馬翔 魯艷芹 王延宙 劉軍龍 蘇學(xué)利 張遙 左清利 任秀智 韓金祥*

1. 濟(jì)南大學(xué)-山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟(jì)南 250022 2. 山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心，山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250062 3. 山東省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250021 4. 天津市武清區(qū)人民醫(yī)院，天津 301700

環(huán)狀RNA作為新型的非編碼RNA分子穩(wěn)定性高，存在范圍廣泛，具有高表達(dá)性、組織特異性以及良好的物種保守性。CircRNAs具有重要的調(diào)控功能，能作為miRNAs海綿功能分子[1]。在斑馬魚實(shí)驗(yàn)中，胚胎中超高表達(dá)CDR1as 可導(dǎo)致斑馬魚腦中腦體積減少，將人/鼠的CDR1as注射到斑馬魚中會(huì)出現(xiàn)與miR-7敲除相似的表型，CDR1as的表達(dá)水平與miR-7靶基因表達(dá)水平表現(xiàn)出一致性，表明CDR1as是miR-7的環(huán)狀抑制劑[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)circRNAs與阿茲海默癥、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病、癌癥等疾病的發(fā)生有關(guān)[4-8]。最新研究發(fā)現(xiàn)在一些癌癥(肺癌、胃癌)等疾病中對于篩選出差異性表達(dá)的circRNAs，通過結(jié)合臨床信息以及醫(yī)學(xué)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，認(rèn)為所篩選出的circRNAs具有作為疾病診斷潛在標(biāo)記物的可能性[9-11]。同時(shí)又有研究發(fā)現(xiàn)相比于其他組織血液中很多circRNAs分子表達(dá)穩(wěn)定性更高[12]，circRNAs所發(fā)揮的生物學(xué)功能和作為疾病診斷標(biāo)志物在臨床治療上的潛力是巨大的。

成骨不全(osteogenesisImperfecta，OI)是一種通過遺傳或者基因突變而產(chǎn)生的先天性骨骼發(fā)育障礙結(jié)蹄組織疾病[13-15]。通過對116種相關(guān)的miRNAs進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn) miR-21與miR-26a等11 種miRNAs在成骨不全血清中存在差異表達(dá)[16-18]。本文擬通過生物信息學(xué)預(yù)測，分析與成骨不全差異性表達(dá)miRNAs相互作用的circRNAs，同時(shí)探討circRNA-miRNA-靶基因之間的相互作用。

1 材料和方法

1.1 miRNAs-circRNAs相互作用的生物信息學(xué)預(yù)測與網(wǎng)絡(luò)分析

采用starbase軟件(http://starbase.sysu.edu.cn/)[19]分別對成骨不全血清中差異表達(dá)的miR-21、miR-26a、miR-29a、miR-29b、miR-30e、miR-34c、miR-133a、miR-145、miR-210、miR-489與miR-1297等 11 種miRNAs進(jìn)行生物信息學(xué)預(yù)測。采用Cytoscape 3.2.1(www.cytoscape.org)對在成骨不全血清中差異表達(dá)的上述11 種miRNAs通過starbase預(yù)測的141種circRNAs進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析[20]。參數(shù)設(shè)置：其中將circRNAs用圓形表示，miRNAs用正方形表示，節(jié)點(diǎn)的大小(圓的大小)代表該分子在網(wǎng)絡(luò)中的度(所對應(yīng)的miRNAs鄰居個(gè)數(shù))，顏色隨節(jié)點(diǎn)大小(圓的大小)由淺綠到深紅漸變。

1.2 miRNAs靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測與網(wǎng)絡(luò)分析

通過miRWalk軟件(http://www.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk)[21]對上述在成骨不全血清中差異表達(dá)的11 種miRNAs利用DIANA-mT、miRanda、miRDB、miRWalk、RNAhybrid、PICTAR4、PICTAR5、PITA、RNA22與TargetScan十個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測。對原始數(shù)據(jù)首先進(jìn)五個(gè)數(shù)據(jù)庫以上記錄的相互作用靶基因分析。將得到的靶基因采用Cytoscape 3.2.1[19](www.cytoscape.org)進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)分析。對預(yù)測的靶基因通過DAVID軟件(www.david.ncifcrf.gov)進(jìn)行pathway分析[22]。

2 結(jié)果

2.1 miRNAs-circRNAs相互作用的生物信息學(xué)預(yù)測與網(wǎng)絡(luò)分析

Starbase軟件對11種不同miRNAs所預(yù)測的靶circRNAs的總數(shù)量為222個(gè)，其中非重疊circRNAs為141個(gè)。

對預(yù)測出的circRNAs進(jìn)一步分析得出CPNE1_hsa_circ_000657與miR-26a、miR-34c、miR-30e和miR-1297等4種miRNAs相互作用；KIAA1586_hsa_circ_001439 與miR-29、amiR-29b、miR-34c和miR-133a等4種miRNAs相互作用；CYP4F3_hsa_circ_001395與miR-29a、miR-29b、miR-30e和miR-133a等4種miRNA相互作用；MIB1_hsa_circ_002013和MIB1_hsa_circ_000886與miR-29a、miR-29b、miR-34c和miR-145等4種miRNA相互作用。見圖1。14種circRNAs分別與3種不同的miRNAs共同相互作用。見表1、圖1。

2.2 miRNAs靶基因的生物信息學(xué)預(yù)測與網(wǎng)絡(luò)分析

MiRwalk對11種miRNAs靶基因預(yù)測結(jié)果中，對超過7個(gè)數(shù)據(jù)庫以上的三種情況進(jìn)行分析。分析得到超過7個(gè)數(shù)據(jù)庫記錄的靶基因總數(shù)為1297個(gè)，非重疊靶基因944個(gè)。超過8個(gè)數(shù)據(jù)庫記錄的靶基因總數(shù)為416個(gè)，非重疊靶基因312個(gè)。超過9個(gè)數(shù)據(jù)庫記錄的靶基因總數(shù)為91個(gè)，非重疊靶基因70個(gè)。

Cytoscape網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明7個(gè)以上數(shù)據(jù)庫記錄的MiRNA-Taget Gene相互作用中CNOT6節(jié)點(diǎn)最大，其次ABCE1，BCL11A，ELF2，EML5，NAV3，JARID2，KLF4，QKI這8個(gè)靶基因節(jié)點(diǎn)較大。8個(gè)以上數(shù)據(jù)庫記錄的MiRNA-Taget Gene相互作用中ELF2與 NAV3基因節(jié)點(diǎn)最大分別與4個(gè)miRNA相互作用，PTEN、TET1、KBTBD8、TRIB2、RLF、REV3L、SBF2、PAN3、RARB 9個(gè)靶基因節(jié)點(diǎn)較大分別與3種不同miRNA相互作用。9個(gè)以上數(shù)據(jù)庫記錄的MiRNA-Taget Gene相互作用中僅NAV3基因節(jié)點(diǎn)最大與3個(gè)不同miRNA相互作用，ADAMTS6、ANKRD13C、C5orf13、COL11A1等19個(gè)靶基因節(jié)點(diǎn)較大分別與2種miRNA相互作用。

目前為止有文獻(xiàn)紀(jì)錄與骨病相關(guān)的信號通主要包括WNT、OPG/RNAKL/RNAK、TGF-beta、MAPK、NOTCH信號通路等途徑[23-24]。將超過7個(gè)數(shù)據(jù)庫與9個(gè)數(shù)據(jù)庫預(yù)測所共有的信號通路為Focal adhesion、ECM-receptor interaction、TGF-beta signaling pathway、Notch signaling pathway、Tight junction、Axon guidance、Pathways in cancer、Wnt signaling pathway、Small cell lung cancer、mTOR signaling pathway。見表1。

表1 成骨不全差異性miRNAs靶基因的KEGG信號通路在7-9以上預(yù)測數(shù)據(jù)庫中的P值變化Table 1 P value in KEGG signaling pathways of involved genes predicted by more than 7-9 databases targeting differentially expressed miRNAs of OI

對以上除腫瘤相關(guān)信號通路外其余信號通路得到的靶基因進(jìn)行circRNA-miRNA-Target Gene分析表明，YES1基因與miR-133a、miR-145以及FAT1_hsa_circ_000713與LMNB2_hsa_circ_001499之間存在相互作用。PPP2CA與miR-29a、miR-29b、miR-133a以及KIAA1586_hsa_circ_001439之間存在相互作用。NTN4和SRGAP1與miR-26a、miR-145以及RFC1_hsa_circ_001649之間存在相互作用。見圖2。

圖2 成骨不全差異性miRNAs及其相互作用的circRNAs與靶基因的網(wǎng)絡(luò)分析Fig.2 Network analysis of the interaction among differentially expressed miRNAs of OI and predicted circRNAs and genes

圖3 成骨不全差異性miRNAs與其靶基因間相互作用網(wǎng)絡(luò)分析圖Fig.3 Network analysis between differentially expressed miRNAs of OI and predicted target genes

3 討論

本文分析預(yù)測出的4種差異性表達(dá)成骨不全miRNA所共有的MIB1_hsa_circ_000886等5種circRNA以及3種差異性成骨不全miRNA所共有的19種circRNA在成骨不全中的生物學(xué)作用仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。同時(shí)所預(yù)測得到的相關(guān)circRNAs能否作為成骨不全血清中差異表達(dá)的11種miRNA的海綿功能需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。通過對成骨不全血清中差異表達(dá)的11種miRNAs進(jìn)行circRNAs及其靶基因的預(yù)測得到在Tight junction信號通路中 YES1基因與miR-133a、miR-145以及FAT1_hsa_circ_000713與LMNB2_hsa_circ_001499之間存在相互作用，TGF-beta，WNT以及Tight junction信號通路中PPP2CA與miR-29a、miR-29b、miR-133a以及KIAA1586_hsa_circ_001439之間存在相互作用，Axon guidance 信號通路中NTN4和SRGAP1與miR-26a、miR-145以及RFC1_hsa_circ_001649之間存在相互作用，這些相互作用的circRNA-miRNA-靶基因是否在成骨不全疾病中發(fā)揮著海綿功能需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

YES1是一種致癌基因，與ATP結(jié)合，酶聯(lián)反應(yīng)，蛋白連接，表皮生長因子受體連接，離子通道綁定，受體結(jié)合等有關(guān)[25-26]。PP2A是一種絲/蘇氨酸磷蛋白磷酸酶，是一種多功能性蛋白酶，與細(xì)胞分裂周期和信號傳導(dǎo)相關(guān)。PP2A的催化亞基PP2Ac包括兩種亞型PP2CA和PP2CB，其在胚胎發(fā)育和阿茲海默癥和腫瘤等疾病中發(fā)揮著重要作用[27-29]。NTN4是一種蛋白編碼基因，發(fā)揮著laminin-1連接和蛋白連接的功能[30-31]。SRGAP1同樣也是蛋白編碼基因，發(fā)揮著GTPase激活功能，連接RacGTPase以及蛋白連接功能[32]。

骨的形成是通過成骨細(xì)胞合成骨基質(zhì)，分泌骨基質(zhì)，礦化骨基質(zhì)而來。而成骨細(xì)胞來源于多潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞，多潛能的間充質(zhì)干細(xì)胞存在于脂肪和骨髓中，其在兩種不同組織間的分化機(jī)制與多種生長因子和胞外信號通路相關(guān)，包括Wnt信號通路，OPG/RANKL/RANK、TGF-beta、MAPK、NOTCH、BMP信號通路，hedgehogs信號通路等[33-37]。Wnt信號通路中相關(guān)分子在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為成熟成骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞的增殖以及功能上發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)功能，這些信號通路中的相關(guān)分子與細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平，骨密度，骨量密切聯(lián)系[37]。緊密連接(Tight junction，TJ)在細(xì)胞旁途徑中發(fā)揮著重要作用，同時(shí)參與調(diào)解細(xì)胞通透性，該信號通路與很多生理，病理等發(fā)生密切相關(guān)[38]。軸突導(dǎo)向(Axon guidance)是神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程的一個(gè)分支[39]。TGF-beta 信號通路在胚胎發(fā)生，成骨細(xì)胞的分化與增殖，和軟骨損傷后的修復(fù)中發(fā)揮著重要的作用，同時(shí)影響多種組織的修復(fù)再生[34]。

小腦變性相關(guān)蛋白1的天然環(huán)狀反義轉(zhuǎn)錄物(antisense to the cerebellar degeneration-related protein1 transcript， CDR1as)中含有70個(gè)左右miRNA-7的結(jié)合位點(diǎn)，并且與相應(yīng)的miRNA所作用的靶基因在表達(dá)水平上表現(xiàn)出一致性，作為miRNA的環(huán)狀抑制劑發(fā)揮著miRNA海綿功能，Y染色體性別決定區(qū)(sex-determining region Y，SRY)中含有16個(gè)miR-138的結(jié)合位點(diǎn)，同樣發(fā)揮著miRNA海綿功能[2-3]。通過對成骨不全血清中差異表達(dá)的11種miRNAs進(jìn)行circRNAs及其靶基因的預(yù)測分析得到上述結(jié)果，所預(yù)測得到的相關(guān)circRNA-miRNA-靶基因中相關(guān)circRNA是否作為miRNA海綿功能影響相應(yīng)靶基因表達(dá)進(jìn)而在成骨不全疾病的發(fā)生以及發(fā)展中發(fā)揮著重要作用仍需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究。