朱秀云 汪文斐 張培澤 張潔云 邱智輝 王召欽 張明霞 鄧國(guó)防

?

·論著·

功能性單核苷酸多態(tài)性調(diào)控結(jié)核病易感的分子機(jī)制研究

朱秀云 汪文斐 張培澤 張潔云 邱智輝 王召欽 張明霞 鄧國(guó)防

目的 通過(guò)構(gòu)建花生四烯酸12-脂氧合酶(ALOX-12)基因(ALOX-12基因)啟動(dòng)子區(qū)域rs3840880位點(diǎn)不同基因型的雙熒光素酶表達(dá)質(zhì)粒，分析此單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)對(duì)ALOX-12基因啟動(dòng)子活性的影響及其對(duì)基因表達(dá)的影響，闡明功能性SNP調(diào)控結(jié)核病易感的分子機(jī)制。方法 從全血樣本中提取人全基因組，PCR擴(kuò)增ALOX-12基因啟動(dòng)子區(qū)域包含rs3840880位點(diǎn)在內(nèi)的約1700 bp的基因片段，構(gòu)建pGL3-Basic-rs3840880G質(zhì)粒，對(duì)此質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變得到pGL3-Basic-rs3840880 D放散型(DEL)質(zhì)粒，分別轉(zhuǎn)染人宮頸癌細(xì)胞株Hela細(xì)胞后使用雙熒光報(bào)告酶檢測(cè)系統(tǒng)(dual luciferase assay system)檢測(cè)相對(duì)熒光值。結(jié)果 成功構(gòu)建了ALOX-12基因啟動(dòng)子區(qū)rs3840880位點(diǎn)等位基因G的表達(dá)質(zhì)粒pGL3-basic-G，采用定點(diǎn)突變技術(shù)成功將pGL3-basic-G質(zhì)粒改造為pGL3-Basic-DEL質(zhì)粒，測(cè)序驗(yàn)證后，兩質(zhì)粒其他序列完全相同。分別將此兩個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞并檢測(cè)相對(duì)熒光比值[熒光值(F)/熒光(R)]后，發(fā)現(xiàn)pGL3-Basic質(zhì)粒F/R=0.129，等位基因G的F/R=0.194，低于等位基因DEL質(zhì)粒的F/R(0.274)，采用單因素方差分析，二者之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.09，P=0.001)。結(jié)論 不同等位基因構(gòu)建的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光報(bào)告基因的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故ALOX-12基因啟動(dòng)子區(qū)域的功能性SNPs確實(shí)能夠影響啟動(dòng)子的活性，從而調(diào)控結(jié)核病的易感性。

花生四烯酸鹽12-脂氧合酶； 多態(tài)性, 單核苷酸； 熒光光度測(cè)定法； 結(jié)核??； 基因表達(dá)調(diào)控, 細(xì)菌

結(jié)核病作為一種慢性炎癥反應(yīng)疾病，是多因素導(dǎo)致的復(fù)雜疾病。據(jù)世界衛(wèi)生組織最新的調(diào)查報(bào)告顯示，全球約有1/3的人口感染結(jié)核分枝桿菌，而在發(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染的人群中僅有5%～10%發(fā)生結(jié)核病的事實(shí)表明，宿主遺傳易感性在結(jié)核病的發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，抗炎藥物應(yīng)答反應(yīng)具有宿主基因型特異性也是結(jié)核病靶向基因和藥物治療的基礎(chǔ)。

全國(guó)結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查表明，我國(guó)結(jié)核病發(fā)病率下降緩慢，每年因結(jié)核病死亡的患者約12萬(wàn)例，相當(dāng)于其他傳染病死亡總和的2倍[1-2]。結(jié)核病的發(fā)病受多種因素影響，目前具體機(jī)制尚不清楚[3]。脂氧合酶(LOX)家族的多個(gè)基因亞型表達(dá)具有物種和組織特異性[4]，12-羥基二十碳四烯酸(12-HETE)是由脂氧合酶-12(LOX-12)催化花生四烯酸(AA)產(chǎn)生，它廣泛參與多種炎癥疾病的病理生理過(guò)程，被認(rèn)為是體內(nèi)最重要的內(nèi)源性脂質(zhì)促炎介質(zhì)之一。雖然有關(guān)花生四烯酸12-脂氧合酶(ALOX-12)基因(ALOX-12基因)多態(tài)性與疾病遺傳易感性的有關(guān)研究有限，但在這些僅有的少量報(bào)道中業(yè)已發(fā)現(xiàn)ALOX-12基因與多個(gè)人類疾病易感性有關(guān)，包括炎癥反應(yīng)性疾病、腫瘤和慢性感染性疾病[3]。LOX基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNP)位點(diǎn)rs2115819也被報(bào)道與結(jié)核病的易感性有關(guān)，是LOX基因家族多態(tài)性在中國(guó)漢族人群，尤其是兒童群體中為數(shù)不多的研究之一[5]。Tobin等[6]研究發(fā)現(xiàn)，位于白三烯A4水解酶(leukotriene A4 hydrolase, LTA4H)(LTA4H基因)啟動(dòng)子區(qū)域的rs17525495位點(diǎn)，在結(jié)核性腦膜炎中，TT基因型患者未經(jīng)地塞米松抗炎治療，其死亡率高于CC基因型；而經(jīng)過(guò)地塞米松治療后，TT基因型的患者死亡率反而最低。這些研究進(jìn)一步提示我們，宿主基因多態(tài)性不僅與疾病的易感性相關(guān)，而且影響藥物的應(yīng)答反應(yīng)，進(jìn)而影響疾病的臨床轉(zhuǎn)歸。

熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)是通過(guò)雙熒光素酶基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控來(lái)研究培養(yǎng)細(xì)胞的生物學(xué)特性。將不同的ALOX-12基因的SNP與啟動(dòng)子分別插入到帶有螢火蟲(chóng)熒光素酶基因和海腎熒光素酶基因PGL3-Basic載體中，兩種基因分別轉(zhuǎn)染到狀態(tài)良好的Hela細(xì)胞，利用目的基因表達(dá)時(shí)熒光素酶基因也同時(shí)表達(dá)的作用，分別利用螢火蟲(chóng)熒光素酶與海腎熒光素酶相應(yīng)的不同底物反應(yīng)產(chǎn)生熒光，通過(guò)檢測(cè)熒光強(qiáng)度反應(yīng)反映出不同SNP對(duì)ALOX-12基因啟動(dòng)子活性的影響。本研究所取得的成果將深入地揭示宿主ALOX-12基因遺傳易感性在結(jié)核病發(fā)生發(fā)展中的作用，為結(jié)核病易感人群的預(yù)防干預(yù)決策及結(jié)核病基因型特異性個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。

資料和方法

一、材料

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本：取人血液樣本2 ml提取全基因組DNA，通過(guò)紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度均≥50 ng/μl，NanoDrop DNA測(cè)定儀(美國(guó)Thermo Fisher公司)測(cè)定DNA純度[吸光度(A)260/280比值(指260 nm和280 nm下吸光度比值)]。

二、試劑

(1)全血DNA抽提試劑盒 QIAamp DNA Blood Mini kit購(gòu)自Qiagen 公司；(2)雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒Dual-Glo?luciferase assay system購(gòu)自普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司；(3)內(nèi)切酶、T4連接酶、PCR反應(yīng)試劑購(gòu)自Takara公司；(4)細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000購(gòu)自Invitrogen公司；(5)StarMut多點(diǎn)基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?StarMut Site-directed Mutagenesis Kit)購(gòu)自安捷倫生物技術(shù)有限公司；(6)熒光素酶報(bào)告基因載體pGL3-Basic和Hela細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存。

三、方法

1.不同SNP位點(diǎn)雙熒光素表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建：根據(jù)ALOX-12基因啟動(dòng)子基因片段設(shè)計(jì)PCR引物，以前期提取的基因組DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，酶切回收的ALOX-12基因啟動(dòng)子片段與pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行連接，構(gòu)建pGL3-Basic-rs3840880G表達(dá)質(zhì)粒，將此表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行定點(diǎn)突變得到pGL3-Basic-rs3840880DEL表達(dá)質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證。

2.將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到Hela細(xì)胞中：提前24 h用無(wú)抗生素DMEM培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium)+10%胎牛血清(FBS)鋪板六孔板Hela細(xì)胞，2 ml/孔。確保細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%融合度；按照每種質(zhì)粒做2個(gè)復(fù)孔，2個(gè)空白對(duì)照要求，每孔(下同)用500 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋2 μg 表達(dá)質(zhì)粒；500 μl 無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋10 μl 脂質(zhì)體2000；5 min后，將DNA溶液和脂質(zhì)體溶液混合，室溫靜置20 min；從6孔板中吸出1 ml無(wú)血清培養(yǎng)基，然后滴加入1 ml質(zhì)粒和脂質(zhì)體混合物；6～10 h后，移除含有DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物的培養(yǎng)基，代之以正常培養(yǎng)液DMED+10%FBS(從此刻開(kāi)始算時(shí)間)，24 h 后進(jìn)行熒光檢測(cè)。

3.雙熒光素表達(dá)系統(tǒng)檢測(cè):根據(jù)Dual-Glo?luciferase assay system試劑盒要求，將檢測(cè)試劑配制好，按照如下步驟操作檢測(cè)熒光；從恒溫孵箱中取出培養(yǎng)有Hela細(xì)胞的六孔板。為獲取最佳結(jié)果，在進(jìn)行第2步前將Dual-Glo?luciferase reagent(熒光素酶試劑)加入板中；將轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞消化后，用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗打勻、混勻。分別取75 μl 加入到已經(jīng)加入Dual-Glo?luciferase reagent的對(duì)應(yīng)的白板孔中；靜置15 min，讓細(xì)胞充分裂解，然后在熒光發(fā)光儀中測(cè)量熒光值。

結(jié) 果

一、ALOX-12基因啟動(dòng)子片段擴(kuò)增

根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，提取人類基因組DNA，使用ALOX-12基因啟動(dòng)子引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用1%(W/V)瓊脂糖凝膠進(jìn)行PCR產(chǎn)物鑒定，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1)。

圖1 1～6為ALOX-12基因各引物組合的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；最終選取3、4目的條帶約1700 bp進(jìn)行切膠回收

二、ALOX-12基因啟動(dòng)子片段與pGL3-Basic質(zhì)粒的連接克隆

用 NcoⅠ和XhoⅠ內(nèi)切酶對(duì)片段和載體進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳。回收1700 bp目的基因片段，并將其與酶切回收后的pGL3-Basic質(zhì)粒進(jìn)行連接后得到pGL3-rs3840880G質(zhì)粒；菌液PCR和測(cè)序鑒定見(jiàn)圖2，3。

圖2 目的片段約1700 bp，菌液PCR鑒定TA克隆結(jié)果，將陽(yáng)性克隆測(cè)序

圖3 陽(yáng)性克隆測(cè)序圖譜，箭頭所指為rs3840880位點(diǎn)等位基因G

三、定點(diǎn)突變結(jié)果

使用StarMut Site-directed Mutagenesis Kit 基因定點(diǎn)突變?cè)噭┖?，將選取標(biāo)本在rs3840880位點(diǎn)的G定點(diǎn)突變?yōu)镈放散型(DEL)。采用甲基化的質(zhì)粒DNA為模板，使用人工合成含有目的突變堿基的引物進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，然后用DpnI限制性內(nèi)切酶消化不含突變的質(zhì)粒模板，得到pGL3-rs3840880DEL質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化后篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序驗(yàn)證, 與預(yù)期結(jié)果相符(圖4)。

圖4 陽(yáng)性克隆測(cè)序圖譜，箭頭所指為rs3840880位點(diǎn)定點(diǎn)突變結(jié)果為等位基因DEL

四、雙熒光素表達(dá)系統(tǒng)結(jié)果

使用Dual-Glo?luciferase assay system試劑盒，根據(jù)熒光信號(hào)強(qiáng)度檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的Hela細(xì)胞中pGL3-Basic質(zhì)粒表達(dá)的情況。將轉(zhuǎn)染有突變后基因的Hela細(xì)胞和轉(zhuǎn)染有未突變基因的Hela細(xì)胞與空白對(duì)照組的Hela細(xì)胞消化后，用PBS清洗打勻，分別取75 μl加入到已經(jīng)加入Dual-Glo?luciferase reagent的對(duì)應(yīng)的白板孔中混勻，15 min后螢火蟲(chóng)熒光素酶催化相應(yīng)底物產(chǎn)生熒光(R)。隨后加入海腎熒光素酶底物，檢測(cè)熒光值(F)，筆者取2次熒光比值(F/R)作為基因表達(dá)的參考(圖5)，以海腎熒光作為內(nèi)參來(lái)校正細(xì)胞狀態(tài)、檢測(cè)環(huán)境等對(duì)結(jié)果測(cè)定的影響。由圖5看出，ALOX-12基因不同功能的SNP對(duì)啟動(dòng)子活性的影響明顯不同，pGL3-Basic質(zhì)粒F/R=0.129，pGL3-rs3840880DEL質(zhì)粒F/R=0.194，pGL3-rs3840880DEL質(zhì)粒F/R=0.274，采用單因素方差分析，F(xiàn)=25.09，P=0.001，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 Basic為轉(zhuǎn)染空載體的熒光檢測(cè)結(jié)果；Allel DEL與Allel G分別為轉(zhuǎn)染pGL3-rs3840880DEL和pGL3-rs3840880G質(zhì)粒的熒光檢測(cè)結(jié)果

討 論

花生四烯酸是廣泛存在細(xì)胞膜磷脂雙分子層中的不飽和脂肪酸，當(dāng)細(xì)胞受到不同生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子等生理性或者病理性的刺激后，在磷脂酶A2的作用下花生四烯酸變?yōu)橛坞x狀態(tài)并在環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)、LOX的催化下生成相應(yīng)的代謝產(chǎn)物。LOX家族的成員眾多并且催化AA為炎癥介質(zhì)白細(xì)胞三烯(leukotriene，LTs)和HETE[7]。LOX基因亞型具有物種和組織特異性，除了在血小板內(nèi)能直接催化AA產(chǎn)生12-HETE以外，ALOX-12還可以催化中性粒細(xì)胞代謝產(chǎn)生脂氧素[8]。結(jié)核保護(hù)性免疫的產(chǎn)生既受宿主因素的調(diào)節(jié)，反映在不同個(gè)體在發(fā)生結(jié)核分枝桿菌感染后的免疫應(yīng)答反應(yīng)明顯不同，而在不同人群中對(duì)卡介苗的免疫保護(hù)效果也明顯不同；同樣，保護(hù)性免疫也受感染的結(jié)核分枝桿菌的影響，反映在不同毒力的菌株和用不同的細(xì)菌量誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答反應(yīng)不同。目前，與結(jié)核病密切相關(guān)基因的SNP的研究主要包括：模式識(shí)別受體類分子、干擾素家族及其相關(guān)基因、促炎細(xì)胞因子、抑炎細(xì)胞因子、趨化因子家族等五類，其中對(duì)于SNP趨化因子家族的研究與本研究有著密切的關(guān)系[9]。

本研究所針對(duì)的ALOX-12基因功能性SNPs位點(diǎn)rs3840880采用病例-對(duì)照策略發(fā)現(xiàn)。通過(guò)定點(diǎn)突變，筆者獲得了帶有rs3840880位點(diǎn)不同等位基因的熒光素表達(dá)載體，在前期統(tǒng)計(jì)學(xué)的基礎(chǔ)上研究功能性SNPs調(diào)控宿主的結(jié)核病易感機(jī)制。雙熒光素表達(dá)系統(tǒng)能反映出ALOX-12基因啟動(dòng)子的表達(dá)情況，不但用熒光內(nèi)參減少了細(xì)胞、操作環(huán)境變化對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，而且使用熒光比值更清晰準(zhǔn)確地對(duì)比出實(shí)驗(yàn)結(jié)果的變化。本實(shí)驗(yàn)所取得的成果將進(jìn)一步地揭示結(jié)核病發(fā)生發(fā)展的精確分子和免疫機(jī)制，為結(jié)核病易感人群的預(yù)防干預(yù)決策及結(jié)核病基因型特異性個(gè)體化治療提供一定理論依據(jù)。但是，由于ALOX-12基因的組織特異性，并且結(jié)核病是受多種因素影響發(fā)病的一種感染性疾病，因此關(guān)于結(jié)核病更全面的發(fā)病研究與臨床治療方案有待進(jìn)一步探索。

[1] 陳偉，夏愔愔，成詩(shī)明. 結(jié)核病疫情及對(duì)策. 中國(guó)防癆雜志，2012，34(9):611-613.

[2] Zumla A, Raviglione M, Hafner R, et al. Tuberculosis. N Engl J Med, 2013, 368(8):745-755.

[3] O’Garra A, Redford PS, McNab FW, et al. The immune response in tuberculosis. Annu Rev Immunol, 2013, 31:475-527.

[4] Yoshimoto T, Takahashi Y. Arachidonate 12-lipoxygenases. Prostaglandins Other Lipid Mediat, 2002, 68/69:245-262.

[5] Shen C, Wu XR, Wang BB, et al. ALOX5 is associated with tuberculosis in a subset of the pediatric population of North China. Genet Test Mol Biomarkers, 2013, 17(4):284-288.

[6] Tobin DM, Roca FJ, Oh SF, et al. Host genotype-specific therapies can optimize the inflammatory response to mycobacterial infections. Cell, 2012, 148(3):434-446.

[7] Xu R, Wang S, Li W, et al. Activation of peroxisome proliferator-activated receptor-γ by a 12/15-lipoxygenase product of arachidonic acid: a possible neuroprotective effect in the brain after experimental intracerebral hemorrhage. J Neurosurg, 2016， 14:1-10. [Epub ahead of print].

[8] Pabst T, Kortz L, Fiedler GM, et al. The plasma lipidome in acute myeloid leukemia at diagnosis in relation to clinical disease features. BBA Clin, 2017, 7:105-114.

[9] Caws M, Thwaites G, Dunstan S, et al. The influence of host and bacterial genotype on the development of disseminated disease withMycobacteriumtuberculosis. PLoS Pathog, 2008, 4(3): e1000034.

(本文編輯：薛愛(ài)華)

Molecular mechanism of functional single nucleotide polymorphisms regulated tuberculosis susceptibility

ZHUXiu-yun,WANGWen-fei,ZHANGPei-ze,ZHANGJie-yun,QIUZhi-hui,WANGZhao-qin,ZHANGMing-xia,DENGGuo-fang.

LungDiseaseMedicalCenter,ThirdPeople’sHospitalofShenzhen,GuangdongKeyLaboratoryforEmergingInfectiousDisease,Shenzhen518112,China

DENGGuo-fang，Email：jxxk1035@yeah.net

Objective To construct different genotype dual luciferase expression plasmid expressed the rs3840880 loci of promoter region located in arachidonic acid lipoxidase-12 (ALOX-12) gene, and to analyze the effects of this single nucleotide polymorphisms (SNP) onALOX-12 gene promoter activity and gene expression, in order to elucidate the molecular mechanism of functional SNP regulated tuberculosis susceptibility. Methods The 1700 bp fragments contained rs2840880 loci of promoter region located inALOX-12 gene were amplified with human genome DNA extracted from whole blood samples by PCR. The pGL3-Basic-rs3840880 DEL plasmids was obtained from pGL3-Basic plasmid constructed with the PCR products and the original plasmid by site-directed mutagenesis and transfected into human cervical carcinoma cell line(Hela). The relative fluorescence values were detected by the dual luciferase assay system. Results The pGL3-Basic-DEL plasmid from pGL3-Basic-G plasmid containing the rs3840880 loci of promoter region located in theALOX-12 gene by site-directed mutagenesis was obtained and sequenced successfully. The relative fluorescence ratio (F/R) were detected after two plasmids were transfected into Hela cell line. The fluorescence ratio of allele G (F/R=0.194) was lower than that of allele DEL (F/R=0.274), pGL3-Basic (F/R=0.129) with significant difference statistically (F=25.09，P=0.001). Conclusion The expression differences of fluorescence reporter gene in the plasmids constructed with different alleles and transfected into Hela cell line are significant statistically. It shows that functional SNP of ALOX-12 gene affect really the activity of promoter and regulate tuberculosis susceptibility.

Arachidonate 12-lipoxygenase； Polymorphism, single nucleotide； Fluorophotometry； Tuberculosis； Gene expression regulation, bacterial

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.08.004

國(guó)家自然科學(xué)基金(81500004)；廣東省自然科學(xué)基金(2015A030313692)；深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(JCYJ20160427152106244, JCYJ20160427153348709, JCYJ20150402111430658);深圳市衛(wèi)生計(jì)生系統(tǒng)科研項(xiàng)目(201501029)

518112 深圳市第三人民醫(yī)院肺病醫(yī)學(xué)中心 廣東省新發(fā)傳染病診治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

鄧國(guó)防，Email：jxxk1035@yeah.net

2017-06-19)