)能力評(píng)分和痛閾值比較

建模前，各組大鼠的行為學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)差異無(wú)顯著性 (P>0.05)，在建模后，模型組和觀察組大鼠的行為能力顯著降低，且模型組大鼠的行為能力破壞更為嚴(yán)重，組間累積評(píng)分、運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、MWT、TWL差異顯著(P<0.05)，(表1)。

2.2 三組PKC免疫染色結(jié)果

建模前，各組均未見明顯的PKC陽(yáng)性表達(dá)，且對(duì)照組的神經(jīng)元細(xì)胞在實(shí)驗(yàn)無(wú)明顯變化，PKC陽(yáng)性細(xì)胞極少，為陰性表達(dá)，模型組在建模后，細(xì)胞內(nèi)可見大量棕黃色顆粒，PKC呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，觀察組在建模后雖然PKC同樣為強(qiáng)陽(yáng)性，但是隨著治療時(shí)間遞增，表達(dá)強(qiáng)度不斷降低，在第14 天時(shí)轉(zhuǎn)變?yōu)槿蹶?yáng)性表達(dá)，與模型組PKC表達(dá)強(qiáng)度差異具有顯著性 (P<0.05)。詳見圖1和表2。

A：對(duì)照組3 d;B：模型組3 d; C：觀察組3 d; D：對(duì)照組14 d; E：模型組14 d; F：觀察組14 d(200×,標(biāo)尺=10 μm)圖1 PKC免疫染色結(jié)果A:Group C 3 d.B:Group M 3 d.C:Group O 3 d. D:Group C 14 d. E:Group M 14 d. F:Group O 14 d(200×,Bar=10μm) Fig.1 Expression of PKC in the brain tissues in the groups of Immunohistochemical staining

2.3 三組PKC表達(dá)水平比較

對(duì)照組可檢測(cè)到極少量PKC蛋白表達(dá)，觀察組和模型組在建模后，PKC表達(dá)水平顯著升高，與對(duì)照組相比，差異明顯(P<0.05)；但是，隨著不斷的給藥，觀察組的PKC表達(dá)量不斷下降，且在給藥14 d時(shí)，PKC表達(dá)量降至接近對(duì)照組水平，在相同時(shí)間點(diǎn)(給藥3 d之后)，觀察組PKC表達(dá)量顯著低于模型組(P<0.05)。詳見表3，圖2，圖3。

表1 組間行為學(xué)評(píng)價(jià)結(jié)果比較

Tab.1 Comparison of behavioral evaluation results between the groups

組別Groups建模時(shí)間Time累積評(píng)分(分)Cumulativescoring(score)運(yùn)動(dòng)功能(分)Motorfunction(score)機(jī)械性縮足反射(g)MWT(g)熱縮足反射潛伏期(s)TWL(s)對(duì)照組建模前Beforemodeling0014.52±1.1227.32±2.26GroupC給藥后3d(D3)0014.38±1.0928.42±2.32給藥后5d(D5)0014.63±1.1127.95±2.37給藥后7d(D7)0014.71±1.1428.16±2.41給藥后14d(D14)0014.61±1.1328.37±2.59模型組建模前(BM)005.25±1.3627.15±2.31GroupM給藥后3d(D3)4.21±1.05ac2.85±1.13ac4.63±1.29ac14.59±2.64ac給藥后5d(D5)4.02±1.02ac2.62±1.21ac4.74±1.32ac13.57±2.58ac給藥后7d(D7)3.37±1.03ac2.59±0.99ac4.59±1.31ac12.62±2.57ac給藥后14d(D14)3.41±1.01ac2.24±1.10ac4.62±1.28ac11.95±2.71ac觀察組建模前(BM)0014.59±1.3027.34±2.28GroupO給藥后3d(D3)3.31±1.02abc2.15±1.14abc10.12±1.21abc17.62±2.54abc給藥后5d(D5)2.55±0.89abc1.72±1.20abc9.69±1.23abc19.57±2.69abc給藥后7d(D7)2.03±0.88abc1.59±0.98abc8.03±1.18abc20.87±2.82abc給藥后14d(D14)1.19±0.86abc0.94±0.62abc7.11±1.16abc21.63±2.72abc

注：相同點(diǎn)，與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與組內(nèi)建模前比較，cP<0.05。

Note. The same time points, compared with the control group,aP<0.05; compared with the model group,bP<0.05； compared with the same group before modeling,cP<0.05.

表2 三組免疫PKC免疫組化評(píng)分比較

注：相同點(diǎn)，與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與組內(nèi)建模前比較，cP<0.05。

Note. The same time points, compared with the control group,aP<0.05; compared with the model group,bP<0.05；compared with the same group before modeling,cP<0.05.

表3 三組PKC表達(dá)量比較

注：相同點(diǎn)，與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與組內(nèi)建模前比較，cP<0.05。

Note. The same time points, compared with the control group,aP<0.05; compared with the model group,bP<0.05；compared with the same group before modeling,cP<0.05.

圖2 各組PKC mRNA表達(dá)水平比較Fig.2 Comparison of PKC mRNA expression levels in the 3 groups

圖3 各組PKC蛋白的Western blot檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Western blotting results of PKC protein in the different groups

3 討論

PKC作為磷脂依賴性重要酶類，能夠被Ca2+活化，活化后的PKC能夠參與細(xì)胞增殖、凋亡、骨架蛋白重塑、離子通道調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)效應(yīng)[10，11]。PKC在中樞神經(jīng)傳導(dǎo)通路中具有第二信使的作用，刺激信號(hào)經(jīng)過活性NMDA受體能夠開啟Ca2+通道，導(dǎo)致Ca2+在細(xì)胞內(nèi)不斷聚集增多，PKC受控區(qū)域與Ca2+結(jié)合后其構(gòu)象發(fā)生轉(zhuǎn)變而啟動(dòng)催化區(qū)，從而PKC活性被激活，此外有害神經(jīng)刺激能夠刺激P物質(zhì)釋放，激活脊髓髓背角NK1受體進(jìn)而PLC(磷脂酶C)的活性，而活化后的PLC能夠通過對(duì)膜磷脂進(jìn)行水解而釋放DAG (即二酰甘油)，而DAG是公認(rèn)的PKC活化因子，因此，在神經(jīng)遭受有害刺激后，體內(nèi)PKC能夠通過多種途徑被活化，而活性PKC能夠?qū)е翹MDAR等鈣調(diào)節(jié)蛋白發(fā)生磷酸化，從而導(dǎo)致脊髓可塑性轉(zhuǎn)變，增加中樞敏感性。國(guó)內(nèi)學(xué)者楊勇等[9]銅鼓實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PKC陽(yáng)性細(xì)胞主要分布于脊髓背角淺層，其能夠參與中樞傷害信號(hào)傳遞，參與中樞敏感化機(jī)制。

右美托咪定作為臨床常用的鎮(zhèn)痛藥物，其能夠通過增強(qiáng)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的背角神經(jīng)元抑制作用、抑制鈣內(nèi)流、減少神經(jīng)遞質(zhì)釋放等發(fā)揮生物效應(yīng)。國(guó)內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)右美托咪定能夠抑制脊髓背角處神經(jīng)元的凋亡程度，影響神經(jīng)性疼痛的痛敏機(jī)制[12]。但是目前關(guān)于PKC表達(dá)在慢性神經(jīng)痛中的臨床價(jià)值研究以及右美托咪定對(duì)于神經(jīng)痛PKC影響的研究仍然十分少見，相關(guān)生物學(xué)機(jī)制更是存有較大空白。本實(shí)驗(yàn)中，在利用坐骨神經(jīng)損傷法建立慢性神經(jīng)痛模型后，通過對(duì)不同干預(yù)方法下，各組大鼠的行為學(xué)效應(yīng)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，模型組和觀察組的運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分、累積疼痛評(píng)分顯著高于對(duì)照組，MWT痛閾值、TWL痛閾值結(jié)果均顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明與對(duì)照組相比，慢性神經(jīng)痛模型大鼠均出現(xiàn)中樞痛敏化效應(yīng)，其已經(jīng)形成痛覺超敏，進(jìn)一步對(duì)比模型組和觀察組數(shù)據(jù)顯示，觀察組行為學(xué)效應(yīng)異常情況顯著輕與模型組，說(shuō)明右美托咪定對(duì)于痛敏效應(yīng)形成能夠產(chǎn)生一定的抑制作用。利用現(xiàn)代化研究技術(shù)對(duì)脊髓PKC進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組僅有極少量PKC陽(yáng)性細(xì)胞存在，其PKC mRNA相對(duì)表達(dá)量和PKC蛋白表達(dá)水平顯著低于其他兩組，說(shuō)明在正常生理情況下，脊髓內(nèi)PKC含量極低，但是當(dāng)發(fā)生神經(jīng)損傷后，脊髓內(nèi)PKC含量顯著升高，在脊髓背角處呈明顯的陽(yáng)性表達(dá)，表明PKC不僅參與了神經(jīng)損傷、疼痛信息的傳遞過程，而且可能參與痛敏形成過程，對(duì)疼痛敏感性具有重要影響。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，觀察組PKC陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度、PKC mRNA、PKC蛋白水平顯著低于對(duì)照組，且上述指標(biāo)的表達(dá)水平隨著右美托咪定使用時(shí)間增加而降低，說(shuō)明右美托咪定對(duì)于PKC形成具有顯著的抑制作用，其可能通過抑制PKC釋放發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。PKC在動(dòng)物體內(nèi)具有12種亞型，每種亞型的功能、結(jié)構(gòu)也不盡相同，本實(shí)驗(yàn)雖然證實(shí)了PKC參與了慢性神經(jīng)痛病理機(jī)制，但是尚未設(shè)計(jì)PKC不同亞型表達(dá)水平、作用效應(yīng)的研究，且觀察時(shí)間有限，對(duì)于右美托咪定對(duì)于慢性神經(jīng)痛遠(yuǎn)期干預(yù)效果未進(jìn)行分析總結(jié)，實(shí)驗(yàn)仍存在一定缺陷，需要進(jìn)一步改進(jìn)和深入研究?？偠灾?，PKC參與了慢性神經(jīng)痛痛敏形成過程，是對(duì)于慢性神經(jīng)痛發(fā)病機(jī)制具有重要影響，右美托咪定作為常用鎮(zhèn)痛藥物，經(jīng)鞘內(nèi)注射給藥能夠減輕慢性神經(jīng)痛痛敏程度，其鎮(zhèn)痛機(jī)制可能為抑制脊髓背角PKC表達(dá)。

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Effect of intrathecal injection of dexmedetomidine on the behavioral activity, pain degree and expression of protein kinase C in the spinal dorsal horn in rat models of chronic neuropathic pain

SUN Hu1,ZHANG Liang2,XU Zhi-xin1

(1.Depatment of Anesthesiology, the Second Affiliated Hospital of Hainan Medical College, Haikou 570311, China； 2. Department of Anesthesiology, Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, 511447)

Objective To analyze the effect of intrathecal injection of dexmedetomidine on the behavioral activity, pain degree and expression of protein kinase C in spinal dorsal horn of rat models of chronic neuropathic pain, and to investigate the analgesic mechanism of dexmedetomidine. Methods 75 healthy male rats were randomly divided into observation group, model group and control group, 25 rats in each group. Chronic sciatic nerve injury model was established in the observation group and model group. After modeling, intrathecal dexmedetomidine intervention was used in the observation group. The model group was treated with saline injection and there was no intervention in the control group. Before the modeling (BM)and at 3(D3), 5(D5), 7(D7), and 14 (D14)days after medicine administration, the behavioral capacity was evaluated by cumulative evaluation method and movement function evaluation, and the assessment of pain degree (mechanical withdrawal method and thermal withdrawal latency pain threshold detection method), PKC staining score (immunohistochemical SABC method), PKC mRNA assay (RT-PCR method) and PKC protein expression (Western blot) were conducted and the data were statistically analyzed. Results ① Before modeling, the behavior, the cumulative scores of motor function, MWT, and TWL showed no significant differences between the different groups (P>0.05). After modeling, the model group and observation group showed that the cumulative scores and motor function scores were increased significantly, MWT and TWL decreased significantly, and the changes in the observation group were significantly lower than those in the model group (P<0.05). After modeling, the cumulative scores, motor function scores, MWT, and TWL were significantly different between the groups (P<0.05). ② The expression of PKC was negative in the control group and positive in the model group. In the observation group, after the initial establishment of model, the PKC was strongly positive, and along with the prolonged treatment, the PKC expression intensity was decreased, and only weakly positively expressed at 14 d. ③ After modeling, the observation group and model group showed that the PKC mRNA and PKC protein expression levels were significantly higher than that of the control group (P<0.05). With the continuous drug administration, the PKC mRNA and PKC in the observation group were decreasing, and reached a level close to that of the control group at 14 d of drug administration. From the third day after modeling, at the same time points, the amount of PKC expression in the observation group was significantly lower than that in the model group (P<0.05). Conclusions Intrathecal injection of dexmedetomidine can improve the behavior of rat models with chronic neuropathic pain, and reduce the degree of pain. It may be related to the inhibition of protein kinase C expression in the spinal dorsal horn.

Dexmedetomidine; Intrathecal injection; Chronic neuropathic pain; Spinal dorsal horn; Protein kinase C; Sprague-Dawley rats

孫虎(1980-)，男，主要研究方向：臨床麻醉與疼痛治療，E-mail： sunhu09@163.com。

徐志新(1963-)，男，博士研究生，主任醫(yī)師，麻醉學(xué)教授,碩士生導(dǎo)師。E-mail： droxuzhixin@tom.com。

研究報(bào)告

R-33

A

1671-7856(2017) 06-0006-06

10.3969.j.issn.1671-7856. 2017.06.002

2016-11-23