李 靜，高慧敏，王 弦，秦 蓉

Snail在IgA腎病組織中的表達(dá)及其與腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的關(guān)系

李 靜，高慧敏，王 弦，秦 蓉

目的 探討在組織和細(xì)胞水平上Snail的表達(dá)與腎小管上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)及腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)的關(guān)系；觀察轉(zhuǎn)染Snail基因后人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)miRNA表達(dá)譜的變化，以深入闡明EMT機制中miRNA的重要性。方法 采用免疫組化法檢測Snail及EMT相關(guān)蛋白vimentin、SMA、E-cadherin在40例IgA腎病患者腎穿刺組織中的表達(dá)。采用RT-PCR及Western blot法檢測Snail、E-cadherin、vimentin、SMA在HK-2細(xì)胞正常對照組、空轉(zhuǎn)染組、Snail基因轉(zhuǎn)染組中的表達(dá)，進(jìn)一步借助基因芯片篩選出差異表達(dá)的miRNA。結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，IgA腎病組織中Snail與vimentin及SMA蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，與E-cadherin蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，且TIF程度越高，Snail蛋白表達(dá)越強。RT-PCR及Western blot檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，Snail轉(zhuǎn)染組Snail、vimentin、SMA在基因和蛋白水平表達(dá)均升高，E-cadherin蛋白表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)?；蛐酒Y(jié)果表明，Snail轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后，篩選出5個明顯差異表達(dá)的miRNA，預(yù)測出5 026個可能的潛在靶基因。結(jié)論 Snail表達(dá)與腎小管EMT及TIF關(guān)系密切，可作為新靶點，在EMT防治中起重要作用；差異表達(dá)的miRNAs可能參與Snail促進(jìn)EMT及TIF過程的發(fā)生、發(fā)展。

腎病；腎小管上皮細(xì)胞；Snail；上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化；免疫組織化學(xué)；miRNA；基因芯片

腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)是各種慢性腎臟疾病進(jìn)展為終末期腎病的最終共同途徑[1]。研究發(fā)現(xiàn)，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是TIF發(fā)生、發(fā)展的重要機制[2]。EMT是指上皮細(xì)胞在外界因素作用下失去上皮特性而獲得間質(zhì)細(xì)胞特性的一種現(xiàn)象，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞標(biāo)志物角蛋白、E-cadherin等表達(dá)下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、vimentin等蛋白表達(dá)上調(diào)[3]。在EMT過程中，多種信號分子參與其中并發(fā)揮重要作用[4]，研究發(fā)現(xiàn)鋅指轉(zhuǎn)錄因子Snail家族成員對EMT的發(fā)生、發(fā)展起重要的促進(jìn)作用[5]。但Snail在人腎小管上皮細(xì)胞EMT過程中作用機制的研究卻鮮有報道。本組前期研究結(jié)果表明，miRNA在EMT及TIF過程中發(fā)揮著重要作用，目前有極少量研究報道在EMT過程中miRNA的表達(dá)譜變化。為進(jìn)一步探討Snail與腎小管EMT及TIF的關(guān)系以及miRNA的調(diào)控作用，本實驗采用免疫組化法檢測Snail蛋白及EMT相關(guān)蛋白vimentin、SMA、E-cadherin在IgA腎病患者的腎臟組織中的表達(dá)，從而探討Snail與EMT和TIF的相關(guān)性；同時構(gòu)建過表達(dá)Snail基因的HK-2細(xì)胞，應(yīng)用qPCR、RT-PCR、Western blot等分子生物學(xué)技術(shù)，在細(xì)胞水平研究Snail過表達(dá)對EMT相關(guān)蛋白vimentin、SMA、E-cadherin表達(dá)的影響；并利用基因芯片技術(shù)篩選出Snail轉(zhuǎn)染組HK-2細(xì)胞差異表達(dá)的miRNA，從miRNAs水平進(jìn)一步探討Snail基因?qū)δI小管EMT的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 標(biāo)本來源與分組 選取40例2010～2014年安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院病理科經(jīng)腎穿刺活檢診斷為IgA腎病的腎組織，已排除過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等繼發(fā)性腎小球腎炎。另收集4例正常腎組織作為對照組。根據(jù)光鏡下腎小管萎縮和TIF所占皮質(zhì)部間質(zhì)總面積的百分比將IgA腎病TIF程度分為3級：(1)輕度：腎小管萎縮和TIF程度不超過皮質(zhì)部間質(zhì)總面積的25%；(2)中度：腎小管萎縮和TIF程度占皮質(zhì)部間質(zhì)總面積25%～50%；(3)重度：腎小管萎縮和TIF程度超過皮質(zhì)部間質(zhì)總面積的50%[6]。對入選的40例IgA腎病組織根據(jù)TIF嚴(yán)重程度分為輕度病變組12例、中度病變組14例和重度病變組14例。

1.1.2 細(xì)胞株和質(zhì)粒 人腎皮質(zhì)近曲小管上皮細(xì)胞(HK-2、FDCC-HSC145)購于復(fù)旦IBS細(xì)胞庫；人Snail基因表達(dá)質(zhì)粒由廣州輝駿公司構(gòu)建。

1.1.3 主要試劑 鼠抗人Snail多克隆抗體(濃縮型)，工作濃度(1 ∶50)購自Abcam公司；鼠抗人SMA、vimentin、E-cadherin單克隆抗體(即用型)及PV-6000免疫組化染色試劑盒和DAB顯色試劑盒均購自北京中杉金橋公司。DMEM/F12培養(yǎng)液購自美國Hyclone公司，胎牛血清購自杭州四季青公司，胰酶、RIPA蛋白提取液細(xì)胞裂解液購自碧云天公司，質(zhì)粒小量抽提試劑盒、Trizol RNA抽提試劑盒購自美國Invitrogen公司，DMSO購自美國AMRESCO公司，兔抗人E-cadherin、vimentin、α-SMA抗體、鼠抗人Snail抗體均購自美國Abcam公司，小鼠抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗小鼠IgG二抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG二抗均購自北京中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 免疫組化法檢測腎組織中Snail、vimentin、SMA、E-cadherin的表達(dá)及結(jié)果判定 標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定后石蠟包埋，3 μm厚連續(xù)切片。采用EnVision兩步法，具體操作步驟按PV-6000試劑盒說明書進(jìn)行，經(jīng)DAB顯色，蘇木精復(fù)染細(xì)胞核，中性樹膠封固。已知陽性組織作為陽性對照，以PBS代替原一抗作為陰性對照進(jìn)行抗體有效性驗證。Snail、vimentin、SMA及E-cadherin結(jié)果判斷：按照染色細(xì)胞所占面積百分比進(jìn)行半定量分析。光鏡下每張切片不包含腎小球和血管的間質(zhì)區(qū)域隨機選取5個高倍鏡視野(×400倍)，計算所選區(qū)域陽性細(xì)胞占整個視野面積的百分比，然后求其平均值作為比較指標(biāo)。陽性細(xì)胞所占面積≤10%為陰性(-)，10%～25%為弱陽性(1+)，25%～50%為中等陽性(2+)，≥50%為強陽性(3+)[3]，最終結(jié)果將(-～1+)判斷為陰性，(2+～3+)判斷為陽性。

1.2.2 人Snail基因表達(dá)載體的構(gòu)建、鑒定、擴(kuò)增及提取 構(gòu)建Snail基因表達(dá)載體，并將含有目的片段的重組質(zhì)粒菌株送與上海生工公司測序鑒定。然后轉(zhuǎn)化DH-5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)涂板、挑選、單克隆后擴(kuò)增；采用質(zhì)粒小提試劑盒(Invitrogen公司)從大腸桿菌中抽提質(zhì)粒，操作方法參照說明書；用紫外分光光度儀測定OD260/280比值來計算DNA的濃度及純度，-20 ℃保存。

1.2.3 Snail質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染及細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 HK-2細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，按每孔1×106個接種在6孔板中，待細(xì)胞達(dá)70%～80%融合后，在細(xì)胞生長狀態(tài)良好的情況下進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000說明書。實驗分組：(1)空白對照組：只接種細(xì)胞，無轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，無轉(zhuǎn)染試劑；(2)空轉(zhuǎn)染組：無轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，有轉(zhuǎn)染試劑；(3)實驗組：轉(zhuǎn)染Snail質(zhì)粒。將處理后的細(xì)胞置于37 ℃ 5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，采用倒置顯微鏡觀察各組細(xì)胞形態(tài)的改變。

1.2.4 Western blot 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，加入RIPA裂解液，冰上均質(zhì)，4 ℃，12 000 r /min，離心10 min，取上清液，4 ∶1加入上樣緩沖液，100 ℃煮沸變性10 min。配制10% SDS-PAGE凝膠，依次加入預(yù)染蛋白Marker和待分析樣品后80 V電壓下電泳分離，200 mA電流轉(zhuǎn)膜1.5 h，5%脫脂奶粉封閉2 h。加入一抗4 ℃搖床孵育過夜。其中抗體濃度β-catenin(1 ∶5 000)、Snail(1 ∶1 000)、vimentin(1 ∶1 000)、α-SMA(1 ∶1 000)、E-cadherin(1 ∶1 000)、二抗(1 ∶10 000)。使用Pierce ECL Western blotting KIT顯色。

1.2.5 qPCR、RT-PCR和miRNA表達(dá)譜芯片檢測 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，使用Trizol法提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。qPCR采用SYBR Green染色法，qPCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s,95 ℃ 15 s、60 ℃ 40 s 40個循環(huán)。樣本做3個復(fù)孔。CT值代表熒光信號到達(dá)所設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)，以β-actin作為內(nèi)參，通過2-△△Ct法計算目的基因Snail的相對表達(dá)量。建立25 μL的PCR反應(yīng)體系：cDNA 模板2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、PCR Master Mix 12.5 μL、去離子水8.5 μL。PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95 ℃ 3 min，變性95 ℃ 30 s、退火30 s(Snail 51 ℃、vimentin 50 ℃、SMA 55 ℃、E-cadherin 54 ℃)、延伸72 ℃ 45 s共進(jìn)行35個循環(huán)，后72 ℃延伸10 min，最后4 ℃終止，-20 ℃保存，PCR產(chǎn)物使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測并分析。引物序列如下：β-actin上游5′-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3′，下游5′-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3′；Snail上游5′-TTTACCTTCCAGCAGCCCTA-3′，下游5′-GACAGAGTCCCAGATGAGCA-3′；vimentin上游5′-CCTTGAACGCAAAGTGGAAT-3′，下游5′-TTTGGACATGCTGTTCCTGA-3′；SMA上游5′-GCGTGGCTATTCCTTCGTTA-3′，下游5′-TTCTCAAGGGAGGATGAGGA-3′；E-cadherin上游5′-TGATTCTGCTGCTCTTGCTG-3′，下游5′-CTCTTCTCCGCCTCCTTCTT-3′。同時委托上海伯豪公司對空轉(zhuǎn)染組和Snail轉(zhuǎn)染組總RNA進(jìn)行miRNA芯片分析。

2 結(jié)果

2.1 Snail、vimentin、SMA及E-cadherin在IgA腎病組織中的表達(dá) Snail在正常腎小管上皮細(xì)胞胞質(zhì)中有少量表達(dá)，當(dāng)發(fā)生TIF時，Snail主要在腎小管上皮細(xì)胞及間質(zhì)纖維細(xì)胞和(或)纖維母細(xì)胞、少量炎細(xì)胞胞質(zhì)及胞核中表達(dá)，且Snail染色強度隨TIF程度加重而增加(圖1)；vimentin主要在萎縮的腎小管上皮細(xì)胞和基膜、腎小球毛細(xì)血管壁和內(nèi)皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)(圖2)；SMA主要在腎小管上皮細(xì)胞、腎小球系膜細(xì)胞、血管壁及間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)(圖3)；E-cadherin主要在腎小管上皮細(xì)胞的胞膜和胞質(zhì)表達(dá)(圖4)。進(jìn)一步統(tǒng)計分析表明，Snail、vimentin及SMA蛋白隨TIF程度加重而表達(dá)增強；E-cadherin蛋白隨TIF程度加重而表達(dá)降低(P<0.05，表1)。Spearman相關(guān)性分析表明Snail蛋白與vimentin、SMA蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，與E-cadherin蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(表2)。

①A①B①C②A②B②C③A③B③C④A④B④C

圖1 Snail蛋白在腎小管間質(zhì)纖維化輕度(A)、中度(B)和重度(C)病變組織中的表達(dá)，EnVision兩步法 圖2 vimentin蛋白在腎小管間質(zhì)纖維化輕度(A)、中度(B)和重度(C)病變組織中的表達(dá)，EnVision兩步法 圖3 SMA蛋白在腎小管間質(zhì)纖維化輕度(A)、中度(B)和重度(C)病變組織中的表達(dá)，EnVision兩步法 圖4 E-cadherin蛋白在腎小管間質(zhì)纖維化輕度(A)、中度(B)和重度(C)病變組織中的表達(dá)，EnVision兩步法

表2 Snail與vimentin、SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)的相關(guān)性分析

2.2 重組質(zhì)粒的鑒定 經(jīng)測序結(jié)果顯示：重組質(zhì)粒的堿基序列與GenBank中的序列完全一致，表明目的片段成功插入載體質(zhì)粒。

2.3 Snail基因轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化 借助倒置相差顯微鏡觀察，空白對照組及空轉(zhuǎn)染組HK-2細(xì)胞形態(tài)呈鋪路石樣，Snail基因轉(zhuǎn)染組中HK-2細(xì)胞形態(tài)呈紡錘形，間隙增寬，兩者形態(tài)上有明顯差別(圖5)。

2.4 Snail、vimentin、SMA及E-cadherin在各組HK-2細(xì)胞中的表達(dá)

2.4.1 qPCR結(jié)果 Snail轉(zhuǎn)染組中Snail mRNA的相對表達(dá)量明顯高于空白對照組及空轉(zhuǎn)染組(圖6)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

2.4.2 Western blot結(jié)果 Snail轉(zhuǎn)染組中Snail、vimentin及SMA蛋白的表達(dá)量明顯高于空白對照組及空轉(zhuǎn)染組，而E-cadherin蛋白的表達(dá)明顯低于空白對照組及空轉(zhuǎn)染組(圖7、8)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖6 腎小管上皮細(xì)胞HK-2轉(zhuǎn)染Snail后Snail mRNA的表達(dá)與空白對照組及空轉(zhuǎn)染組比較，**P<0.01

圖7 Western blot法檢測Snail轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后Snail、vimentin、SMA及E-cadherin蛋白的表達(dá)

2.4.3 RT-PCR結(jié)果 Snail轉(zhuǎn)染組中Snail、vimentin及SMA蛋白的表達(dá)量明顯高于空白對照組及空轉(zhuǎn)染組，而E-cadherin蛋白的表達(dá)量明顯低于空白對照組及空轉(zhuǎn)染組(圖9、10)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.5 過表達(dá)Snail質(zhì)粒誘導(dǎo)的miRNA異常表達(dá) 為篩選Snail轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞內(nèi)miRNA的差異性表達(dá)，對空轉(zhuǎn)染組及Snail轉(zhuǎn)染組進(jìn)行基因芯片分析，結(jié)果顯示：在兩組細(xì)胞中，篩選出24個差異表達(dá)的miRNA(fc≤0.7，fc≥1.5)(圖9、10)，其中hsa-miR-1268a、hsa-miR-5703及hsa-miR-6165表達(dá)水平差異為2≤fc≤3，hsa-miR-5787和hsa-miR-630表達(dá)水平差異為fc≥3，且均表現(xiàn)為表達(dá)上調(diào)(表3)。

表1 Snail、vimentin、SMA及E-cadherin蛋白在IgA腎病組織中的表達(dá)

輕度組與中度組比較，#P<0.01；中度組與重度組比較，*P<0.01；輕度組與重度組比較，△P<0.01；中度組與重度組比較，□P=0.663、☆P=0.309

ABC

圖5 Snail轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后形態(tài)學(xué)變化：A.空白對照組；B.空轉(zhuǎn)染組；C.Snail轉(zhuǎn)染組

圖8 Snail轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后Snail(A)、vimentin(B)、SMA(C)及E-cadherin(D)蛋白的表達(dá)與空白對照組比較，*P<0.05；與空轉(zhuǎn)染組比較，#P<0.05

圖9 RT-PCR法檢測Snail轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后Snail、vimentin、SMA及E-cadherin mRNA的表達(dá)

1.Marker；2.空白對照組；3.空轉(zhuǎn)染組；4.Snail轉(zhuǎn)染組

表3 Snail質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后空轉(zhuǎn)染組和轉(zhuǎn)染組內(nèi)表達(dá)差異最明顯的5個miRNA

3 討論

近年來人們對TIF研究日益增多，然而引起TIF的確切機制尚無共識，但EMT在TIF早期卻起到關(guān)鍵作用。人Snail蛋白主要表達(dá)于胎盤、胚胎中胚層、心肌、肝臟、骨骼肌及某些未分化組織[7]，具有調(diào)控細(xì)胞分化、游動、循環(huán)及凋亡作用[8-9]。Boutet等[7]研究發(fā)現(xiàn)胚胎期Snail基因參與組織、器官分化，成人Snail基因的激活破壞上皮組織的完整性和穩(wěn)定性，引起臟器纖維化。大量研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，Snail作為轉(zhuǎn)錄因子，與E-cadherin啟動子區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)E-cadherin基因轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而抑制E-cadherin的表達(dá)，破壞細(xì)胞間緊密連接，促使細(xì)胞發(fā)生遷移。Chen等[12]研究結(jié)果顯示，Snail基因敲除小鼠在TGF-β高水平表達(dá)情況下，EMT過程受到抑制。以上實驗結(jié)果表明Snail參與EMT過程。在TIF的過程中同時伴有miRNA表達(dá)譜的變化[13]，miRNA是一類具有調(diào)控作用的內(nèi)源性非編碼RNA[14]，長20～25個核苷酸。既往研究[15]發(fā)現(xiàn)，miRNA-200家族特別是miRNA-200b可以通過與E-cadherin基因結(jié)合，抑制E-cadherin表達(dá)，從而促進(jìn)EMT過程，此外，miRNA-192[16]、miRNA-21[17]、miRNA-34a[18]等均可通過影響E-cadherin基因表達(dá)，調(diào)控EMT過程。

圖10 Snail轉(zhuǎn)染HK-2細(xì)胞后Snail(A)、vimentin(B)、SMA(C)及E-cadherin(D) mRNA的表達(dá)與空白對照組相比，*P<0.05；與空轉(zhuǎn)染組相比，#P<0.05

本實驗以IgA腎病患者的腎穿刺組織為研究對象，發(fā)現(xiàn)腎組織中Snail與vimentin及SMA蛋白的表達(dá)呈正相關(guān)，與E-cadherin蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)；且Snail蛋白表達(dá)與TIF呈正相關(guān)。其次本實驗構(gòu)建了Snail基因過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由上皮樣轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形細(xì)胞，且在細(xì)胞水平進(jìn)一步驗證Snail高表達(dá)可明顯上調(diào)vimentin、SMA的表達(dá)而下調(diào)E-cadherin的表達(dá)。以上結(jié)果表明Snail參與腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生、發(fā)展過程，并與TIF密切相關(guān)。

近年來圍繞TIF相關(guān)的miRNA研究比較多，前期研究也表明，miRNA在EMT及TIF過程中發(fā)揮重要作用；但目前對EMT過程中miRNA的表達(dá)譜變化研究較少，本實驗利用Human miRNA 8×60K v21.0對空轉(zhuǎn)染組和Snail轉(zhuǎn)染組的HK-2細(xì)胞進(jìn)行芯片分析，結(jié)果表明，Snail轉(zhuǎn)染組有5個miRNA的表達(dá)發(fā)生了顯著變化，本實驗進(jìn)一步針對hsa-miR-1268a、hsa-miR-5703、hsa-miR-5787、hsa-miR-6165和hsa-miR-630進(jìn)行靶基因預(yù)測，通過TargetScan軟件分析，共篩選5 026個靶基因，其中FUT8、LEF-1、MMP-1、MMP-2和MDM-2等靶基因的既往生物學(xué)功能研究與EMT及TIF有關(guān)。FUT8(α1-6巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)可以對TGF-βR、E-cadherin、EGFR等進(jìn)行巖藻糖基化修飾，改變兩者生物學(xué)活性，進(jìn)而參與TIF過程[19]。Snail過表達(dá)上調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase， MMPS)家族成員MMP-1、MMP-9的表達(dá)，從而引發(fā)EMT[20]。Shibata等[21]研究發(fā)現(xiàn)MMP-7可以通過減少E-cadherin蛋白的表達(dá)和上調(diào)β-連環(huán)蛋白/LEF-1信號傳導(dǎo)而誘導(dǎo)EMT。Medici等[22]研究認(rèn)為Snail和LEF-1的相互作用參與TGF-β1誘導(dǎo)EMT的過程，進(jìn)而引起E-cadherin的完全抑制。

總之，Snail可引起腎小管上皮細(xì)胞的生物學(xué)特性發(fā)生改變，EMT的發(fā)生、發(fā)展是一個復(fù)雜的病理過程，在此過程中，Snail處于細(xì)胞內(nèi)各種信號通路的交匯點，參與構(gòu)成了復(fù)雜的細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)系統(tǒng)。因此，Snail作為EMT的潛在標(biāo)志物，有望成為防治腎臟纖維化的新靶點。但有關(guān)Snail及其mRNA的具體調(diào)節(jié)機制以及Snail與已知的調(diào)節(jié)因子的相互作用，有待進(jìn)一步探討。

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Expression of Snail in IgA nephropathy and its relationship with renal tubular epithelial mesenchymal transition

LI Jing, GAO Hui-min, WANG Xian, QIN Rong
(DepartmentofPathology,AnhuiMedicalUniversity,Hefei230032,China)

Purpose To investigate the relationship between Snail and renal tubular epithelial-mesenchymal transition (EMT) or tubulointerstitial fibrosis (TIF) at tissue and cellular levels and to observe the changes of miRNA profile after transfecting Snail gene into human renal tubular epithelial cells (HK-2), to further elucidate the importance of miRNA in the pathogenesis of renal fibrosis. Methods The expression of Snail and EMT-related proteins vimentin, SMA, E-cadherin was detected by immunohistochemistry in renal tissues of 40 patients with IgA nephropathy. The expression of Snail, E-cadherin and SMA in normal control group, empty transfection group and Snail gene transfection group was detected by Western blot and RT-PCR. Furthermore, differentially expressed miRNAs were screened by gene chip. Results By immunohistochemistry, Snail expression was positively correlated with vimentin and SMA, negatively correlated with E-cadherin in IgA nephropathy. The higher degree of the TIF, the stronger the expression of Snail. Compared with the control group, the expression of Snail, vimentin and SMA in the snail transfected group increased. However, E-cadherin decreased at gene and protein level by the RT-PCR and Western blot (P<0.05). The difference was statistically significant. Five distinctly different miRNAs were screened by gene chip after Snail gene was transfected into HK-2 cells, and then 5 026 potential target genes were predicted. Conclusion Snail expression is closely related with renal tubular epithelial mesenchymal transition and tubulointerstitial fibrosis, and it may be used as a new target in EMT prevention. Differentially expressed miRNAs may be involved in the development of EMT and TIF.

nephropathy; renal tubular epithelial cells; Snail; epithelial-mesenchymal transition; immunohistochemistry; miRNA; gene chip

安徽醫(yī)科大學(xué)?？蒲谢?2015xkj121)

安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室，合肥 230032

李 靜，女，碩士研究生。E-mail: sunny_xiaoai@163.com 秦 蓉，女，碩士生導(dǎo)師，通訊作者。E-mail: qinrong0717@163.com

時間：2017-6-20 11:18 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1073.R.20170620.1117.008.html

R 692

A

1001-7399(2017)06-0629-07

10.13315/j.cnki.cjcep.2017.06.008

接受日期：2017-02-13