汪洲，肖玲玲，龔大春

（1.三峽大學(xué)生物催化重點實驗室，湖北宜昌443002；2.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌443002）

皮狀絲孢酵母Trichosporon cutaneum產(chǎn)油脂發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

汪洲1，肖玲玲2，*龔大春1

（1.三峽大學(xué)生物催化重點實驗室，湖北宜昌443002；2.湖北三峽職業(yè)技術(shù)學(xué)院，湖北宜昌443002）

對皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂培養(yǎng)基中的碳氮源種類及添加量、KH2PO4添加量、接種量等影響因素進(jìn)行優(yōu)化。試驗表明，葡萄糖為最佳碳源，蛋白胨為最佳氮源，在葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度1.0 g/L，最佳接種量15%時，油脂得率可達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的62%，比優(yōu)化前提高了50%。

皮狀絲孢酵母；油脂；培養(yǎng)基；優(yōu)化

生物柴油是以生物質(zhì)資源為原料加工而成的一種液態(tài)燃料[1]，是最重要的清潔燃料之一，也是最有發(fā)展前景的柴油替代燃料。生物柴油一般由各種動、植物油脂經(jīng)酯化工藝而得，而微生物油脂的脂肪酸組成與植物油相近，以C16和C18系脂肪酸為主，利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)油脂具有原料豐富、價格便宜、生長周期短等優(yōu)點，且不受場地、季節(jié)、氣候的影響，一年四季均可發(fā)酵生產(chǎn)[2-4]。

研究發(fā)現(xiàn)，不同種屬的微生物具有不同含油量、油脂組成及相對脂肪酸的含量，而皮狀絲孢酵母具有較高的產(chǎn)油能力。就同一種微生物菌株而言，如果培養(yǎng)條件不同，那么其產(chǎn)油量、油脂脂肪酸組成成分及各種脂肪酸的相對含量也不一定相同，任何培養(yǎng)條件的變化都會對最終的產(chǎn)脂量造成直接或間接的影響[5-7]。因此，試驗對皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，為生物油脂的中試放大研究提供一定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

皮狀絲孢酵母（Trichosporon cutaneum），艾倫·麥克德爾米德再生能源研究所提供。

1.1.2 培養(yǎng)基

豆芽汁固體斜面培養(yǎng)基：豆芽100 g/L，白砂糖50 g/L，瓊脂20 g/L，水1 000 mL，pH值自然。于121℃下滅菌20 min，備用。

種子液培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L，MgSO4·7H2O 0.5 g/L，KH2PO41 g/L。

1.1.3 種子液的制備

選取保存于斜面的酵母細(xì)胞，于豆芽汁固體斜面培養(yǎng)基上30℃活化培養(yǎng)72 h，用接種環(huán)挑取2環(huán)活化后的酵母細(xì)胞接入到50 mL的種子液培養(yǎng)基中，于30℃，180 r/min條件下振蕩培養(yǎng)24 h。

1.1.4 發(fā)酵產(chǎn)油脂的培養(yǎng)

以10%接種量接種于50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，于22℃，轉(zhuǎn)速140 r/min，pH值8條件下振蕩培養(yǎng)36 h。每組做5個平行試驗。

1.2 分析方法

1.2.1 菌體濃度的測量

試驗采用池度法對菌體濃度進(jìn)行間接測量。取一定量的培養(yǎng)液，用新鮮培養(yǎng)基稀釋到合適濃度后在紫外分光光度計于波長600 nm處測量吸光度（OD）；以新鮮的培養(yǎng)基做空白對照。每個樣品重復(fù)測定3次，取其平均值。

1.2.2 菌體干質(zhì)量的測量

試驗采用稱質(zhì)量法測定菌體干質(zhì)量，取出一定體積的發(fā)酵液（通常為5 mL）至已烘干稱質(zhì)量的10 mL離心管中，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min，棄上清液，用去離子水洗滌3次，離心去上清液后置于105℃烘箱烘至恒質(zhì)量，稱質(zhì)量。菌體干質(zhì)量的計算公式如下：

式中：總質(zhì)量——樣品烘干后的質(zhì)量，g；管質(zhì)量——空管子烘干后的質(zhì)量，g；

V液——用來測干質(zhì)量發(fā)酵液的體積，L。

1.2.3 油脂含量的測量

試驗采用酸熱——有機(jī)溶劑萃取法，對油脂進(jìn)行提取。量取一定體積的發(fā)酵液，以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心5 min去上清液，用去離子水洗滌菌體2遍，離心棄上清液。向盛有菌體的離心管中加入適量4 mol/L的HCl溶液浸泡30 min，沸水浴10 min，置于冰上迅速冷卻15 min，再加入3～4倍體積的甲醇-氯仿溶劑（甲醇∶氯仿=1∶2，V/V），混勻后，以轉(zhuǎn)速180 r/min振蕩1 h，10 000 r/min離心5 min，使有機(jī)相和水相迅速分離，用玻璃針管吸取下層有機(jī)相至預(yù)先烘干稱質(zhì)量的50 mL圓口燒瓶中，80℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉有機(jī)溶劑，置于烘箱至恒質(zhì)量，用分析天平稱量得到油脂質(zhì)量。

2 結(jié)果分析

2.1 不同碳源對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

碳源是發(fā)酵培養(yǎng)基的主要成分之一，可以作為微生物細(xì)胞結(jié)構(gòu)或代謝產(chǎn)物中碳價來源的營養(yǎng)物質(zhì)。為了能利用秸稈糖化液，試驗采用葡萄糖與木糖以不同的比例添加到培養(yǎng)基后，進(jìn)行皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂的研究。

不同碳源對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表1。

表1 不同碳源對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

由表1可知，當(dāng)葡萄糖與木糖的質(zhì)量濃度比例越大，菌體干質(zhì)量越大，油脂得率也越高，說明葡萄糖更適宜菌體的生長和油脂的合成，同時結(jié)果也表明木糖也能為皮狀絲孢酵母所利用。因此，試驗選擇更能促進(jìn)菌體生長和油脂合成增加的葡萄糖作為碳源。

2.2 不同氮源對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

氮源作為培養(yǎng)基中必不可少的部分，一般只提供合成細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞中其他結(jié)構(gòu)的原料，不作為能源。氮源又分有機(jī)氮源和無機(jī)氮源，其中蛋白胨為有機(jī)氮源，硫酸銨為無機(jī)氮源，又為速效性氮源。不同氮源對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表2。

表2 不同氮源對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

由表2可知，蛋白胨與硫酸銨以不同比例添加到培養(yǎng)基后，觀察皮狀絲孢酵母發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況，結(jié)果顯示有機(jī)氮源明顯更促進(jìn)菌體密度的增大和油脂含量的增大，這是由于有機(jī)氮源中含有豐富的蛋白質(zhì)和氨基酸類物質(zhì)，能有效地促進(jìn)菌體生長和產(chǎn)物合成；而無機(jī)氮源雖能供菌體生長，卻不利于代謝產(chǎn)物的合成。其中，以蛋白胨為氮源時，油脂得率和菌體干質(zhì)量在發(fā)酵結(jié)束時最大。因此，試驗選擇更能促進(jìn)菌體生長和油脂合成增加的蛋白胨作為氮源。

2.3 不同碳氮源添加量對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

不同碳氮源添加量對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表3。

由表3可知，隨著碳氮源添加量的增大，菌體干質(zhì)量減小，但油脂得率隨之增大，說明在適宜的碳氮添加量范圍內(nèi)有利于油脂的合成增加；隨著葡萄糖和蛋白胨質(zhì)量濃度的升高，菌體干質(zhì)量會隨之增大。葡萄糖質(zhì)量濃度為20～40 g/L時，油脂得率會隨著升高；但質(zhì)量濃度繼續(xù)升高，油脂得率會隨著降低。說明碳氮源的質(zhì)量濃度過高，仍能有利于皮狀絲孢酵母的大量繁殖，但同時會增大發(fā)酵液黏度，從而影響溶解氧體積分?jǐn)?shù)，引起菌體的代謝異常，最后影響油脂的合成。結(jié)果表明，葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L為最佳碳氮源組合，油脂得率最高可達(dá)59.77%。

2.4 不同KH2PO4質(zhì)量濃度對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

KH2PO4是微生物生長和代謝所需的磷酸鹽和鉀鹽的重要來源，磷是某些蛋白質(zhì)和核酸的組成成分。腺二磷（ADP）、腺三磷（ATP）是重要的能量傳遞者，參與一系列的代謝反應(yīng)。磷酸鹽在培養(yǎng)基中還具有緩沖作用。微生物對磷的需要量一般為0.005～0.010 mol/L。鉀不參與細(xì)胞結(jié)構(gòu)物質(zhì)的組成，它是許多酶的激活劑。將KH2PO4以不同質(zhì)量濃度添加到培養(yǎng)基后，研究皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的情況。

不同KH2PO4質(zhì)量濃度對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表4。

表3 不同碳氮源添加量對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

表4 不同KH2PO4質(zhì)量濃度對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

由表4可知，當(dāng)KH2PO4質(zhì)量濃度從0增加至1.0 g/L時，菌體干質(zhì)量和油脂含量會隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的增加而增大，說明適宜的KH2PO4質(zhì)量濃度會促進(jìn)皮狀絲孢酵母的生長和產(chǎn)物的合成；但隨著KH2PO4質(zhì)量濃度繼續(xù)增大，菌體干質(zhì)量和油脂得率反而降低，說明過量的KH2PO4會抑制菌體的生長和產(chǎn)物的合成，并且浪費資源。因此，確定KH2PO4質(zhì)量濃度1.0 g/L時為最佳。

2.5 接種量對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂的影響

接種量決定了生產(chǎn)菌種在發(fā)酵罐中的繁殖速度。通常接種量過小，除了延長發(fā)酵周期外，往往還引起其他不正常情況；接種量過高，會使菌體生長過快，培養(yǎng)液黏度過高，造成供氧不足，影響發(fā)酵水平。

接種量對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響見表5。

表5 接種量對皮狀絲孢酵母產(chǎn)油脂的影響

由表5可知，接種量在5%～15%時，隨著接種量的增加，菌體干質(zhì)量增大，油脂得率也增大；接種量過大，會增加生產(chǎn)成本，20%的接種量對產(chǎn)油脂貢獻(xiàn)增加不大。因此，確定接種量為15%。

2.6 優(yōu)化條件下產(chǎn)油脂試驗

通過以上培養(yǎng)基條件優(yōu)化，在葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度1.0 g/L，接種量15%時，油脂得率可達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的62%。

3 結(jié)論

通過對皮狀絲孢酵母搖瓶發(fā)酵產(chǎn)油脂條件中的不同碳氮源種類及添加量、KH2PO4質(zhì)量濃度、接種量進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明葡萄糖為最佳碳源，蛋白胨為最佳氮源，且在葡萄糖40 g/L，蛋白胨1.33 g/L，KH2PO4質(zhì)量濃度1.0 g/L，接種量15%時，油脂得率可達(dá)到細(xì)胞干質(zhì)量的62%，比優(yōu)化前提高了50%。

[1]邱松山，王彥安，林夢紅.發(fā)酵荔枝渣制備微生物油脂[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2015，41（8）：116-120.

[2]陳士華，孫強，孫莉云.一株高產(chǎn)油脂微生物菌種的篩選與鑒定[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)版），2013，34（6）：65-68.

[3]袁錦云，艾佐佐，張志斌.皮狀絲孢酵母B3利用木薯淀粉發(fā)酵生產(chǎn)微生物油脂[J]．生物工程學(xué)報，2011，27（3）：453-460.

[4]崔丁維，胡學(xué)超，包珊珊，等.酶法破碎微生物細(xì)胞的研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報，2010，37（11）：1 672-1 678.

[5]Gao Z，Ma Y Q，Wang Q H，et al.Effect of crude glycerol impurities on lipid preparation by Rhodosporidium toruloides yeast 32489[J].Bioresource Technology，2016（8）：373-379.

[6]孔凡敏，趙祥穎，田延軍，等.酸熱法提取酵母油脂條件的研究[J].中國釀造，2010（5）：143-146.

[7]王敏，李市場，劉紅霞，等.粘紅酵母Rhodotorula glulinis微生物油脂提取工藝研究[J].中國糧油學(xué)報，2010，25（6）：71-75.◇

Optimization of Fermentation Medium for Lipid Production from Trichosporon cutaneum

WANG Zhou1，XIAO Lingling2，*Gong Dachun1
（1.Key Lab of Biocatalysis，China Three Gorges University，Yichang，Hubei 443002，China；2.Hubei Three Gorges Polytechnic，Yichang，Hubei 443002，China）

The effective factors of carbon and nitrogen source，carbon and nitrogen amount，KH2PO4amount，different inoculation volume on lipid production from Trichosporon cutaneum are optimized.The results show that the glucose is the best carbon source，peptone is the best nitrogen source.The lipid yield can be up to 62%under the conditions of glucose 40 g/L，peptone 1.33 g/L，KH2PO41.0 g/L，the inoculation volume 15%with increasing 50%than before.

Trichosporon cutaneum；lipid；medium；optimization

Q93

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.003

1671-9646（2017）06a-0009-03

2017-05-07

宜昌市科技攻關(guān)項目“纖維素糖化制備微生物柴油的工藝研究”（A15-301-B04）。

汪洲（1989—），男，在讀碩士，研究方向為微生物發(fā)酵。

*通訊作者：龔大春（1967—），男，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為微生物育種、發(fā)酵及新型酶制劑。