唐璽和 李 默 王淑艷 李鵬燕 張 愚 陳志國(guó)* 陳 惠
(1. 中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100053; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞治療室,北京 100053;3. 北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷和修復(fù)所,北京 100053; 4. 北京神經(jīng)損傷和康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100053)
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人外周血單個(gè)核細(xì)胞體外重編程為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞研究
唐璽和1,2,3,4李 默2,3王淑艷2,3李鵬燕2,3張 愚2,3陳志國(guó)2,3*陳 惠1,3,4*
(1. 中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)研究所,北京 100053; 2. 首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院細(xì)胞治療室,北京 100053;3. 北京腦重大疾病研究院神經(jīng)損傷和修復(fù)所,北京 100053; 4. 北京神經(jīng)損傷和康復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 100053)
目的 利用非整合質(zhì)粒載體在體外將成人外周血中單個(gè)核細(xì)胞重編程為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte progenitor cells, OPCs)。方法 經(jīng)外周靜脈采集志愿者血液5 mL,利用Ficoll-Paquem密度梯度離心法獲得單個(gè)核細(xì)胞,體外擴(kuò)增培養(yǎng)后,電轉(zhuǎn)染攜帶外源基因(OCT4,SOX2,KLF4,C-myc,LIN28,Nanog)的質(zhì)粒,然后在加有化學(xué)小分子的特定培養(yǎng)基中分三步培養(yǎng)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染后30 d左右,可以獲得血小板衍生生長(zhǎng)因子受體α(platelet-derived growth factor receptor-α, PDGFR-α)陽性的早期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Pre-OPC),該細(xì)胞能傳20 代以上,繼續(xù)分化30 d左右可以獲得表達(dá)O4的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。結(jié)論 利用非整合質(zhì)粒載體攜帶外源基因可以將成人外周血單個(gè)核細(xì)胞在較短期時(shí)間內(nèi)重編程為具有增生能力的早期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞,且能繼續(xù)分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。
外周血單個(gè)核細(xì)胞;重編程;少突膠質(zhì)前體細(xì)胞
中樞神經(jīng)系統(tǒng)少突膠質(zhì)細(xì)胞損傷及脫髓鞘疾病,如多發(fā)性硬化、脊髓損傷等可以發(fā)生在嬰兒及成人。脫髓鞘發(fā)生后將直接導(dǎo)致神經(jīng)信號(hào)傳導(dǎo)功能障礙及神經(jīng)元凋亡,其致殘率及致死率極高[1]。內(nèi)源性少突膠質(zhì)細(xì)胞再生或者移植外源少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行髓鞘重建是可選的治療方法,已有實(shí)驗(yàn)[2]證明內(nèi)源性少突膠質(zhì)細(xì)胞的再生能力及髓鞘重建能力有限,而移植外源的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(oligodendrocyte progenitor cells, OPCs)能在小鼠體內(nèi)形成髓鞘[3-4],因此,移植外源少突膠質(zhì)細(xì)胞治療脫髓鞘性疾病成為近年研究的熱點(diǎn),而如何獲得有功能的可用于移植的人少突膠質(zhì)前體細(xì)胞成為該研究的核心。
從流產(chǎn)胎腦中獲取少突膠質(zhì)前體細(xì)胞不但受倫理限制,而且獲取的細(xì)胞量有限。2007年,Tatahashi等[5]將人皮膚成纖維細(xì)胞重編程為多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)使得自體細(xì)胞移植成為可能。目前,將iPSCs成功分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞已經(jīng)實(shí)現(xiàn)[6-8],但是,經(jīng)由iPSCs獲取少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的周期較長(zhǎng),均在3個(gè)月以上,不利于臨床應(yīng)用;獲取人成纖維細(xì)胞創(chuàng)傷性較大,有合并感染風(fēng)險(xiǎn),病人不易接受。
本研究將利用非整合質(zhì)粒載體攜帶外源基因及化學(xué)小分子將人外周血單個(gè)核細(xì)胞重編程為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞,縮短了誘導(dǎo)周期,該方法是一種無創(chuàng),快捷的獲取少突膠質(zhì)前體細(xì)胞的方法。
1.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞的獲取及擴(kuò)增
本研究已獲得首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。室溫下,采集成人志愿者外周靜脈血5 mL儲(chǔ)存在含有肝素的抗凝管中,上下顛倒混勻5次。按1∶2使用PBS稀釋,存放在50 mL離心管中,稀釋后血液用PBS補(bǔ)足至35 mL。另取50 mL離心管盛15 mL Ficoll-Paque Premium,然后傾斜45°,將稀釋的血液緩慢流入到盛Ficoll-Paque Premium管中。25 ℃,離心30 min,離心速度為750 g,離心時(shí),離心機(jī)制動(dòng)需關(guān)閉。 離心后在離心管中上層為血漿樣物,中間云霧狀細(xì)胞即為所需要的單個(gè)核細(xì)胞層。用巴斯特管吸去上層,然后使用移液管將中間的云霧狀細(xì)胞層移至另外50 mL離心管中。在獲得的細(xì)胞層中加入30 mL PBS,350 g,4 ℃,離心10 min,此時(shí)離心機(jī)制動(dòng)要打開。吸去上清,將細(xì)胞重懸在25 mL PBS中。4 ℃,300 g,離心10 min。吸去上清,將細(xì)胞重懸在25 mL PBS中。4 ℃,300 g,離心10 min。去上清,將細(xì)胞重懸在5 mL PBS中,計(jì)數(shù)。繼續(xù)在單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)基中擴(kuò)增,具體步驟如下:轉(zhuǎn)染當(dāng)日計(jì)為Day-0,采血當(dāng)日為Day-14,Day-14將離心所得的單個(gè)核細(xì)胞以2×106/mL重懸在單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)基中,37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO2孵育2 d。Day-11收集細(xì)胞,離心,200 g,去上清,將細(xì)胞按1×106/mL重懸在單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)基中,孵育3 d。 Day-8收集細(xì)胞,離心,200 g,去上清,將細(xì)胞按1×106/mL重懸在單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)基中,孵箱中孵育4 d。Day-4收集細(xì)胞,離心,200 g,去上清,將細(xì)胞按1×106/mL 重懸在單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)基中,孵育4 d。此時(shí),單個(gè)核細(xì)胞數(shù)量略增加,細(xì)胞體積較前增大。
1.2 試劑
質(zhì)粒oriP/EBNA-1購(gòu)買于美國(guó)Addgenes公司;Ficoll-Paque Premium購(gòu)自美國(guó)GE公司;Human CD34 + cell nucleofection kit購(gòu)自瑞士Lonzawc ngk 公司。
1.3 儀器
肝素抗凝采血管購(gòu)買自BD公司;可控制溫度的高速離心機(jī)購(gòu)自美國(guó)Beckman Coulter;50 mL離心管,6孔板,12孔板均購(gòu)買自美國(guó)Corning公司;細(xì)胞計(jì)數(shù)板購(gòu)自美國(guó)Invitroge公司;液氮凍存罐購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher公司;細(xì)胞電轉(zhuǎn)儀購(gòu)自瑞士Amaxa/Lonza公司;激光共聚焦顯微鏡購(gòu)自德國(guó)Lecias公司;倒置顯微鏡 Nikon TS100/100-F購(gòu)自日本Nikon公司。
1.4 培養(yǎng)基配制
單個(gè)核細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)基配制方法參見文獻(xiàn)[9]。
1)第一階段誘導(dǎo)培養(yǎng)基:DMEM/F12 48%,Neural basal 48%, N2 1%,B27 1% Glutamine 1%, 非必須氨基酸(non-essential amino acid, NEAA)1%,重組人白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor, LIF)10 μg/L 購(gòu)自美國(guó)Millpore公司;SB431542 2 μmol/L及CHIR99021 3 μmol/L 購(gòu)自美國(guó) Geneoperation公司。
2)第二階段培養(yǎng)基:DMEM/F12 48%,Neural basal 48%, N2 1%,B27 1%,Glutamine 1%, NEAA 1%,SAG1 1 μmol/L 購(gòu)自美國(guó)Enzo公司,重組人血小板衍生長(zhǎng)因子AB(recombinant human platelet-derived growth factor-AB,PDGF-AB) 20ng/mL 購(gòu)自Peprotech公司,反維甲酸(retinoic acid, RA) 1μmol/L 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司,bFGF10 μg/L。
3)第三階段培養(yǎng)基:DMEM/F12 48%,Neural basal 48%,N2 1%,B27 1%,Glutamine 1%, NEAA 1%,T3 60 ng/mL 購(gòu)自Sigma-Aldrich公司,cAMP 1 mmol/L,購(gòu)自Sigma-Aldrich,SAG1 1 μmol/L,PDGF-AB 20 ng/mL。
1.5 外周血單個(gè)核細(xì)胞轉(zhuǎn)染及少突膠質(zhì)前體細(xì)胞誘導(dǎo)
收集擴(kuò)增后的單個(gè)核細(xì)胞,將2×106單個(gè)核細(xì)胞重懸在5 mL PBS中,室溫,離心5 min,200 g,去上清后重懸在100 μL的人CD34+細(xì)胞轉(zhuǎn)染液。在以上混合液中加入3種質(zhì)粒,每種質(zhì)粒各2 μg。使用LONZA試劑盒中配的移液管將以上混合液轉(zhuǎn)移至電轉(zhuǎn)染杯中。將電轉(zhuǎn)杯放置在電轉(zhuǎn)儀中,使用T-160程序。電轉(zhuǎn)程序結(jié)束后,使用LONZA試劑盒配的移液管將電轉(zhuǎn)后的懸液移至事先在12孔板的1個(gè)孔中放置的2 mL單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)基中,放置在孵箱中37 ℃,5%(體積分?jǐn)?shù))CO22 d。之后在誘導(dǎo)第一階段培養(yǎng)基中培養(yǎng)至克隆出現(xiàn)后10 d左右。緊接著使用第二階段誘導(dǎo)培養(yǎng)2周,取部分細(xì)胞染色鑒定;第三階段培養(yǎng)基培養(yǎng)4周。
1.6 免疫組織化學(xué)染色
吸去細(xì)胞培養(yǎng)基,使用PBS洗3遍,冰冷的 4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) 多聚甲醛固定 10 min,洗滌后用 0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))Triton-X100破膜3次,每次5 min,室溫下用 3%(體積分?jǐn)?shù))驢血清室溫封閉 1 h 后,然后加入相應(yīng)的第一抗體:兔源抗Ki-67 ( 1∶500,美國(guó)Millipore公司) 、小鼠源抗 O1 ( 1∶300,美國(guó)Ebioscience 公司) 、小鼠源抗 O4 ( 1∶200,美國(guó)Stanta Cruz 公司),兔源性抗PDGFR-α( 1∶200,美國(guó)Stanta Cruz 公司) 、小鼠源性抗 A2B5( 1∶200,美國(guó)Abcam 公司),兔源性抗GFAP(1∶500,美國(guó) Dako公司)4 ℃ 過夜。PBS 清洗 3 次后,然后加入 Alexa Fluor 488 (綠)標(biāo)記的驢抗兔 IgG( 1∶1 000,美國(guó)Invitrogen公司), Alexa Fluor 488 (綠)標(biāo)記的驢抗小鼠 IgM ( 1∶1 000,美國(guó)Invitrogen公司 ),Alexa Fluor 594 (紅)標(biāo)記的驢抗小鼠IgG( 1∶ 800,美國(guó)Invitrogen公司 ), Alexa Fluor 594 (紅)標(biāo)記的驢抗小鼠IgM( 1∶ 800,美國(guó)Invitrogen公司 ),Alexa Fluor 647標(biāo)記的驢抗兔IgG( 1∶ 800,美國(guó)Invitrogen 公司)的第二抗體,室溫避光孵育2 h,然后加入 DAPI( 0.5 mg/L) 進(jìn)行細(xì)胞核染色,室溫避光孵育20 min,洗滌后以50%(體積分?jǐn)?shù))甘油溶液封片。
1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法
2.1 轉(zhuǎn)染后30 d內(nèi)獲得早期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Pre-OPCs)
外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外擴(kuò)增2周后形態(tài)均一(圖1A、B),轉(zhuǎn)染后第10 天,可以獲得成團(tuán)聚集的細(xì)胞(圖1C),該細(xì)胞可以繼續(xù)擴(kuò)增,在轉(zhuǎn)染20 d左右,更換為第二階段培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)2周左右,光鏡下可見多個(gè)突起的細(xì)胞(圖1D),進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色,可見PDGFR-α和A2B5陽性的細(xì)胞(圖1E、F)。此時(shí),PDGFR-α陽性細(xì)胞數(shù)比例為(26.2±2.7)%和A2B5陽性細(xì)胞數(shù)比例為(5.5±2.5)%(圖1G)。
圖1 將人外周血單個(gè)核細(xì)胞重編程為早期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞
A:schematic drawing of Pre-OPC generation procedure;B:adult human peripheral blood mononuclear cells were cultured for 14 days before transfection;C:a compacted colony appeared 10 days after transfection;D: Pre-OPC appeared 30 days after transfection;E: Pre-OPC express PDGFR-α;F: Pre-OPC express A2B5;G:percentage of PDGFR-α positive cells and A2b5 positive cells;Scale bars: 50 μm; OPCs:oligodendrocyte progenitor cells;PDGFR-α: platelet-derived growth factor receptor-α.
2.2 RA可以促進(jìn)少突膠質(zhì)前體細(xì)胞形成
在第二階段培養(yǎng)基中不加RA組作為對(duì)照。在第二階段培養(yǎng)基分化2周后,RA組PDGFR-α陽性的細(xì)胞數(shù)(21.0±1.5)%較無RA組(3.2±1.4)%明顯增多(圖2A、B)。
2.3 早期少突膠質(zhì)細(xì)胞可以繼續(xù)分化為具有增生能力的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞
第三階段分化培養(yǎng)基分化4周后,可見O1陽性的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(圖3A~D),除了O1陽性的細(xì)胞,還有部分細(xì)胞表達(dá)GFAP (圖3B)。同時(shí)部分O4陽性的細(xì)胞同時(shí)表達(dá)ki-67(圖3E~H)。
圖2 反維甲酸可以促進(jìn)血小板衍生生長(zhǎng)因子受體-α(PDGFR-α)陽性的細(xì)胞產(chǎn)生
A:immunostaining of cells cultured in medium added with RA or without RA. Scale bars: 50 μm; B:percentage of PDGFR-αpositive cells grown in medium with RA or without RA;PDGFR-α: platelet-derived growth factor receptor-α.
圖3 早期少突膠質(zhì)前體細(xì)胞可分化為成熟的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞
A-D: OPC expresses O1 and partly are GFAP positive;E-H: OPC expresses O4 and partly are Ki-67 positive; Scale bars: 50 μm;OPCs:oligodendrocyte progenitor cells.
少突膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)正常功能的維護(hù)以及損傷后的修復(fù)有極其重要的意義,目前,將iPSCs分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞已經(jīng)獲得成功[10-11]。Wang等[7]用健康人iPSCs來源的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞治療免疫缺陷小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘模型,有明顯治療作用。Douvaras等[8]將多發(fā)性硬化病人皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPSCs并分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞,移植到脫髓鞘小鼠模型中后發(fā)現(xiàn)其能成熟并形成髓鞘。以上結(jié)果均說明體細(xì)胞重編程技術(shù)獲得的少突膠質(zhì)細(xì)胞是具有功能的,有細(xì)胞治療的潛力。但是從iPSCs分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞的周期很長(zhǎng),Wang等[7]將iPSCs分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞需要150 d。也有研究者[4,12-13]直接利用轉(zhuǎn)分化技術(shù)獲得少突膠質(zhì)前體細(xì)胞:Yang等[4]在小鼠和大鼠的皮膚成纖維細(xì)胞中直接轉(zhuǎn)入外源因子SOX10、Olig2和Zfp536可以將其轉(zhuǎn)分化為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞,并繼續(xù)分化為有功能的成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞;Najm等[12]應(yīng)用Nkx6.2,SOX10,Olig2將小鼠肺成纖維細(xì)胞重編程為少突膠質(zhì)細(xì)胞。但是均沒有報(bào)道同樣的方法在人源起始細(xì)胞中存在作用,而且,直接轉(zhuǎn)分化很難逃脫“表觀遺傳記憶”現(xiàn)象[13]。本研究中,所轉(zhuǎn)入的外源因子OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC、LIN28、NANOG后是將成體細(xì)胞重編程為一個(gè)多能的狀態(tài),這樣可見減弱“表觀遺傳記憶效應(yīng)”,然后再利用化學(xué)小分子,將其誘導(dǎo)為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。
一直以來,皮膚成纖維細(xì)胞被用做體細(xì)胞重編程的起始細(xì)胞被廣泛接受,但是就實(shí)際應(yīng)用來講,皮膚成纖維細(xì)胞并不是最佳選擇。首先,獲取人成纖維細(xì)胞是一個(gè)有創(chuàng)的過程;第二,成纖維細(xì)胞在體外傳代時(shí)會(huì)發(fā)生基因突變[14-16]。本研究所用的外周血單個(gè)核細(xì)胞取材方便,創(chuàng)傷小,用于重編程前在體外擴(kuò)增時(shí)間短,更加適合用于重編程。
本研究獲得的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞,有明顯增生能力,表達(dá)Ki-67。PDGFR-α陽性的Pre-OPC可以體外傳代,能為后期的移植實(shí)驗(yàn)提供足量細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)[15]證明,在少突膠質(zhì)細(xì)胞的誘導(dǎo)過程中,反維甲酸具有重要作用,這可能與其可以促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向后腦及脊髓交界處腹側(cè)神經(jīng)元分化的作用有關(guān),而這個(gè)部位的神經(jīng)前體細(xì)胞被認(rèn)為是運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元及少突膠質(zhì)細(xì)胞的祖細(xì)胞。本研究所獲得的表達(dá)O1和O4的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞,在移植之前,可以使用流式細(xì)胞篩選,以獲得純度更高的少突膠質(zhì)前體細(xì)胞。
總之,利用外周血單個(gè)核細(xì)胞作為起始細(xì)胞重編程為少突膠質(zhì)前體細(xì)胞具有創(chuàng)傷小,周期短等特點(diǎn),未來有一定的應(yīng)用前景。
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編輯 慕 萌
Generation of oligodendrocyte progenitor cells from human peripheral blood mononuclear cells
Tang Xihe1,2,3,4, Li Mo2,3, Wang Shuyan2,3, Li Pengyan2,3, Zhang Y. Alex2,3, Chen Zhiguo2,3*, Chen Hui1,3,4*
(1.ChinaRehabilitationResearchCenter,Beijing100053,China; 2.CellTherapyDepartment,XuanwuHospital,CapitalMedicalUniversity,Beijing100053,China; 3.CenterofNeuralInjuryandRepair,BeijingInstituteforBrainDisorders,Beijing100053,China; 4.BeijingKeyLaboratoryofNeuralInjuryandRehabilitation,Beijing100053,China)
Objective To generate oligodendrocyte progenitor cells (OPCs) from peripheral blood mononuclear cells by episomal vectors.Methods Peripheral blood of a donor was collected by venipuncture and then mononuclear cells (MNCs) were isolated by density-based centrifugal separation. After a short period of expansion, the isolated MNCs were transfected with three plasmids expressingOCT4,SOX2,KLF4,C-MYC,LIN28,NANOG, and cultured in chemical defined medium with small molecules. Results Sixty days later, the O4 oligodendrocyte progenitor cells appeared and could be expanded more than 60 passages. Conclusion The peripheral blood MNCs can be converted to oligodendrocyte progenitor cells by non-integrative plasmid vectors.
peripheral blood mononuclear cells; cell reprogramming; oligodendrocyte progenitor cells
國(guó)家自然科學(xué)基金(81661130160),北京市科委計(jì)劃項(xiàng)目 (Z151100001615055)。This study was supported by National Natural Science Foundation of China(81661130160), Beijing Municipal Science and Technology Commission (Z151100001615055).
時(shí)間:2017-07-16 17∶34 網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170716.1734.048.html
10.3969/j.issn.1006-7795.2017.04.013]
R329.2
2016-06-14)
*Corresponding authors, E-mail:chenzhiguo@gmail.com, chenhui55299@163.com