鐘玉心，洪，關(guān)潔婷，王偉

（1.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州510000；2.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東東莞523000；3.廣州市怡臻原文化傳播有限公司，廣東廣州510000）

金黃色葡萄球菌中的群感效應(yīng)研究

鐘玉心1，洪2，關(guān)潔婷3，王偉2

（1.廣州市食品檢驗(yàn)所，廣東廣州510000；2.東莞出入境檢驗(yàn)檢疫局，廣東東莞523000；3.廣州市怡臻原文化傳播有限公司，廣東廣州510000）

金黃色葡萄球菌是一種能夠引起繼發(fā)性感染的典型機(jī)會(huì)致病菌，可以引起局部化膿感染，也可以引發(fā)肺炎、心內(nèi)膜炎甚至敗血癥等全身感染。而群感效應(yīng)在金黃色葡萄球菌所引起的疾病和毒素表達(dá)中都起著關(guān)鍵性作用。群感效應(yīng)是一種細(xì)胞間的信息交流過(guò)程，它可以使得細(xì)菌之間相互傳遞關(guān)于外界環(huán)境和種群數(shù)量的信息，進(jìn)而相應(yīng)地調(diào)整基因表達(dá)，以確保自身能夠最大程度地適應(yīng)外界環(huán)境。介紹金黃色葡萄球菌中的群感效應(yīng)系統(tǒng)，并對(duì)其4種基因元件——AgrBDCA及其作用進(jìn)行了闡述。

金色葡萄球菌；群感效應(yīng)；基因表達(dá)

0 引言

群感效應(yīng)（Quorum sensing）是細(xì)菌為了應(yīng)對(duì)種群數(shù)量變化或是外界環(huán)境限制的一種調(diào)節(jié)相關(guān)基因表達(dá)的作用機(jī)制[1-5]。1979年，人們首次對(duì)費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri）和哈氏弧菌（Vibrio harveyi）中的群感效應(yīng)進(jìn)行了報(bào)道[1，3，6]。費(fèi)氏弧菌寄生夏威夷短尾魷魚(yú)（Euprymna scolopes）的發(fā)光器官中，當(dāng)細(xì)菌的數(shù)量達(dá)到一定程度會(huì)誘導(dǎo)與生物發(fā)光相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，從而發(fā)光。夏威夷短尾魷魚(yú)利用所發(fā)出的光進(jìn)行交流、捕食、躲避天敵[6-7]。正是由于群感效應(yīng)的存在，細(xì)菌可以在整個(gè)菌群的范圍內(nèi)調(diào)整基因表達(dá)，使整個(gè)菌群的行為協(xié)調(diào)一致，這使得細(xì)菌不再是簡(jiǎn)單相互獨(dú)立的個(gè)體，更像是一個(gè)多細(xì)胞的生命體[5，6，8]。

細(xì)菌會(huì)產(chǎn)生一種小分子的化學(xué)物質(zhì)作為群感效應(yīng)中的信號(hào)[9]。在相對(duì)封閉的環(huán)境中，這種信號(hào)分子會(huì)隨著細(xì)菌數(shù)量的增多而增多，當(dāng)信號(hào)分子的濃度達(dá)到一定閾值時(shí)，將會(huì)對(duì)細(xì)菌的基因表達(dá)產(chǎn)生一些調(diào)節(jié)作用，這種化學(xué)信號(hào)稱之為自誘導(dǎo)物（Autoinducer，AIs）。有些自誘導(dǎo)物能夠促進(jìn)自身的生成，而有些則不能[2-3，5，9]。一般來(lái)說(shuō)，革蘭氏陰性菌的自誘導(dǎo)物是N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯（Nacyl-homoserine lactones，HSLs），而革蘭氏陽(yáng)性菌是一種小分子短肽（Autoinducer peptides，AIPs）[2-3，9，10]，這2類(lèi)自誘導(dǎo)物的共同點(diǎn)就是在構(gòu)型上二者都具有內(nèi)酯環(huán)。但是HSLs以自由擴(kuò)散的方式自由地出入細(xì)胞，當(dāng)HSLs濃度達(dá)到閾值后，會(huì)與存在于細(xì)胞質(zhì)中特殊的受體蛋白結(jié)合，活化后的受體蛋白可以作為一種轉(zhuǎn)錄激活因子調(diào)控基因的表達(dá)[2，9]。而AIPs并不能直接進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，它需要與位于細(xì)胞膜上的受體蛋白結(jié)合，通過(guò)受體蛋白來(lái)與其他蛋白的作用用調(diào)控基因表達(dá)[2]。

1 金黃色葡萄球菌中的群感效應(yīng)通路

對(duì)于葡萄球菌這類(lèi)機(jī)會(huì)致病菌來(lái)說(shuō)經(jīng)常會(huì)分泌一些胞外物質(zhì)，這些胞外物質(zhì)能夠有效地保護(hù)細(xì)菌免受宿主免疫系統(tǒng)的侵襲，使細(xì)菌牢固地黏附在宿主細(xì)胞表面，而且在一定程度上能夠降解宿主組織細(xì)胞，為細(xì)菌提供營(yíng)養(yǎng)[9]。這些胞外物質(zhì)的分泌與基因表達(dá)高度協(xié)調(diào)，并且與細(xì)菌的生理需要密切相關(guān)。對(duì)于金黃色葡萄球菌來(lái)說(shuō)，群感效應(yīng)系統(tǒng)——Agr系統(tǒng)作為核心調(diào)節(jié)元件之一，可以對(duì)胞外物質(zhì)與毒素的分泌進(jìn)行有效調(diào)控。也有研究發(fā)現(xiàn)，有一些金黃色葡萄球菌會(huì)利用LuxS的產(chǎn)物AI-2（Autoinducer-2），一種呋喃酰硼酸二酯來(lái)進(jìn)行種間的信息傳遞。

Agr系統(tǒng)所編碼出的蛋白構(gòu)成了金黃色葡萄球菌中的群感效應(yīng)通路，其中包括了2個(gè)不同的啟動(dòng)子，即P2與P3。P2的轉(zhuǎn)錄本包含了AgrD，AgrB，AgrC與AgrA 4個(gè)基因，P3的轉(zhuǎn)錄本為RNAIII。AgrC與AgrA共同構(gòu)成了經(jīng)典的二元應(yīng)答調(diào)節(jié)系統(tǒng)，而AgrD與AgrB負(fù)責(zé)AIP的產(chǎn)生與加工。成熟的AIP會(huì)被分泌到細(xì)胞外，當(dāng)AIPs的濃度達(dá)到一定閾值會(huì)活化位于細(xì)胞膜上的AgrC受體。細(xì)胞質(zhì)內(nèi)的AgrA被AgrC激活后，會(huì)與P2，P3啟動(dòng)子結(jié)合調(diào)節(jié)基因表達(dá)。RNAIII具有雙重作用，一方面可以促進(jìn)毒素基因的表達(dá)，另一方面抑制了表面蛋白相關(guān)基因的表達(dá)。在革蘭氏陽(yáng)性菌中，大多數(shù)都具備這一群感效應(yīng)通路。

在體外培養(yǎng)中，金黃色葡萄球菌分泌胞外蛋白可以分為2個(gè)階段。初期主要是負(fù)責(zé)黏附的蛋白，如蛋白A（ProteinA）、凝固酶、纖維蛋白結(jié)合蛋白（Fibronection binding proteins），后期主要是一些蛋白酶、降解酶、溶血素和毒素。研究結(jié)果也顯示，在細(xì)菌生長(zhǎng)的指數(shù)后期，負(fù)責(zé)編碼表面蛋白的基因表達(dá)量有所下降，而負(fù)責(zé)編碼毒素蛋白和降解蛋白的基因表達(dá)量有所上升。在這不同階段的轉(zhuǎn)變中，Agr系統(tǒng)起著重要的作用。

金黃色葡萄球菌中的Agr系統(tǒng)見(jiàn)圖1。

圖1 金黃色葡萄球菌中的Agr系統(tǒng)

2 Agr介導(dǎo)群感效應(yīng)通路的組成元件

2.1 AgrB

在葡萄球菌中，AgrB的N端1/3和AgrC的C端組氨酸激酶域是保守區(qū)域，其他則是可變區(qū)，這使得在Agr系統(tǒng)在金黃色葡萄球菌中可以分為4類(lèi)。每一類(lèi)Agr系統(tǒng)都會(huì)產(chǎn)生特異的AIPs信號(hào)和與之相對(duì)應(yīng)的AgrC受體。AIPs會(huì)特異性地活化與之同源的AgrC受體，抑制異源的AgrC，即使AIP上1個(gè)氨基酸的改變都會(huì)影響這種特異性。

葡萄球菌中的4類(lèi)AIP見(jiàn)圖2。

圖2 葡萄球菌中的4類(lèi)AIP

2.2 AgrD

AgrD負(fù)責(zé)編碼出AIPs的前體，這種前體AIPs會(huì)在相關(guān)酶的作用下在C段和N段接受加工，在半胱氨酸和C端形成1個(gè)硫代內(nèi)酯環(huán)。所形成的硫代內(nèi)酯環(huán)對(duì)AIPs至關(guān)重要，而且是AIPs的特征之一。AgrB是位于細(xì)胞膜上的肽鏈內(nèi)切酶，對(duì)于AIP的合成加工具有重要作用。AgrB可以特異性地識(shí)別AgrD的C端序列，并催化硫代內(nèi)酯環(huán)的形成。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，這種作用與AgrB上保守組氨酸和半胱氨酸殘基有關(guān)。

AgrB識(shí)別AgrD的特異性略低于AgrC識(shí)別AIP的特異性，所以不同類(lèi)別的AgrB與AgrD可以相互作用。研究發(fā)現(xiàn)，AgrB-I可以以相同的速率對(duì)A-grD-I與AgrD-III進(jìn)行加工。對(duì)比金黃色葡萄球菌的4種AgrD序列可以發(fā)現(xiàn)，AIPs由7～9個(gè)氨基酸殘基所組成，其中包含了1個(gè)保守的半胱氨酸，在C末端有2個(gè)疏水氨基，由半胱酸與C末端的疏水氨基酸形成五元硫代內(nèi)酯環(huán)。

在金黃色葡萄球菌中4類(lèi)AgrD的序列見(jiàn)表1。

4種AIPs的結(jié)構(gòu)如圖2所示，結(jié)構(gòu)中的硫代內(nèi)酯環(huán)是整個(gè)AIPs活性的中心，其所用涉及整個(gè)Agr系統(tǒng)的激活與抑制。如果把AIPs中的硫代內(nèi)酯環(huán)用內(nèi)酯環(huán)所取代，那么其激活同源AgrC受體的功能將會(huì)消失，但仍具有抑制異源AgrC的功能。當(dāng)然AIPs的N端尾部結(jié)構(gòu)也能夠影響其功能，將AIPsII N端第3位的丙氨酸用天冬氨酸代替之后，它會(huì)抑制所有的4類(lèi)AgrCs受體。由此可見(jiàn)，AIPs的功能與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。

2.3 AgrC

AgrC作為Agr系統(tǒng)中的受體屬于組氨酸蛋白激酶的一種，它有2個(gè)部分構(gòu)成：N端的跨膜感受域（Transmeme brane sensor domain）和C端的組氨酸蛋白激酶域（Histidine protein kinase domain）。AgrC的組氨酸蛋白激酶域其氨基酸序列高度保守，但是跨膜感受域涉及AIPs的特異性識(shí)別，其序列是可變的。

AgrCI的氨基酸序列見(jiàn)圖3。

表1 在金黃色葡萄球菌中4類(lèi)AgrD的序列

圖4 AgrC的二聚體結(jié)構(gòu)

圖3 AgrC I的氨基酸序列

有人將4類(lèi)AgrC的近端感受域與遠(yuǎn)N端感受域進(jìn)行了互換，以研究其具體功能。結(jié)果顯示，AIPs的特異性識(shí)別主要涉及遠(yuǎn)端感受域，非特異性的連接和信號(hào)傳遞涉及跨膜螺旋3，4，6和膜外第3個(gè)環(huán)結(jié)構(gòu)。

George等人認(rèn)為，AgrC受體是以二聚體的方式在細(xì)胞膜上聚集的。將在受體組氨酸（Receptorhistindine）或是供體激酶結(jié)構(gòu)域（Donorkinasedomain）存在變異的AgrC I和AgrC II導(dǎo)入不存在AgrC基因的細(xì)菌中，會(huì)發(fā)現(xiàn)本應(yīng)該沒(méi)有活性的Agr系統(tǒng)也出現(xiàn)了一定的活性。相關(guān)研究認(rèn)為AgrC是以2聚體的方式在一起，至使不同受體的激酶域卷曲螺旋緊密相連，組成4-螺旋束結(jié)構(gòu)域（4-helixbundle）。這樣當(dāng)活化后的感受域影響4-螺旋束結(jié)構(gòu)域時(shí)，才會(huì)進(jìn)一步活化2個(gè)受體的激酶結(jié)構(gòu)域[9]。

AgrC的二聚體結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖4。

2.4 AgrA

AgrA是一種反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白（Response regulator），是LytTR反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白家族中的一員，可以與Agr系統(tǒng)的2個(gè)啟動(dòng)子結(jié)合，促進(jìn)基因的轉(zhuǎn)錄。Robbin等人的研究表明，P2和P3啟動(dòng)子在下游重復(fù)序列存在著2 bp的不同。這種不同導(dǎo)致了AgrA與2個(gè)啟動(dòng)子的親和力不同，AgrA更容易與P2結(jié)合。SarA也有著可以和P2啟動(dòng)子結(jié)和，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的功能，在一些特定的條件下AgrA可以和SarA共同作用，促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄。

2.5 RNAIII

RNAIII是位于細(xì)胞內(nèi)Agr系統(tǒng)的效應(yīng)子（Effector），大小為514個(gè)核苷酸，其半衰期在45 min以上。RNAIII的序列在不同種微生物中表現(xiàn)不同，但是它的結(jié)構(gòu)類(lèi)似，這使得種間的信息交流成為可能。

關(guān)于RNAIII的功能研究揭示了其3'端對(duì)于抑制蛋白A（spa編碼）的表達(dá)十分必要，沒(méi)有重疊的5'和3'區(qū)域可以獨(dú)立地促進(jìn)α-溶血素（hla編碼）的表達(dá)。也就是說(shuō)，RNAIII可以幫助實(shí)現(xiàn)細(xì)菌從表達(dá)表面蛋白到表達(dá)毒素的轉(zhuǎn)變。在第7，13和14個(gè)莖環(huán)結(jié)構(gòu)中，那些富含胞嘧啶的環(huán)結(jié)構(gòu)與典型的SD區(qū)（Shine-Dalgarnosequecnce）互補(bǔ)，這也意味著RNAIII的基本功能使作為反義RNA參與胞外毒素的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。RNAIII與hlamRNA的SD區(qū)結(jié)合后，可以改變hlamRNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)，使其更易于翻譯。而RNAIII和蛋白A及纖維素結(jié)合蛋白（Fibrinogen-binding protein）的轉(zhuǎn)錄本起始位點(diǎn)結(jié)合，阻礙翻譯的發(fā)生。同時(shí)研究表明，RNAIII也可以通過(guò)類(lèi)似的機(jī)制來(lái)阻礙另外一個(gè)轉(zhuǎn)錄影響因子Rot的合成。Rot的功能和RNAIII的正好相反，Rot可以促進(jìn)表面蛋白的產(chǎn)生，抑制分泌蛋白的產(chǎn)生[2]。

RNAIII的二級(jí)結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖5。

3 Agr系統(tǒng)的作用

生物被膜（Biofilm）的形成是細(xì)菌體內(nèi)極其復(fù)雜的一個(gè)過(guò)程，同時(shí)它也受到自身基因的調(diào)控和試驗(yàn)條件的影響。被膜的形成可以分為2種不同的機(jī)制：①以PIA為基本物質(zhì)的被膜；②以黏附蛋白為基本物質(zhì)的被膜[2]。

有研究表明，Agr缺陷性的金黃色葡萄球菌和Agr缺陷型的表面葡萄球菌能比攜帶Agr的菌株形成更加厚重的被膜，這也許是和Agr系統(tǒng)可以上調(diào)δ溶血素的表達(dá)，下調(diào)黏附蛋白的表達(dá)[2]。黏附蛋白的表達(dá)在被膜形成的初期起著關(guān)鍵性作用，而δ溶血素則能夠裂解成熟的生物被膜。有研究表明，Agr系統(tǒng)的主要作用是通過(guò)上調(diào)蛋白酶產(chǎn)生引起生物被膜的裂解，蛋白對(duì)保持生物被膜的完整性具有重要作用。

總的來(lái)說(shuō)，QS對(duì)于金黃色葡萄球菌生物被膜形成的動(dòng)態(tài)過(guò)程具有重要作用，但是簡(jiǎn)單地認(rèn)為QS是可以促進(jìn)被膜生成或是可以抑制被膜生成又太過(guò)武斷。有研究表明，RIP（YSPWTNF）一種七肽，可以干擾金黃色葡萄球菌生物被膜的形成，而且這種干擾是通過(guò)抑制Agr系統(tǒng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的。而這正與之前的Agr系統(tǒng)可以抑制生物被膜的研究結(jié)果相矛盾，所以RIP干擾生物被膜的具體機(jī)制需要進(jìn)一步探究。

在動(dòng)物感染試驗(yàn)中，Agr也是一種重要的影響因子。在皮膚膿腫（Skin abscesses）、心內(nèi)膜炎（Endocarditis）等動(dòng)物模型中，發(fā)現(xiàn)Agr突變有所減弱。而且醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)也顯示出，Agr系統(tǒng)對(duì)于金黃色葡萄球菌所引起的感染具有重要作用。在由葡萄球菌所引起的肺炎中，20%分離出的菌種不攜帶Agr。雖然Agr缺陷型菌株也有治病能力，但是所引起疾病的嚴(yán)重程度明顯低于具有Agr的菌株[9]。

4 結(jié)論

群感效應(yīng)對(duì)于細(xì)菌調(diào)節(jié)機(jī)體行為至關(guān)重要，同時(shí)也可以使其探索新的適宜生存環(huán)境。基于自誘導(dǎo)物的產(chǎn)生和檢測(cè)，QS系統(tǒng)可以在整個(gè)菌群范圍內(nèi)調(diào)整基因的表達(dá)。而其他調(diào)節(jié)機(jī)制正是在QS的整體調(diào)節(jié)基礎(chǔ)上，確保調(diào)節(jié)基因表達(dá)都能準(zhǔn)確應(yīng)對(duì)外界環(huán)境的變化。

同時(shí)，QS系統(tǒng)也和生物被膜的形成相關(guān)。在生物被膜包被下的細(xì)菌，都能夠從這種彼此的信息傳遞中受益。在QS中所涉及到的自誘導(dǎo)物小分子是一種核心調(diào)節(jié)子，現(xiàn)在這種生物小分子調(diào)節(jié)細(xì)菌行為的作用已漸漸被人們賦予了新的意義。人們可以通過(guò)調(diào)控這些生物小分子來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)菌行為，進(jìn)而控制疾病，而且這種新的治療方法其目的是減少病原菌毒素的表達(dá)，而不是抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)。所以，通過(guò)干擾生物小分子調(diào)節(jié)通路的治療方法是在抗生素治療方法之后的新型方法。

圖5 RNAIII的二級(jí)結(jié)構(gòu)

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Research on the Quorum Sensing of Staphylococcus aureus

ZHONG Yuxin1，HONG Yuan2，GUANG Jieting3，WANG Wei2
（1.Guangzhou Institute for Food Control，Guangzhou，Guangdong 510000，China；2.Dongguan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Dongguan，Guangdong 523000，China；3.Guangzhou Yizhenyuan Cultural Diffusion Co.，Ltd.，Guangzhou，Guangdong 510000，China）

Staphylococcus aureus is a kind of typical opportunistic pathogens that can cause secondary infection，it can cause local purulent infection，also can cause pneumonia，endocarditis，and even sepsis systemic infection.The quorum sensing in diseases caused by Staphylococcus aureus and toxin expression plays a key role.Quorum sensing is a kind of communication process between the cells，it can make bacteria pass each other information about the external environment and population，and then adjust gene expression，to ensure that itself adapt to the environment to a great extent.The quorum sensing of Staphylococcus aureus is reviewed in this paper，and the four kinds of genetic elements——AgrBDCA and their effect are expounded.

Staphylococcus aureus；quorum sensing；gene expression

R392

A

10.16693/j.cnki.1671-9646（X）.2017.06.018

1671-9646（2017）06a-0055-04

2017-04-15

鐘玉心（1986—），女，本科，助理工程師，研究方向?yàn)槭称诽砑觿┑臋z驗(yàn)。