韓燚 王雙磊 李展春

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院骨科，上海 200127

1960年，F(xiàn)rost最先提出骨微損傷的概念，即活體內(nèi)因骨疲勞而引發(fā)的長度約為30～100 μm的顯微裂隙[1]。骨微損傷能夠啟動(dòng)骨重建，生理狀態(tài)下，骨微損傷的產(chǎn)生與骨重建修復(fù)處于動(dòng)態(tài)平衡之中，平衡破壞后會(huì)造成骨微損傷的累積，造成骨質(zhì)疏松性骨折。研究骨微損傷在機(jī)械和生物學(xué)之間的作用關(guān)系以及不同微損傷類型的修復(fù)方式，有助于揭示骨質(zhì)疏松性骨折的機(jī)制，并為其預(yù)防和治療提供新的思路。

1 骨微損傷的分類

圖1 不同類型骨微損傷形態(tài)學(xué)圖片(鈣黃綠素染色)。A：線性微裂紋[7]；B：彌散性微損傷；C：染色性交叉岔折；D：束狀微損傷Fig.1 Pictures of different types of microdamage (stained with calcein).A：A linear microcrack[7]；B：Diffuse microdamage of bone；C：Cross-hatching microdamage；D：Wispy microdamage of bone

在形態(tài)學(xué)上骨微損傷可分為五類：線性微裂紋、彌散性微損傷、染色性交叉岔折、束狀微損傷和顯微骨折。其中線性微裂紋最為常見，是指骨橫斷面上輪廓銳利、長度為50～100μm的細(xì)小破裂[2]，通常出現(xiàn)在皮質(zhì)骨上。用大塊組織堿性品紅染色時(shí)，線性微裂紋表現(xiàn)為兩端尖銳的線狀紅色深染區(qū)，周圍有紅暈，它兩端較鈍，可以和骨陷窩相連接。在人椎體上，線性微裂紋出現(xiàn)在骨小梁的中央或靠近骨表面。在骨小梁的中央時(shí)，常單個(gè)出現(xiàn),定位在黏合線和裂隙骨基質(zhì)。在骨小梁表面，多條線性微裂紋常同時(shí)存在。彌散性微損傷則由密集分布的超微破裂損傷聚集而成，主要位于小梁骨的表面區(qū)域，在男性骨骼中的分布多于女性[3]。堿性品紅染色時(shí)，彌散性微損傷表現(xiàn)為片狀紅染區(qū)域。在所有的損傷類型中，彌散型損傷更容易、更早出現(xiàn)[4]。染色性交叉岔折也稱網(wǎng)狀線性裂紋，是指很多的細(xì)小裂紋存在于骨小梁上，組成局部的網(wǎng)絡(luò)狀[5]。堿性品紅染色時(shí)，染色性交叉岔折是局部面積較大的網(wǎng)狀交叉深染形態(tài)，為廣泛的紅色區(qū)和許多類似微破裂的深染區(qū)交織在一起。束狀微損傷是指在顯微鏡下可見的板層間束狀或條索狀的染色涂層[2]，與線性微裂紋不同，束狀微損傷分支廣泛，無視骨顯微結(jié)構(gòu)邊界并穿過骨黏合線或骨板[6]。顯微骨折表現(xiàn)為骨小梁的完全斷裂，幾乎全部發(fā)生于老年人。

2 骨微損傷的檢測方法

2.1 普通光鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM)觀察

通過光鏡、熒光顯微鏡和激光掃描共聚焦顯微鏡均能觀察到線性微裂紋和彌散性微損傷，但熒光顯微鏡能顯示普通光鏡下難以分辨的染色較淺的顯微損傷，熒光顯微鏡顯示的損傷骨表面比率、損傷骨厚度和損傷骨面積均大于普通光鏡所示，這是由于部分染色較淺的裂紋僅能在熒光顯微鏡下顯示。與光鏡、熒光顯微鏡相比較，LSCM的優(yōu)點(diǎn)是可以對不同深度的平面進(jìn)行連續(xù)掃描，對掃描后圖象進(jìn)行三維重建，具有較高的空間分辨率，可以發(fā)現(xiàn)較小的裂紋[8]。但由大量密集相互交叉的超微裂紋聚集而成的彌散性微損傷，即使是共聚焦顯微鏡也難以分辨。在使用顯微鏡進(jìn)行觀察之前還需要對骨樣本進(jìn)行染色等一系列處理，常用的染色方法有：堿性品紅染色法、醋酸鈾酸鉛染色法、品紅熒光法和熒光染料法。

堿性品紅染色法使用溶于酒精中的堿性品紅溶液對微損傷進(jìn)行染色，是檢測骨微損傷的常用方法。Frost應(yīng)用大塊標(biāo)本骨染色技術(shù)來區(qū)分骨微損傷的來源，因?yàn)橹挥星衅耙汛嬖诘墓橇芽p可以著色，而切片過程中的人為裂紋不會(huì)著色，這樣可以將切片制備前已經(jīng)形成的骨微損傷與切片制備過程中造成的微損傷區(qū)別開來。這種染色方法優(yōu)點(diǎn)是操作相對簡單而且經(jīng)濟(jì)，缺點(diǎn)在于往往染色過淺，給觀察帶來一定困難。其主要步驟為：新鮮骨組織經(jīng)乙醇固定后，使用堿性品紅溶液染色，再經(jīng)甲基丙烯酸甲酯浸泡包埋，最后經(jīng)過鋸片磨片封片處理后觀測。染色的深淺程度與染色溶液濃度、試劑種類、來源、染色時(shí)間、染色時(shí)所處的負(fù)壓大小、溫度以及骨的密度有關(guān)。此外，還有大塊組織醋酸鈾酸鉛染色法[9]、品紅熒光法和熒光染料法等。醋酸鈾酸鉛染色將微損傷染成黑色，制成的骨組織切片可用掃描電鏡來觀察。而品紅熒光法是在熒光顯微鏡下觀察，這是因?yàn)閴A性品紅既可以在透射光下顯色，也可以吸收波長為545 nm的光線，被激發(fā)后透過紅色濾光片可看到桔黃色的熒光[8]。該方法易于鑒別微損傷的各種形態(tài)，并且可以進(jìn)行準(zhǔn)確的測量。由于品紅染色是一種占位的染色方法，因此它的位置特異性受到影響，也不能反映裂紋生長的過程，熒光染料的動(dòng)態(tài)標(biāo)記有望解決這些問題，常用的熒光染料有茜素、四環(huán)素、鈣黃綠素三種物質(zhì)，它們可以和鈣離子結(jié)合，分別被激發(fā)出紅色、黃色及綠色熒光。熒光染料可用來觀察損傷的修復(fù)情況，具有很好的位置特異性[8]，在動(dòng)物處死前注射熒光染料進(jìn)行標(biāo)記，利用不同熒光染料的連續(xù)標(biāo)記可以計(jì)量裂紋的積累速率和增長速度，也可以對新骨進(jìn)行標(biāo)記來反映骨的修復(fù)和重建。熒光染色的敏感性大于等于品紅染色，這種方法可以準(zhǔn)確的區(qū)分人為和本來就存在的顯微損傷[8]。

2.2 原子力顯微鏡(AFM)

原子力顯微鏡用于觀察骨超微結(jié)構(gòu)，其分辨率可達(dá)1 nm，能確定局部的微應(yīng)變(με)大小，辨認(rèn)出微裂紋兩側(cè)的膠原蛋白/磷灰石邊界[10]。

圖2 原子力顯微鏡下骨小梁斷裂面的形態(tài)學(xué)圖像[10]Fig.2 AFM tomography image of the fractured surface of a trabecula[10]

2.3 掃描電子顯微鏡(SEM)

掃描電子顯微鏡可以用來觀察重金屬(如醋酸鈾酸鉛)染色后的微損傷，在研究微裂紋擴(kuò)展時(shí)，電子顯微鏡有助于辨認(rèn)出主裂紋周圍骨基質(zhì)中的損傷區(qū)域。近年來，電子顯微鏡多用于觀察金-鈀濺射鍍層處理的骨樣本[9]。

圖3 骨小梁微裂紋的掃描電鏡圖像,圖中箭頭所示為原子力顯微鏡下圖像在掃描電鏡圖像上的對應(yīng)區(qū)域[10]Fig.3 SEM image of trabecular bone microcrack.The insets show the corresponding AFM image scaled to fit the dimensions of the SEM image[10]

2.4 聲發(fā)射技術(shù)(AE)

聲發(fā)射技術(shù)通過壓電轉(zhuǎn)換器來檢測骨微損傷，它將彈性應(yīng)力波轉(zhuǎn)換成低振幅震蕩電壓，當(dāng)震蕩到達(dá)事先設(shè)好的電壓閾值時(shí)，產(chǎn)生了振鈴信號。微裂紋會(huì)釋放大量的彈性波從而產(chǎn)生大量的振鈴信號。研究指出AE的波形(包括總能量、總振幅、第一和第二能量以及振幅時(shí)間)可以用來區(qū)別骨組織中線性微裂紋和彌散性微損傷的形成[9]。

2.5 Micro-CT(μCT)

與上述組織學(xué)觀察需要制作骨的不脫鈣切片相比，Micro-CT是一種非破壞性的3D成像技術(shù)，不需要制備切片而只需要簡單的固定，可以在不破壞樣本的情況下清楚了解樣本的內(nèi)部顯微結(jié)構(gòu)，空間分辨率達(dá)10 μm，能精確計(jì)算出標(biāo)本骨量參數(shù)，檢測骨結(jié)構(gòu)參數(shù)，還能夠動(dòng)態(tài)觀察微損傷，反應(yīng)其隨時(shí)間的累及過程。Micro-CT與普通臨床的CT最大的差別在于分辨率極高，可以達(dá)到微米級別，并且成像范圍小，能夠檢測骨組織細(xì)微結(jié)構(gòu)，為骨質(zhì)疏松的診斷提供更準(zhǔn)確的依據(jù)，雖然該方法可以看到三維的圖像，但是價(jià)格昂貴，臨床應(yīng)用有一定的局限性。

增強(qiáng)Micro-CT使用X射線不能透過的造影劑，能夠發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)上不連續(xù)的彌散性微損傷[11]，常用的造影劑有硫化鉛、醋酸鉛鈾酰、硫酸鋇、碘化物等，方法是先取得骨樣本，切成薄片后分組進(jìn)行骨微損傷造模，再體外注射造影劑，最后進(jìn)行Micro-CT掃描。硫化鉛與醋酸鉛鈾酰中的鉛和硫化鈾酰能夠沉積在骨組織中暴露的所有孔隙空間中，包括線性微裂紋和彌散性微損傷中,與骨組織細(xì)胞外基質(zhì)相比X射線較難透過微損傷區(qū)域，從而達(dá)到檢測微損傷的目的。硫酸鋇被認(rèn)為是含鉛染色的良好替代品，有著良好的生物相容性，適用于體內(nèi)造影，分辨率達(dá)10 μm[12]。鋇離子和硫酸根離子可在微損傷和脈管系統(tǒng)的空隙中形成沉淀。從結(jié)果來看，由于X光很難穿透硫酸鋇沉積的損傷區(qū)域，與正常組織相比損傷區(qū)域在Micro-CT中的像素強(qiáng)度得到了增強(qiáng)，使得Micro-CT成像有了一個(gè)更適合的閾強(qiáng)度[13]。而碘化物有一個(gè)能夠結(jié)合陽離子的位點(diǎn)，因此能與骨組織中的鈣離子結(jié)合而標(biāo)記微損傷，經(jīng)過Micro-CT掃描后可以發(fā)現(xiàn)微裂紋。

2.6 Micro-MRI(μMRI)

Micro-MRI是一種非侵入性檢查方法，與CT相比，MRI沒有電離輻射，而且骨與骨髓本身成像就對比鮮明，這是因?yàn)楣撬柚泻写罅康乃椭窘M織。高分辨率磁共振成像(high-resolution magnetic resonance imaging，HR MRI)利用骨髓和骨小梁結(jié)構(gòu)的信號差異進(jìn)行成像，在骨髓高信號的背景中骨小梁顯示為黑色網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其分辨率可直接顯示每根骨小梁的結(jié)構(gòu)形態(tài)[14]。其主要特點(diǎn)是小孔徑(直徑<20 cm)、高分辨力(<100 μm)、高場強(qiáng)(>3T)，能比普通MRI提供更多的信息，缺點(diǎn)是成像時(shí)間長，靈敏度略低。

3 骨微損傷的形成與修復(fù)機(jī)制

3.1 骨微損傷的形成

引起骨微損傷的主要原因大致有兩種[15]：一種是過度連續(xù)承載造成的疲勞損傷，另一種是各種機(jī)械性損傷，如暴力撞擊、假體或螺釘?shù)闹踩氲?。五種微損傷類型中，目前研究主要集中在線性微裂紋和彌散性微損傷，值得注意的是，彌散性微損傷并不是線性微裂紋形成的前體，在同樣負(fù)荷加載的骨樣本上，它們出現(xiàn)在完全不同的區(qū)域[6]，說明它們是完全不同的兩種微損傷類型，本文對這兩種類型進(jìn)行闡述。

骨微損傷是如何形成的呢？骨微損傷發(fā)生于膠原纖維或更低層次的分子水平上，首先發(fā)生膠原纖維與骨細(xì)胞接觸表面的松解，繼而發(fā)生兩者之間的分離以及膠原纖維的分解。當(dāng)有足夠數(shù)量的裂紋形成時(shí)，高倍鏡下可觀察到這些改變，隨著這些裂紋的不斷積累和融合，經(jīng)過染色后在低倍鏡下就可以看到這些改變[16]。骨微損傷是一把雙刃劍，一方面如果不能得到及時(shí)修復(fù)，微損傷將會(huì)在原有基礎(chǔ)上不斷傳播擴(kuò)大，同時(shí)產(chǎn)生新的微損傷，形成正反饋 (即“弱化骨作用”[12])；另一方面能夠分散能量以抵抗脆性骨折的發(fā)生[17](也稱作“韌化機(jī)制”[18])。彌散性微損傷中骨基質(zhì)可以將損傷限制在有限的區(qū)域從而避免了破裂的進(jìn)一步擴(kuò)散以及基質(zhì)的破壞[12]。

骨微損傷形成后，如果不能得到及時(shí)的修復(fù)，將會(huì)逐漸累積并最終導(dǎo)致骨折，這取決于骨組織修復(fù)能力、外界環(huán)境的影響以及微裂紋的大小。較小的裂紋能夠依賴骨組織自身修復(fù)能力進(jìn)行修復(fù)，而當(dāng)疲勞損傷超過了骨組織自身修復(fù)能力之后，這種裂紋將逐漸累積，并最終發(fā)展至應(yīng)力性骨折，即疲勞性骨折；外界環(huán)境也在骨折發(fā)生過程中起著重要作用，F(xiàn)yhrie等[17]研究指出，移除載荷后人體壓縮的椎體松質(zhì)骨至少可以恢復(fù)到原有94%的高度，說明顯微裂紋可以分散能量從而促進(jìn)恢復(fù)和維持小梁整體的結(jié)構(gòu)；微裂紋的大小也影響著骨折形成過程，O’Brien等[19]研究發(fā)現(xiàn)，骨單位是防止裂紋延長的屏障，這種屏障作用取決于裂紋到達(dá)骨單位時(shí)的長度，不超過100 μm的裂紋遇到骨單位周圍的黏合線時(shí)就會(huì)終止延長，而100～300 μm的裂紋在遇到黏合線會(huì)沿著其延長并很快終止，大于300 μm的裂紋能夠穿過骨單位并從一個(gè)哈弗式系統(tǒng)發(fā)展到另一個(gè)哈弗式系統(tǒng)，最終引起骨折。

3.2 骨微損傷的修復(fù)

研究指出骨組織依靠基礎(chǔ)多細(xì)胞單元(basic multicellular unit, BMU)為基礎(chǔ)的骨重建修復(fù)微損傷，而骨重建是一系列反應(yīng)過程的總稱，包括破骨細(xì)胞清除損傷區(qū)域形成吸收空腔，成骨細(xì)胞合成并分泌骨基質(zhì)，以及骨基質(zhì)礦化沉積形成新骨填補(bǔ)吸收空腔。骨重建能夠維持體內(nèi)鈣磷代謝的平衡，清除骨內(nèi)的顯微損傷以適應(yīng)周圍力學(xué)環(huán)境的改變，一些學(xué)者認(rèn)為骨內(nèi)存在兩種類型的骨重建[20]：即隨機(jī)性骨重建和靶向骨重建，前者不針對特定的部位，后者針對特定的微損傷發(fā)生的部位，即有微損傷和骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的部位。通常認(rèn)為骨主要通過靶向骨重建來修復(fù)微損傷，骨細(xì)胞感知力學(xué)變化和微損傷后，先通過破骨細(xì)胞的吸收來清除骨，移除損傷組織，隨后成骨細(xì)胞移行至吸收部位分泌骨基質(zhì)礦化成新骨進(jìn)行修復(fù)，這種修復(fù)方式可以根據(jù)力學(xué)需求而變化成骨部位和數(shù)量[21]，從而定位清除微損傷。

由于顯微結(jié)構(gòu)和組織超微結(jié)構(gòu)的不同，皮質(zhì)骨和松質(zhì)骨的修復(fù)方式有所不同。Mori等[22]指出狗皮質(zhì)骨上，微損傷的周圍總是伴有吸收腔，而Goff等[23]發(fā)現(xiàn)松質(zhì)骨的微損傷遠(yuǎn)離吸收腔和骨小梁表面，這可能是由于靠近骨端的裂紋先被修復(fù)，而遠(yuǎn)離骨端的裂紋后被修復(fù)。

影響骨重建的一些因素可能會(huì)增加骨折的風(fēng)險(xiǎn)，Li等[24]研究發(fā)現(xiàn)在同樣的負(fù)荷加載下，去卵巢組大鼠骨微損傷較對照組明顯增多，說明雌激素缺乏與骨重建、骨微損傷的聚積密切相關(guān)，絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折就很可能是雌激素缺乏導(dǎo)致的骨重建加快引起的，Schaffler等[25]認(rèn)為骨重建的加快會(huì)加速微損傷的積累，導(dǎo)致吸收腔的增多，降低了骨強(qiáng)度，進(jìn)一步導(dǎo)致疏松骨的應(yīng)力和應(yīng)變增大，使得微損傷增加。但抑制骨重建也會(huì)導(dǎo)致同樣的結(jié)果，Li等[26]使用二磷酸鹽(如利塞磷酸鹽、阿侖磷酸鹽)等抗骨質(zhì)疏松藥物，發(fā)現(xiàn)其在增加骨量的同時(shí)也可以抑制骨重建從而造成骨微損傷的聚積，抗骨質(zhì)疏松藥物的使用與非典型股骨骨折的發(fā)生有相關(guān)性。

那么骨微損傷是如何啟動(dòng)骨重建的呢？研究指出微損傷可能會(huì)導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡從而啟動(dòng)了骨重建[27]，但不同微損傷類型對骨重建的影響不同[2]：線性微裂紋通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡啟動(dòng)靶向骨重建，彌散性微損傷不誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡而啟動(dòng)隨機(jī)性骨重建。

關(guān)于線性微裂紋誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制有許多不同觀點(diǎn)，Tami等[28]認(rèn)為線性微裂紋破壞了骨細(xì)胞之間小管液的運(yùn)輸，Herman等[29]指出小管液的破壞會(huì)造成細(xì)胞缺氧應(yīng)激從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此外，Herman等[2]還認(rèn)為與心肌、腦缺血等局灶性損傷機(jī)制相類似，線性微裂紋直接橫斷了骨細(xì)胞導(dǎo)致其壞死并進(jìn)一步引起臨近骨細(xì)胞凋亡。有學(xué)者認(rèn)為凋亡細(xì)胞附近的骨細(xì)胞能夠釋放核因子κβ受體活化因子配體(receptor activator of nuclear factor kappaβ ligand，RANKL)，激活破骨細(xì)胞從而啟動(dòng)骨重建[30]，因此骨細(xì)胞凋亡和作為“旁觀者”的周圍骨細(xì)胞釋放的破骨細(xì)胞激活信號這兩者對于靶向性骨重建十分重要[18]。Taylor等[31]發(fā)現(xiàn)線性微裂紋及其兩端的流體流速高于完好骨骼，說明流體流動(dòng)產(chǎn)生的剪切力能夠通過改變力學(xué)傳導(dǎo)性啟動(dòng)骨重建。

而關(guān)于彌散性微損傷不導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的原因尚不明確，Herman等[2]認(rèn)為彌散性微損傷損傷長度短(<1 μm)，不影響局部小管液運(yùn)輸以及骨細(xì)胞代謝應(yīng)激，從而不會(huì)導(dǎo)致骨細(xì)胞凋亡。Seref-Ferlengez等[4]建立大鼠尺骨彌散性微損傷模型，發(fā)現(xiàn)彌散性微損傷不影響骨細(xì)胞的完整性，以及隨著時(shí)間的推移彌散性微損傷不斷減少，證實(shí)了其在亞板層骨水平上的自我修復(fù)能力。盡管這種自我修復(fù)能力的具體機(jī)制尚不清楚，但可以合理的推測彌散性微損傷區(qū)域與廣泛的骨細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)緊密相關(guān)，機(jī)體以不同于傳統(tǒng)骨重建的方式來處理這種最常見的微損傷類型[18]。Kerschnitzki等[32]發(fā)現(xiàn)骨細(xì)胞與基質(zhì)礦物有著密切關(guān)系，彌散性微損傷區(qū)域的骨細(xì)胞可能通過調(diào)節(jié)一些蛋白質(zhì)的生成，如牙本質(zhì)基質(zhì)酸性磷蛋白-1(dentin matrix acidic phosphoprotein 1，DMP-1)，細(xì)胞外基質(zhì)磷酸化糖蛋白(matrix extracellular phosphoglycoprotein，MEPE)，骨橋蛋白(osteopontin，OPN)等與礦化有關(guān)的蛋白質(zhì)，使礦物沉積于小裂紋中，通過快速直接的礦物橋接修復(fù)活體骨中的彌散性微損傷[4]。

3.3 神經(jīng)肽與骨重建

微損傷形成后，由于骨骼本身具有功能適應(yīng)性，一方面能夠通過骨細(xì)胞局部網(wǎng)絡(luò)修復(fù)微損傷以應(yīng)對外界環(huán)境的變化，避免其進(jìn)一步惡化以及骨折的發(fā)生。另一方面，骨組織中分布廣泛的外周神經(jīng)及其分泌的神經(jīng)肽也在骨重建過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[33]，在微損傷形成及修復(fù)過程中部分神經(jīng)肽表達(dá)上調(diào)，這些神經(jīng)肽可能作為微損傷形成后神經(jīng)性修復(fù)反應(yīng)的重要組成部分，調(diào)節(jié)微損傷修復(fù)過程中的靶向性骨重建，影響負(fù)荷加載后的修復(fù)性新骨形成。研究發(fā)現(xiàn)骨折局部P物質(zhì)(substance P，SP)、降鈣素基因相關(guān)肽(calcitonin gene-related peptide，CGRP)、神經(jīng)肽Y(neuropeptide Y，NPY)陽性纖維數(shù)量明顯增加[34]，說明它們與骨重建及骨折愈合關(guān)系密切，雖然目前尚無血管活性腸肽(vasoactive intestinal polypeptide，VIP)陽性纖維與骨折愈合的相關(guān)報(bào)道，但VIP與CGRP免疫反應(yīng)陽性的神經(jīng)纖維同樣分布于骨膜各層，研究也證實(shí)VIP對實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)骨關(guān)節(jié)炎的骨結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用[35]，說明VIP可能參與骨重建過程，下面分別闡述這四種神經(jīng)肽在骨重建中的可能作用機(jī)制。

在骨折愈合過程中，SP樣神經(jīng)纖維與毛細(xì)血管一同出現(xiàn)在新生骨組織的周圍，除了調(diào)節(jié)局部血流量影響骨折修復(fù)外，其受體NK-1也表達(dá)于成骨和破骨細(xì)胞[36]，盡管SP對成骨細(xì)胞作用存在爭議，但大多數(shù)研究認(rèn)為它既能增強(qiáng)成骨細(xì)胞功能，也能夠增強(qiáng)破骨細(xì)胞功能，提示在骨折愈合過程中它可能參與調(diào)控成骨和破骨細(xì)胞功能的平衡[37]，體外培養(yǎng)條件下SP可以提高成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度[38]，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步探討。此外，SP可以上調(diào)修復(fù)細(xì)胞內(nèi)生長因子及其受體mRNA的表達(dá)而增強(qiáng)修復(fù)細(xì)胞活性，促進(jìn)機(jī)體組織愈合。

CGRP通過與受體結(jié)合調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞分化及功能，進(jìn)而對骨重建過程產(chǎn)生影響，其主要作用是：促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖，抑制破骨細(xì)胞活性。Sample等[39]研究發(fā)現(xiàn)大鼠右側(cè)尺骨負(fù)荷加載會(huì)引起雙側(cè)骨組織中CGRP濃度升高，伴有肢體遠(yuǎn)端雙側(cè)未加載長骨的骨形成作用增強(qiáng)，而臂叢神經(jīng)阻滯能顯著降低血清中骨重建標(biāo)志物抗酒石酸酸性磷酸酶5b(tartrate-resistant acid phosphatase 5b，TRAP5b)水平，削弱骨形成作用，證實(shí)了CGRP對骨形成的促進(jìn)作用。Villa等[40]發(fā)現(xiàn)CGRP可以明顯刺激體外培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的cAMP水平，通過cAMP/PKA信號途徑影響成骨細(xì)胞的代謝，而成骨細(xì)胞中上調(diào)的cAMP還可以增加CGRP的表達(dá)，自分泌作用于成骨細(xì)胞，形成正反饋[41]。Lian等[42]利用施加CGRP和IL-1β的培養(yǎng)基，對成骨和破骨細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)IL-1β可以明顯刺激破骨細(xì)胞骨吸收，而CGRP可劑量依賴性抑制IL-1β介導(dǎo)的骨吸收作用。Cornish等[43]通過體外培養(yǎng)破骨細(xì)胞，進(jìn)一步證明CGRP可直接與破骨細(xì)胞降鈣素受體結(jié)合，抑制破骨細(xì)胞骨吸收活性。

NPY在外周可作用于成骨細(xì)胞Y1受體抑制骨形成，引起骨量丟失，降低骨強(qiáng)度。但有研究發(fā)現(xiàn)，NPY可顯著促進(jìn)骨折愈合，Sousa等[44]觀察到NPY Y1R基因種系敲除鼠出現(xiàn)了骨折愈合延遲現(xiàn)象，認(rèn)為可能是由于Y1R基因敲除后巨噬細(xì)胞功能受到影響，使得TNF-α的產(chǎn)生降低，進(jìn)一步導(dǎo)致骨折愈合過程中炎癥反應(yīng)期的推遲。Long等[34]認(rèn)為在炎癥反應(yīng)期NPY陽性纖維的增加可能會(huì)促進(jìn)細(xì)胞增殖以及血管生成，從而促進(jìn)骨痂形成。

Sample等[45]研究發(fā)現(xiàn)大鼠右側(cè)尺骨負(fù)荷加載10天后雙側(cè)骨組織中VIP濃度升高，而與CGRP作用相似，VIP也能夠促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收。VIP可通過誘導(dǎo)成骨細(xì)胞中cAMP合成增加使堿性磷酸酶mRNA表達(dá)上調(diào)和活性升高，增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性。此外，VIP不僅可以通過抑制甲狀旁腺激素、維生素D3的作用降低成骨細(xì)胞RANKL和破骨細(xì)胞核因子κβ受體活化因子(receptor activator of nuclear factor kappaβ，RANK)的表達(dá)，還可以通過增加成骨細(xì)胞表達(dá)骨保護(hù)蛋白(osteoprotegerin，OPG)，抑制破骨細(xì)胞分化增殖以及活性，抑制骨吸收[46]。

4 總結(jié)和展望

從1960年Frost首先提出骨微損傷的概念到現(xiàn)在這半個(gè)世紀(jì)以來，骨微損傷的檢測從簡單的組織學(xué)染色不斷發(fā)展至運(yùn)用μCT、μMRI檢測等方法，其分辨能力、特異性和準(zhǔn)確程度都有了極大的提高，無創(chuàng)、準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的體外檢查是今后發(fā)展的方向，使早期發(fā)現(xiàn)骨顯微結(jié)構(gòu)的改變成為可能，從而進(jìn)行干預(yù)降低病人骨折風(fēng)險(xiǎn)。在骨微損傷五種類型中，線性微裂紋和彌散性微損傷是最常見也是研究最多的類型，但兩者的修復(fù)方式完全不同，具體機(jī)制仍處于研究探索中。隨著技術(shù)手段的不斷發(fā)展，骨微損傷的檢測會(huì)更加簡便和準(zhǔn)確，骨微損傷在機(jī)械與生物學(xué)之間的復(fù)雜作用也將得到更深入的研究，這對于骨質(zhì)疏松的早期診斷、治療以及預(yù)防骨質(zhì)疏松性骨折的發(fā)生都具有重要意義。