李揚璐 阮祥燕，2* Alfred O. Mueck，2

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026；2. 德國圖賓根大學婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌與絕經(jīng)中心，圖賓根 D-72076，德國)

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· 更年期與婦科內(nèi)分泌 ·

人卵巢組織凍存與移植研究進展

李揚璐1阮祥燕1，2*Alfred O. Mueck1，2

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100026；2. 德國圖賓根大學婦產(chǎn)醫(yī)院內(nèi)分泌與絕經(jīng)中心，圖賓根 D-72076，德國)

隨著癌癥治療學的發(fā)展，癌癥病人的生存率有了很大的提高。但性腺毒性治療對腫瘤病人的生育力造成了不可逆的影響。有效的保護腫瘤病人的生育力，提高她們的生殖健康水平，是醫(yī)療工作者面臨的重要問題。卵母細胞凍存、胚胎凍存、卵巢組織凍存等技術(shù)的發(fā)展是為女性生育力保護提供了可能。本文將簡述目前常用的生育力保護方法，重點介紹人卵巢組織凍存與移植技術(shù)在生育力保護方面的重要作用。

性腺毒性治療；生育力保護；卵巢組織凍存與移植；卵母細胞凍存；胚胎凍存

卵巢是女性重要的生殖內(nèi)分泌器官，主要作用為產(chǎn)生卵子并排卵和分泌激素，對于維持女性的生殖功能和內(nèi)分泌功能有重要意義。隨著癌癥診斷和治療學的進步，放射治療(以下簡稱放療)以及細胞毒性抗癌藥物在臨床上的普遍應(yīng)用，癌癥病人的生存率有了很大提高。研究[1]顯示，15～29歲癌癥病人總體5年生存高達83%。年輕癌癥病人在病愈后的生育要求也越來越突出，年齡在45歲以下的癌癥病人中約有33.5%～78.3%渴望在治療后生育或再次生育[2]。因此，除降低癌癥相關(guān)病死率外，提高癌癥病人病愈后的生活質(zhì)量、保護生育力也是應(yīng)當研究的重點。本文將簡述放療及化學藥物治療(以下簡稱化療)對女性生殖力的影響、女性生育力保護方法，著重介紹人卵巢組織凍存與移植的相關(guān)研究進展。

1 放射治療與化學藥物治療對卵巢功能的影響

放射治療與化學藥物治療(以下簡稱放化療)導致卵泡耗竭、間質(zhì)纖維化、血管損傷[3]，使得年輕癌癥女性早絕經(jīng)的發(fā)病風險增高，患癌女童在性腺毒性治療后會出現(xiàn)青春期延遲、原發(fā)性或繼發(fā)性閉經(jīng)[4]。放化療對卵巢功能的損傷程度取決于化療方案和劑量，放療劑量和照射區(qū)域以及治療前的卵巢儲備功能[5]。對于使用含有烷化劑(如環(huán)磷酰胺)的化療方案，造血干細胞移植前的全身照射或卵巢直接照射的女性，其卵泡耗竭程度最明顯。Meirow[6]的研究顯示，使用烷化劑可致42%的女性出現(xiàn)卵巢早衰，其可能機制是烷化劑經(jīng)肝臟首過效應(yīng)后的代謝產(chǎn)物可引起DNA雙鏈斷裂，增生活躍的細胞對烷化劑最敏感，各種發(fā)育程度的卵泡也受累[7]。卵巢受到放療(≥5Gy)或造血干細胞移植前放療后，早絕經(jīng)風險增高20倍[8]。原始卵泡體外培養(yǎng)顯示，化療藥物可誘導凋亡機制，引起卵泡結(jié)構(gòu)紊亂以及前顆粒細胞腫脹[5]。放化療后女性出現(xiàn)閉經(jīng)、潮熱、盜汗等圍絕經(jīng)期癥狀，進而出現(xiàn)心血管疾病、骨密度降低甚至骨質(zhì)疏松，這將嚴重影響癌癥病人的生存質(zhì)量[9]。因此，為癌癥病人選擇有效化療方案的同時，避免年輕病人的卵巢醫(yī)源性損傷也是醫(yī)生應(yīng)當考慮的內(nèi)容。

2 女性生殖力保護方法

目前，女性生殖力保護的方法主要有：卵母細胞凍存、胚胎凍存和卵巢組織凍存，以及藥物治療和手術(shù)[10]。

2.1 卵母細胞冷凍

卵母細胞凍存包括成熟卵母細胞和未成熟卵母細胞的凍存。一項Meta分析[11]顯示，玻璃化冷凍方法在卵子存活率、受精卵和胚胎質(zhì)量方面可獲得更好的結(jié)果。成熟卵母細胞(M Ⅱ期)凍存是在放化療前進行控制性超促排卵獲取成熟卵母細胞并進行冷凍，在病人痊愈后解凍，通過體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer， IVF-ET)受精獲得胚胎。癌癥病人與非癌癥病人卵母細胞解凍后的每例胚胎移植活產(chǎn)率相似(44%vs33%)，說明卵母細胞凍存對于育齡期癌癥女性是一種安全有效的選擇[12]。需要注意的是，促排卵時機需根據(jù)女性的月經(jīng)周期而定，從確立癌癥診斷到促排卵實施需要較長時間，一項關(guān)于乳腺癌的Meta分析[13]顯示，化療開始時間每延遲4周，總體生存率即下降15%。促排卵過程中所致的雌激素升高對于雌激素依賴性腫瘤(如乳腺癌、卵巢癌等)病人是否適用，也是選擇成熟卵母細胞凍存時醫(yī)生應(yīng)考慮的問題。Oktay等[14]建議對乳腺癌病人在放化療前采用芳香化酶抑制劑(如來曲唑)聯(lián)合卵泡刺激素進行促排卵，但目前缺乏長期隨訪的結(jié)果。

未成熟卵母細胞(GV期或M I期)冷凍不需超促排卵，不推遲放化療開始時間，可從卵泡期、黃體期或卵巢組織中獲取，但與傳統(tǒng)輔助生殖技術(shù)相比，卵母細胞體外成熟的臨床結(jié)局較低[15]。目前，通過未成熟卵母細胞體外培養(yǎng)凍融后的活產(chǎn)案例鮮有報道。

2.2 胚胎冷凍

胚胎冷凍技術(shù)已成為臨床常規(guī)使用的生育力保護方法，冷凍卵裂球期或囊胚期的胚胎較穩(wěn)定，玻璃化冷凍復(fù)蘇率可達90%以上[16]，凍融周期的妊娠率顯著高于新鮮周期胚胎移植的妊娠率，這有可能是胚胎和子宮內(nèi)膜同步發(fā)育的結(jié)果[17]。盡管缺乏大型隨機對照研究評價胚胎冷凍對出生子代健康的影響，凍胚移植仍被認為是安全可靠的[18]。胚胎冷凍能有效減少促排卵治療中的激素刺激，并提高累計妊娠率。Roy等[19]的研究認為，與慢速冷凍法相比，玻璃化胚胎冷凍能最大程度減小細胞損傷，提高復(fù)蘇后存活率。但該技術(shù)僅適用于已婚女性。與成熟卵母細胞一樣，胚胎冷凍也需卵巢刺激獲取多個卵母細胞，標準的促排卵方案從卵巢刺激到獲取卵母細胞，大約需要2～6周的時間[20]，卵巢超促排卵過程中的高雌激素暴露對乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌等雌激素依賴性腫瘤有可能產(chǎn)生不利影響。

2.3 卵巢組織凍存與移植

1996年Hovatta等[21]首次報道人卵巢組織凍存成功。2004年，第1例經(jīng)卵巢組織凍存及自體移植的嬰兒出生[22]。截至2016年12月底的數(shù)據(jù)，目前世界范圍內(nèi)通過卵巢組織凍存及自體移植技術(shù)已成功誕生86名嬰兒，另有9名嬰兒即將出生[23]。與卵母細胞凍存和胚胎凍存相比，一片卵巢組織可保存數(shù)百甚至上千個不同發(fā)育等級的卵泡，生殖力儲備豐富，日后可用于自體移植或分離卵泡體外培養(yǎng)為成熟卵母細胞，通過體外受精(in vitro fertilization，IVF)獲得胚胎[24]；不依賴于病人的生理周期，不需超促排卵，在癌癥確診后可立即進行腹腔鏡下卵巢組織取材，或在癌癥治療開腹手術(shù)時取材，不推遲放化療開始時間[25]；無論病人婚否，均可進行卵巢組織凍存，是青春期前女孩的唯一選擇[26]；不僅能夠有效保存病人生育力，還能在一定程度上恢復(fù)卵巢的內(nèi)分泌功能?；谶@些優(yōu)勢，卵巢組織凍存與移植具有廣闊的應(yīng)用前景。

2.3.1 卵巢組織凍存的適應(yīng)人群

年齡是卵巢組織凍存需考慮的重要因素，女性在35歲以后，卵巢儲備功能隨年齡下降，年齡大于38歲的女性不建議進行卵巢組織凍存。許多中心將卵巢組織凍存年齡上限定為35歲[27]。

Donnez 等[27]認為，尋求卵巢組織凍存的因素可分為癌癥、良性疾病和社會因素3大類，具體如下：

1)癌癥：①系統(tǒng)性疾病，包括霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、白血病、成神經(jīng)管細胞瘤；②盆腔外疾病，包括骨腫瘤(骨肉瘤、尤文肉瘤)、乳腺癌、黑色素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、腸道惡性腫瘤；③盆腔疾病，包括盆腔肉瘤、橫紋肌肉瘤、骶骨腫瘤、直腸乙狀結(jié)腸癌、早期宮頸癌、早期陰道癌、早期外陰癌、卵巢癌早期(I A期)、卵巢交界性腫瘤。

2)良性疾?。孩賳蝹?cè)或雙側(cè)卵巢切除，原因包括良性卵巢腫瘤、嚴重或復(fù)發(fā)性子宮內(nèi)膜異位癥、BRCA1或BRCA2基因突變攜帶者；②具有早絕經(jīng)風險的疾病，包括特納綜合征、早絕經(jīng)家族史、需化療的良性疾病(系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風濕關(guān)節(jié)炎、貝賽特氏癥、Wegener’s肉芽腫病)；③需骨髓移植的疾病，包括良性血液病(鐮狀細胞貧血、重癥地中海貧血、再生障礙性貧血)、對免疫抑制劑不應(yīng)答的自身免疫性疾病。

3)社會因素：年齡因素、因社會或經(jīng)濟因素推遲生育的病人。

需要注意的是，白血病病人的卵巢組織中可能存在惡性白血病細胞。Delmarn等[28]對比利時某卵巢組織凍存庫15年的數(shù)據(jù)進行了分析，發(fā)現(xiàn)391名癌癥病人的卵巢組織中，13%在光學顯微鏡下發(fā)現(xiàn)卵巢組織中有癌細胞轉(zhuǎn)移，白血病病人的卵巢組織移植片中惡性白血病細胞的風險最高。Dolmans等[29]采用反轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈鎖反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)技術(shù)發(fā)現(xiàn)50%的白血病病人中惡性細胞陽性，而在白血病完全緩解后取材的卵巢組織并未發(fā)現(xiàn)惡性白血病細胞[30]，因此，在第一次緩解后和骨髓移植前進行卵巢組織取材可有效降低移植的風險。盡管目前未發(fā)生移植后癌癥復(fù)發(fā)[24]，但嚴格的監(jiān)測方法，應(yīng)用組織學、免疫組織化學以及RT-PCR、熒光原位雜交等方法以避免癌細胞的入侵、腫瘤復(fù)發(fā)和播散是保障卵巢組織移植后安全性的關(guān)鍵[31]。

對于白血病、Burkitt淋巴瘤、神經(jīng)母細胞瘤等移植高風險的疾病[32]，從卵巢組織中分離第一次減數(shù)分裂前期雙線期(G V期)或第一次減數(shù)分裂中期(M I期)的卵母細胞體外培養(yǎng)至第二次減數(shù)分裂中期(M Ⅱ期)的成熟卵母細胞，可以有效避免卵巢組織移植后腫瘤復(fù)發(fā)的風險[33]。未成熟卵泡體外培養(yǎng)對環(huán)境要求較高，技術(shù)復(fù)雜，需要動態(tài)、多步的培養(yǎng)環(huán)境以配合卵泡發(fā)育不同階段，維持卵母細胞與體細胞(即顆粒細胞)的相互聯(lián)系[34]。目前只有動物實驗?zāi)軌蛲ㄟ^該技術(shù)實現(xiàn)子代出生[35]，Xiao等[36]通過兩步培養(yǎng)法首次將人類竇前卵泡體外培養(yǎng)至M Ⅱ期。

2.3.2 卵巢組織凍存方法

卵巢組織凍存是在低溫條件下使卵巢組織細胞降溫、脫水和非損傷性冰晶形成，進而使各種分子運動速度減慢、停止，細胞代謝率降低，處于休眠狀態(tài)。目前廣泛使用的凍存方法根據(jù)凍存速度的不同分為快速冷凍和慢速冷凍(slow freezing)?？焖倮鋬鲇址Q玻璃化冷凍(vitrification)，使用高濃度的冷凍保護劑(cryoprotective agent，CPA)逐步滲透和梯度洗脫的方法，經(jīng)快速降溫后，使物質(zhì)由液態(tài)直接轉(zhuǎn)化為非晶體玻璃化狀態(tài)或無定形態(tài)，胞質(zhì)內(nèi)外的水物質(zhì)在超過1 500 ℃/min的降溫速度下，迅速通過5～15 ℃的冷凍敏感區(qū)，可最大限度避免細胞內(nèi)冰晶形成，減輕冰晶形成所造成的擠壓損傷和凍融效應(yīng)，降低細胞損傷[37]。慢速冷凍又稱程序化冷凍，是一種傳統(tǒng)冷凍方法，采用較低濃度的冷凍保護劑在程序化冷凍儀的控制下緩慢降溫使細胞充分脫水，直至進入液氮。方法成熟、效果穩(wěn)定，由于降溫速度慢，適合體積相對較大的卵巢組織塊。

目前哪種方法更有利于保存卵巢組織存在爭議。有研究[38-39]認為慢速程序化冷凍需要的CPA濃度較低，對細胞毒性相對較小，CPA可在凍存前和凍存過程中緩慢均勻地滲入整個組織，可有效保存細胞活性；也有研究認為，玻璃化冷凍使細胞內(nèi)外的水物質(zhì)轉(zhuǎn)化為介于固、液態(tài)之間且粘度高的非晶體“玻璃化”狀態(tài)，減少對細胞結(jié)構(gòu)的損傷，在保存次級卵泡形態(tài)和卵巢基質(zhì)細胞方面更有優(yōu)勢[40-41]。研究[39， 42-43]顯示，二者在維持形態(tài)學完整性(原始和初級卵泡形態(tài))，體外培養(yǎng)雌激素釋放量，以及凍存后卵泡增生/凋亡比率方面相似。值得注意的是，目前各中心采用玻璃化冷凍的CPA濃度、種類差別較大，冷凍載體也不盡相同，因此，許多中心將玻璃化冷凍與慢速冷凍比較得出不同的結(jié)論，不排除此原因。此外，玻璃化冷凍的卵巢組織復(fù)蘇后有被液氮中微生物污染的風險，安全性也是該冷凍技術(shù)未來應(yīng)用中需要克服的問題。根據(jù)現(xiàn)有報道[23]，世界范圍內(nèi)通過卵巢組織凍存技術(shù)出生的86名嬰兒中，只有2名經(jīng)玻璃化冷凍技術(shù)誕生。因此，這2種方法的優(yōu)劣仍有待研究，二者的比較見表1。

表1 程序化冷凍與玻璃化冷凍的比較

CPA：cryoprotective agent; NIV：needle immersed vitrification

2.3.3 卵巢組織移植

卵巢組織的移植分為原位移植和異位移植，原位移植包括卵巢髓質(zhì)、子宮闊韌帶、卵巢囊或腹膜窗等，異位移植多選擇腹壁、前臂、腹直肌等[44]。原位移植的優(yōu)點在于更靠近輸卵管，所以只有原位移植有自然懷孕的可能；缺點是如果移植部位選擇卵巢髓質(zhì)或卵巢囊，移植片數(shù)量受卵巢體積的限制，且原位移植需進行侵入性操作[45]。理論上講，由于卵泡發(fā)育對溫度、壓力、血供和旁分泌等有嚴格的要求，與異位移植相比，盆腔及腹膜內(nèi)環(huán)境(腹膜液及特殊的氧化作用)能夠為卵泡發(fā)育提供更好的環(huán)境[24]。但在一項研究[46]中，5名將卵巢組織異位移植到腹直肌或腹直肌鞘的女性，內(nèi)分泌功能在移植后3～5個月均得以有效恢復(fù)。異位移植的優(yōu)點在于：①避免了侵入性操作；②易獲取卵泡；③再移植成本較低；④如因放療或手術(shù)后出現(xiàn)嚴重盆腔粘連而不適合移植時，可進行異位移植[46]，但需通過IVF技術(shù)才能妊娠。

卵巢功能的恢復(fù)可通過雌二醇水平的升高和促性腺激素水平降低來判定，超聲下檢測到黃體可證實有排卵[44]。研究[24]報道的卵巢組織自體移植后恢復(fù)卵巢功能的時間不一，多數(shù)為2.0～6.5個月不等。采用程序化冷凍后復(fù)蘇的卵巢組織塊，無論較大[如(8～10)mm × 5 mm]或較小的組織塊(如2 mm × 2 mm)均能有效恢復(fù)卵巢的內(nèi)分泌功能[47]。每次移植后的妊娠率約為27%～33%[47-49]，這些妊娠婦女中自然懷孕率高達50%～91%[49-50]。

影響移植后卵巢壽命的因素有：①卵巢儲備功能(卵泡密度，取決于年齡)；②凍存前化療；③移植組織片體積和卵巢組織準備方法(冷凍-復(fù)蘇技術(shù))；④移植的皮質(zhì)片中卵泡分布；⑤移植部位的血管形成能力，影響移植后缺血程度[24]。

2.4 藥物治療

主要指在放化療前注射促性腺激素釋放激素激動劑(gonadotropin-releasing hormone agonist，GnRHa)抑制卵巢功能，首次應(yīng)用于30多年前。其可能涉及的機制有降低原始卵泡活性、減少低刺激素狀態(tài)下的卵巢血流灌注、減少卵巢凋亡或通過GnRH激活化療中的抗凋亡途徑[51]。但GnRHa能否有效保護卵巢功能，各方觀點不一。Turner等[52]對12項試驗結(jié)果分析指出，GnRHa在保護年輕乳腺癌病人卵巢功能方面效果并不確切。體外研究[51]顯示GnRHa對放化療造成的卵巢功能損傷無任何保護作用。而一項Meta分析[53]顯示，化療期間采用GnRHa短暫抑制卵巢功能能夠降低卵巢早衰風險。出現(xiàn)上述爭議可能是病人的人口學特征、化療方案、隨訪時間、研究終點等不同所致。2013年美國臨床腫瘤學會(American Society of Clinical Oncology，ASCO)指南[18]指出，GnRHa在生殖力保護方面的證據(jù)并不充分，但也許可以產(chǎn)生其他益處，如減少化療所致血小板降低時的陰道出血。因此，GnRHa在保護卵巢功能方面的效果仍值得探究。

2.5 卵巢移位

卵巢移位一般在腹腔鏡下即可完成，在盆腔照射前將卵巢固定在距盆腔較遠的位置，但不改變其與輸卵管的位置關(guān)系，通常選擇腹前外側(cè)壁，臍上3～5 cm。但該手術(shù)對卵巢功能的保護作用很有限，經(jīng)卵巢懸吊的女性在盆腔放療后發(fā)生卵巢早衰的風險曾有報道達15%～40%[27]，但現(xiàn)在越來越多的臨床實踐證明，基本沒有保護作用。2013年ASCO指南[18]建議育齡期女性在盆腔放療前可行卵巢移位手術(shù)以保護卵巢功能，但由于放射線比較分散，應(yīng)告知病人該技術(shù)并非能夠成功有效地保護卵巢功能。

3 小結(jié)與展望

近年來由于患癌人群的逐年增長，腫瘤生殖學也越來越受到人們的關(guān)注。2013年ASCO指南[18]建議，“醫(yī)療工作人員(包括婦科腫瘤、兒科腫瘤、血液科醫(yī)生等)進行知情同意的過程中，應(yīng)當向即將采取性腺毒性治療的病人告知其治療不孕的可能性，并為他們提供生殖力保護的建議指導，為她們選取合適的生殖醫(yī)學專家”。重視腫瘤病人的生殖力保護，對提高其病愈后的生活質(zhì)量，給予她們生活的勇氣，具有重要的意義。卵母細胞凍存、胚胎凍存均可以滿足病人未來的生育要求，但如前所述，具有一定的局限性；GnRHa和卵巢懸吊手術(shù)在保護卵巢功能方面效果并不明確；卵巢組織凍存除解決病人癌癥痊愈后的生育要求外，還能夠恢復(fù)卵巢的內(nèi)分泌功能，對于治療時間緊迫或不能接受超促排卵的病人，是最佳的生殖力保護選擇，也是青春期前癌癥生存者的唯一選擇。現(xiàn)有的研究[54]有足夠的證據(jù)表明，卵巢組織凍存及移植技術(shù)，是應(yīng)該從實驗階段快速發(fā)展到臨床實踐的時候了，此技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，是保護女性生育力的理想選擇。

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編輯 慕 萌

Progress in human ovarian tissue cryopreservation and transplantation

Li Yanglu1， Ruan Xiangyan1，2*， Alfred O. Mueck1， 2

(1.DepartmentofGynecologicalEndocrinology，BeijingObstetricsandGynecologyHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100026，China; 2.SectionofEndocrinologyandMenopause，DepartmentofWomen’sHealth，UniversityofTubingen，TubingenD-72076，Germany)

The survival rate of cancer patients is increasing with the development of cancer treatment methods. However， gonadotoxic therapies have an irreversible impact on ovarian function. Effective fertility protection and improving the level of reproductive health have become a crucial problem that health care providers confront. Improvements of oocyte and embryo cryopreservation， and ovarian tissue cryopreservation and transplantation provide feasible options for women’s fertility protection. This review discusses the common fertility protection methods， focusing on the important role of human ovarian tissue cryopreservation and transplantation for fertility protection.

gonadotoxicity therapy; fertility protection; ovarian tissue cryopreservation and transplantation; oocyte cryopreservation; embryo cryopreservation

首都臨床特色應(yīng)用研究與成果推廣(Z161100000516143)，首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項項目(2016-2-2113)，北京市醫(yī)院管理局臨床技術(shù)創(chuàng)新項目(XMLX201710)，北京市衛(wèi)生系統(tǒng)高層次衛(wèi)生技術(shù)人才(學科帶頭人)(2014-2-016)，國家外國專家局2017年度北京市引進國外技術(shù)、管理人才項目(20171100004)。This study was supported by Capital Characteristic Clinic Project of China(Z161100000516143)； Beijing Capital Foundation for Medical Science Development and Research(2016-2-2113)； Clinical Technique Innovation Project of Beijing Municipal Administration of Hospitals (XMLX201710)； Beijing Municipality Health Technology High-level Talent(2014-2-016)；Foreign Technical and Administrative Talent Introduction Project in 2017，State Administration of Foreign Experts Affairs of China(20171100004).

時間：2017-07-16 17∶23 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170716.1723.028.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.04.001]

R711.75

2017-06-05)

*Corresponding author， E-mail：ruanxiangyan@163.com