王濟(jì)緯張寧蘭俊許榮成鄧連成陳科鄢連和雷后興

畬藥嘎狗嚕對肢體缺血再灌注損傷模型大鼠凝血功能影響研究

王濟(jì)緯1張寧1蘭俊1許榮成2鄧連成1陳科2鄢連和3雷后興3

目的觀察嘎狗嚕水煎液對肢體缺血再灌注損傷模型大鼠凝血功能的影響。方法SD大鼠30只，采用阻斷股動脈建立肢體缺血再灌注損傷大鼠模型。隨機(jī)分為治療組、假手術(shù)組、模型組，各10只，分別以嘎狗嚕全草水煎液和等劑量生理鹽水灌胃。全自動血凝分析儀檢測各組大鼠凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、纖維蛋白原（Fib）、血漿凝血酶時間（TT）；全自動生化分析儀測定血清乳酸脫氫酶（LDH）及肌肝（Cr）等指標(biāo)。結(jié)果與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PT和APTT顯著縮短[（9.03±0.74）s比（9.89±0.72）s，（20.45±1.70）s比（24.24±5.41）s，P＜0.05）]，F(xiàn)ib含量增加[（1.86±0.17）g/L比（1.67±0.22）g/L，P＜0.05]，TT變化不顯著（P＞0.05）；LDH、Cr含量顯著增高[（791.10±213.6）U/L比（526.50±182.33）U/L，（32.44±6.47）μmol/L比（26.85±4.09）μmol/L，P＜0.01，P＜0.05]。與模型組比較，治療組大鼠PT[（10.15±0.78）s]和APTT[（25.36±2.08）s]顯著延長（P＜0.01），而Fib含量無明顯差異（P＞0.05），TT[（20.65±3.03）s比（24.94±2.41）s]顯著縮短（P＜0.01）；LDH [（573.90±142.37）U/L]、Cr[（24.34±5.92）μmol/L]含量顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。結(jié)論嘎狗嚕能夠通過改善凝血/纖溶功能及代謝環(huán)境，有效減輕肢體缺血再灌注損傷大鼠的損害程度。

大鼠：缺血再灌注；凝血功能；嘎狗嚕

肢體缺血再灌注損傷是臨床創(chuàng)傷救治過程中常見的病理過程，組織缺血缺氧性損傷不僅發(fā)生在缺血時，更重要的是發(fā)生在再灌注后[1]，長時間嚴(yán)重缺血患者血運(yùn)恢復(fù)后肢體及全身組織器官的損傷反而會加重，表現(xiàn)為凝血功能紊亂、組織壞死、細(xì)胞凋亡等，嚴(yán)重者甚至危及生命。如何減輕再灌注損傷是創(chuàng)傷臨床的一項重要工作。畬藥嘎狗嚕（地稔）具有清熱解毒，活血止血作用[2]，本實(shí)驗將嘎狗嚕應(yīng)用于實(shí)驗性肢體缺血再灌注損傷大鼠，探討有效減少肢體再灌注損傷的方法。

1 實(shí)驗材料

1.1 實(shí)驗動物8周齡清潔級健康SD大鼠（體質(zhì)量200～250g）30只，雌雄不限，溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗動物中心提供。許可證號：SYXK（浙）2010-0150。適應(yīng)性飼養(yǎng)，實(shí)驗前夜禁食，自由飲水。隨機(jī)分為治療組、假手術(shù)組、模型組，各10只。

1.2 畬藥配置嘎狗嚕全草由麗水市畬族醫(yī)藥研究所提供。取嘎狗嚕原藥材1000g剪碎后分別以10倍量、8倍量、6倍量水煎煮3次，每次30min，合并3次煎煮液濾過、離心，濃縮成1g生藥/mL的嘎狗嚕濃縮液，置于冰箱冷藏備用。實(shí)驗用嘎狗嚕水煎液由嘎狗嚕濃縮液+純水稀釋配制而成，濃度為0.2g/mL。灌胃劑量為1次10mL/kg，1天灌胃1次。

1.3 實(shí)驗儀器南京SOPTOP舜宇顯微鏡ST60，上海手術(shù)器械廠800型離心機(jī)，Beckman Coulter Au 5800型全自動生化分析儀，ACLTOP300CTS全自動血凝分析儀。

2 實(shí)驗方法

2.1 造模及給藥方法大鼠術(shù)前12h禁食，自由飲水，術(shù)前10%水合氯醛3mL/kg腹腔內(nèi)注射麻醉。每2h追加一次維持麻醉，劑量減半。麻醉成功后，大鼠仰臥位，四肢固定于木板上，取右腹股溝切口，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，剪開皮膚，在手術(shù)顯微鏡下顯露股動、靜脈及股神經(jīng)，分離出右側(cè)股動脈，予無創(chuàng)動脈夾夾閉，顯微鏡下確認(rèn)阻斷動脈血流后，縫合切口，再次消毒。同時予以右大腿根部橡皮帶環(huán)扎，以棉簽桿為杠桿調(diào)整松緊度，阻斷側(cè)支循環(huán)，通過觀察大鼠右后肢趾端皮膚顏色及皮溫，并與左側(cè)對比來判斷是否已阻斷側(cè)支循環(huán)，完全阻斷動脈血供后，可見趾端皮膚青紫，發(fā)涼。4h后松解橡皮帶，取出動脈夾，在手術(shù)顯微鏡下檢查血管是否恢復(fù)通暢，以確認(rèn)恢復(fù)右下肢血流灌注。假手術(shù)組僅單純游離腹主動脈，不阻斷，縫合皮膚。

治療組造模后第二天開始以嘎狗嚕全草水煎液灌胃，假手術(shù)組與模型組術(shù)后連續(xù)等劑量生理鹽水灌胃，1天1次，共5天。第6天三組動物麻醉后，心尖取血，實(shí)驗檢測。

2.2 凝血功能檢測大鼠心尖采血1.8mL置于含有3.8%構(gòu)椽酸鈉真空采血管中，及時采用ACLTOP 300CTS全自動血凝分析儀檢測凝血功能：凝血酶原時間（PT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）、纖維蛋白原（Fib）、血漿凝血酶時間（TT）。

2.3 血清乳酸脫氫酶（LDH）及血清肌酐（Cr）檢測大鼠心尖采血4mL入促凝管（促凝劑+分離膠），靜置30min待血清部分析出后，予離心機(jī)離心，3000rpm，10min。分離血清后采用Beckman Coulter Au 5800型全自動生化分析儀測定血清LDH和Cr值。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清LDH、Cr含量比較與假手術(shù)組比較，模型組LDH、Cr含量均明顯升高（P＜0.05，P＜0.01），說明造模成功。與模型組比較，治療組血清LDH、Cr明顯降低（P＜0.05，P＜0.01），見表1。

表1 各組大鼠血清LDH、Cr含量比較（）

表1 各組大鼠血清LDH、Cr含量比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；LDH：乳酸脫氫酶；Cr：血清肌酐

組別假手術(shù)組模型組治療組鼠數(shù)10 10 10 LDH（U/L）526.50±182.33 791.10±213.68** 573.90±142.37△Cr（μmol/L）26.85±4.09 32.44±6.47* 24.34±5.92△△

3.2 各組大鼠凝血功能比較與假手術(shù)組比較，模型組PT和APTT明顯縮短（P＜0.05），F(xiàn)ib含量增加（P＜0.05），TT變化不顯著（P＞0.05）。與模型組比較，治療組PT和APTT延長（P＜0.01），F(xiàn)ib含量無明顯差異，TT縮短（P＜0.01）。治療組各項指標(biāo)與假手術(shù)組差異不明顯（P＞0.05），見表2。

表2 各組大鼠凝血功能比較（）

表2 各組大鼠凝血功能比較（）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，與模型組比較，△△P＜0.01；PT：凝血酶原時間，APTT：活化部分凝血活酶時間；FIB：纖維蛋白原；TT：血漿凝血酶時間。

組別假手術(shù)組模型組治療組鼠數(shù)10 10 10 PT（s）9.89±0.72 9.03±0.74* 10.15±0.78△△APTT（s）24.24±5.41 20.45±1.70* 25.36±2.08△△Fib（g/L）1.67±0.22 1.86±0.17* 1.70±0.39 TT（s）22.97±4.32 24.94±2.41 20.65±3.03△△

4 討論

嘎狗嚕（melastoma dodecandrum），又名地稔或地菍，屬野牡丹科（melastomaceae），其根及全株入藥，分布于長江以南各省區(qū)，臨床用于治療高熱、腫痛、咽喉腫痛、牙痛、赤白血痢疾、黃疸、水腫、痛經(jīng)、崩漏、帶下、疔瘡、毒蛇咬傷等病癥[3]，亦有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，嘎狗嚕具有明顯的鎮(zhèn)痛抗炎作用[4]。臨床研究證明，嘎狗嚕含有多糖、黃酮類、氨基酸、酚類、常量和微量元素、色素等多種化學(xué)成分[5-6]，具有活血止血功能[7]，其所含的多糖和黃酮成分具有清除氧自由基、抑制人紅細(xì)胞膜和肝線粒體脂質(zhì)過氧化作用[8-9]。

生理性止血過程主要包括血管收縮、血小板血栓形成和血液凝固三個過程，凝血系統(tǒng)的啟動推動著血液凝固。內(nèi)外源性凝血因子按照一定的順序相繼激活生成凝血酶，使可溶性的纖維蛋白原轉(zhuǎn)變?yōu)椴蝗苄缘睦w維蛋白，纖維蛋白交織成網(wǎng)，最后形成血凝塊，促進(jìn)凝血。而血凝塊的溶解又主要依賴于纖維蛋白溶解系統(tǒng)（纖溶系統(tǒng)），當(dāng)纖溶系統(tǒng)活動亢進(jìn)時，則導(dǎo)致凝血不徹底，有再出血的可能；纖溶系統(tǒng)低下，又易引起血液高凝，進(jìn)而發(fā)生血栓性疾病。正常情況下，凝血和纖溶之間保持動態(tài)平衡。肢體缺血再灌注損傷會觸發(fā)多系統(tǒng)、多途徑參與的全身炎性反應(yīng)綜合征（SIRS）[10]，造成代謝障礙及凝血功能障礙，同時伴發(fā)器官功能障礙或衰竭，嚴(yán)重者造成死亡。缺血再灌注后出現(xiàn)纖溶酶原激活劑活性下降，凝血酶原時間（TT）、活化部分凝血活酶時間（APTT）縮短，提示肢體缺血再灌注對機(jī)體凝血和纖溶系統(tǒng)有顯著的影響，造成血液高凝狀態(tài)，同時抑制纖溶活性[11]。APTT和PT主要反映內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)狀況，本實(shí)驗中，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠APTT和PT均顯著縮短，F(xiàn)IB含量上升（P＜0.05），提示缺血再灌注損傷引起大鼠的凝血因子的活性增高，血液呈高凝狀態(tài)。而與模型組比較，治療組大鼠APTT和PT均顯著延長，TT縮短（P＜0.01），表明嘎狗嚕水煎液能影響纖溶系統(tǒng)活性，改善血液高凝狀態(tài)，且對內(nèi)、外源性凝血功能都有影響。

骨骼肌細(xì)胞受到損傷時，細(xì)胞膜通透性增高，正常情況下位于細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放到細(xì)胞外進(jìn)入血液循環(huán)，引起血清LDH和Cr的增高[12]。本研究中，模型組大鼠LDH及Cr含量均顯著高于假手術(shù)組（P＜0.05，P＜0.01），而接受嘎狗嚕水煎液處理后，治療組大鼠LDH及Cr含量明顯下降（P＜0.05，P＜0.01），進(jìn)一步提示嘎狗嚕具有減輕炎癥反應(yīng)的作用，可能與其具有抗氧化、清除氧自由基的機(jī)制有關(guān)。

［1］SkyschallyA，Schulz R，Heusch G.Pathophysiology of myocardial infarction:Protection by ischemic pre-and postconditioning［J］.Herz，2008，33（2）：88-100.

［2］雷后興，李水福，鄭宋明，等中國畬族醫(yī)藥學(xué)［M］.北京:中國中醫(yī)藥出版社，2007:302

［3］國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會.中華本草［M］.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999：628.

［4］雷后興，鄢連和，李水福，等.畬藥地稔水煎液的鎮(zhèn)痛抗炎作用研究［J］.中國民族醫(yī)藥雜志，2008，3（3）：45-47.

［5］翟小玲，倪健，谷雨龍.大孔吸附樹脂分離地菍總酚的研究［J］.中草藥，2008，39（2）：196.

［6］張超，陳志成，姚惠珍.地菍水溶性多糖MD1的分離純化及組成分析［J］.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，30（2）：21.

［7］周添濃.地稔注射液對家兔血液的影響［J］.廣州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，1995，12（1）：40.

［8］張超，姚惠珍，徐蘭琴.地菍多糖MD1清除活性氧自由基及對人紅細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用影響的研究［J］.廣州醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2002，30（4）：18.

［9］張超，張婷，姚慧珍，等.地菍總黃酮體外抗小鼠肝線粒體脂質(zhì)過氧化作用的研究［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23（9）：1680.

［10］Thorey F，Stukenborg-Colsman C，Windhagen H，et al.The effect of tourniquet release timing on perioperative blood loss in simultaneous bilateral cemented total knee arthroplasty：a prospective randominzed study［J］.Technol Health Care，2008，16（2）：85-92.

［11］陳雷，沈斌，金可可，等.肢體缺血再灌注家兔凝血和纖溶系統(tǒng)的變化及葛根素的干預(yù)［J］.中醫(yī)藥學(xué)刊2006，24（6）：1040-1042.

［12］張彥榮，吳文新，張峰，等.缺血后處理對大鼠后肢肌肉缺血再灌注損傷作用的實(shí)驗研究［J］.疑難病雜志，2010，9（12）：894-896.

（收稿：2016-09-07修回：2016-12-28）

Biological Effects of Melastoma Dodecandrum Lour on Coagulation Function in Rats with Limb Ischemia-reperfusion Injury

WANG Jiwei1,ZHANG Ning1,LAN Jun1,XU Rongcheng2,DENG LianCheng1,CHEN Ke2, YAN Lianhe3,LEI Houxing3.1 Lishui People's Hospital，Lishui(323000),China;2 Wenzhou Medical University, Wenzhou(325035),China;3 Lishui Institute of She-national Medicince,Lishui(323000),China

Objective To study the biological effects of Melastoma dodecandrum Lour on coagulation function in rats after limb ischemia-reperfusion.Methods Thirty SD rats were randomly divided into sham group,control group, and Melastoma dodecandrum Lour group.Model of limb ischemia reperfusion injury was made by using the method of blocking blood flow femoral artery of rats in control group and Melastoma dodecandrum Lour group.Prothrombin time（PT）,activated partial thromboplastin time（APTT）,fibrinogen（Fib）,thrombin time（TT）,serum lactate dehydro genase（LDH）and creatinine（Cr）in blood of rats in each group were detected.Results Compared with sham group,PT and APTT in model group were shortened respectively（9.03±0.74s vs 9.89±0.72s;20.45±1.70s vs 24.24± 5.41s,P＜0.05）,Fib increased（1.86±0.17g/L vs 1.67±0.22g/L,P＜0.05）,but TT was not significantly different（P＞0.05）;model group had also higher LDH（791.10±213.6U/L vs 526.50±182.33U/L,P＜0.01)and Cr（32.44±6.47μmol/ L vs 26.85±4.09μmol/L,P＜0.05）.Melastoma dodecandrum Lour prolonged PT（10.15±0.78s）and APTT（25.36± 2.08s）in rats with ischemia reperfusion injury（P＜0.01）,reduced TT（20.65±3.03s vs 24.94±2.41s,P＜0.01）and LDH（573.90±142.37U/L,P＜0.01）and Cr（24.34±5.92μmol/L,P＜0.05）,but did not affect Fib（P＞0.05）.Conclusion Melastoma dodecandrum Lour can effectively reduce the degree of injury in rats with limb ischemia/reperfusion injury through improving blood coagulation/fibrinolysis function and the environment of metabolism.

rats;ischemia-reperfusion；coagulation function；Melastoma dodecandrum Lour

浙江省麗水市重點(diǎn)創(chuàng)新團(tuán)隊項目（No.2012CXTD09-06）

1浙江省麗水市人民醫(yī)院創(chuàng)傷骨科（王濟(jì)緯、蘭俊）、重癥醫(yī)學(xué)科（張寧）、藥劑科（鄧連成）（麗水323000）；2溫州醫(yī)科大學(xué)（溫州325035）；3浙江省麗水市畬族醫(yī)藥研究所（麗水323000）

雷后興，E-mail：zjleihx@163.com