郭鳳霞， 陳 垣， 張藎鳳， 白 剛

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學甘肅省中藥材規(guī)范化生產(chǎn)技術(shù)創(chuàng)新重點實驗室，甘肅省藥用植物栽培育種工程研究中心， 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，生命科學技術(shù)學院，農(nóng)學院，蘭州 730070； 2.甘肅天士力中天藥業(yè)有限責任公司， 甘肅省特色藥用植物資源保護與利用工程實驗室，甘肅省特色藥材規(guī)范化可追溯栽培工程技術(shù)研究中心，定西 748100)

暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)為藥材川貝母的基原植物之一，以干燥鱗莖入藥，夏、秋二季或積雪融化后采挖，清洗曬干或低溫干燥后藥用，味苦、甘，微寒，歸肺、心經(jīng)，具有清熱潤肺、散結(jié)消疽等功效，用于痰中帶血、乳疽等癥[1]，其鱗莖中含有多種生物堿和微量元素等[2-3]。暗紫貝母野生于海拔3 100～4 500 m的高山或草原，是藥材“松貝”的主要來源[4]，我國主產(chǎn)于四川、甘肅、青海等高海拔草原地帶[5-6]。甘肅主要分布在甘南州、渭源、漳縣、岷縣高寒山區(qū)，分布范圍十分有限，野生資源極其稀少[7]。

川貝母基原植物屬百合科(Liliaceae)貝母屬(Fritillaria)多年生草本藥用植物，適生環(huán)境氣候冷涼，生長發(fā)育極其緩慢，年生長量很小，生長周期長，從種子播種至開花結(jié)果需5年及以上時間，生長4 年才可采挖藥材，藥材產(chǎn)量低[5-7]。藥材主要依賴野生資源，現(xiàn)因采挖過度，加上人畜擾動加大，草地退化引起野生資源趨于枯竭[8-9]，其中暗紫貝母、川貝母(F.cirrhosa)和甘肅貝母(F.przewalskii)均已成為國家二級瀕危保護植物，由于藥材市場對暗紫貝母認可度高，造成供不應(yīng)求，價格昂貴，甘肅境內(nèi)野生品已趨滅絕，資源的可持續(xù)性遭到威脅[7]?？沙掷m(xù)主要指自然資源及其開發(fā)利用程度間的平衡[10]。自然條件下，暗紫貝母更新主要依賴地下根莖無性繁殖，因其種子具有較強的后熟和休眠特性，自然有性繁殖幾率很低。野生馴化栽培時，多采用鱗莖繁殖，繁殖成本高，嚴重限制了規(guī)模化種植的推進，藥材還主要依賴野生資源，遠不能滿足市場需求。利用種子馴化栽培無疑成為保護生態(tài)環(huán)境，提高野生資源再生性的有效途徑[11]。國內(nèi)外對百合科植物開花物候和繁育特性開展了大量工作。Duffyh和Johnson發(fā)現(xiàn)[12]，雌雄同花百合科植物Bulbineabyssinica去除花藥和花絲后蜜蜂很少訪花，幾乎不結(jié)種子。Shoichi等[13]調(diào)查顯示，日本島嶼本州中心沿海岸線低洼區(qū)分布一種百合科貝母屬植物(F.koidzumiana)，屬典型春季短命落葉林，多年多次開花，子房結(jié)實率達75%。我國研究發(fā)現(xiàn)海拔高度影響暗紫貝母生物量分配[4]，也影響花朵和果實的大小及種子的質(zhì)量[8-9]，已通過研究探明了甘肅貝母種子灌漿和發(fā)芽特性[5-6]，并探尋出破除休眠促進后熟，提高種子發(fā)芽率的關(guān)鍵技術(shù)[14-15]。陳垣等[7]研究發(fā)現(xiàn)，暗紫貝母花藥開裂與強柱頭可受性同步，柱頭活力持續(xù)期更長，判斷有性繁育系統(tǒng)應(yīng)屬于部分自交親和異交需傳粉者。

上述研究對選擇川貝母馴化栽培適宜生態(tài)區(qū)和種子繁育策略提供了重要參考，但至今對暗紫貝母等川貝母基原植物的傳粉結(jié)實特性的系統(tǒng)研究尚少見報道，野生環(huán)境下暗紫貝母零星分布在灌木叢或草叢中，很難找到足量的暗紫貝母開花居群定點進行相關(guān)研究。開花物候和傳粉方式是反映植物有性生殖更新能力的重要依據(jù)[16-18]，因此，在適宜生態(tài)區(qū)對野生馴化栽培的暗紫貝母物候及授粉結(jié)實特性的深入研究具有重要意義，可為制定川貝母基原植物野生馴化種子繁育規(guī)程提供科學依據(jù)，促進暗紫貝母資源的可持續(xù)化利用和發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗區(qū)概況與研究材料

試驗區(qū)位于甘肅省定西市漳縣南部山區(qū)石川鄉(xiāng)甘肅農(nóng)業(yè)大學川貝母基地(34°35′29″ N，104°19′41″ E)，東連岷縣蒲麻鎮(zhèn)，西靠四族鄉(xiāng)，南與岷縣禾馱鄉(xiāng)接壤，北接草灘鄉(xiāng)，屬典型高寒陰濕氣候。試區(qū)海拔3 100 m，無霜期126 d，年均降雨量500 mm，土層深厚、土壤肥沃，適宜暗紫貝母生長發(fā)育[7]。試驗地位于坡度15°山坡上，占地面積2 500 m2。

暗紫貝母鱗莖2013年7月15-18日采自四川省紅原縣，分選出大鱗莖(經(jīng)陳垣教授鑒定確認為4～5年生)，帶土保濕運回漳縣。2013年7月20日在生荒地采用畦壟撒播，畦壟高5 cm，覆土厚度3 cm，播種后遮蓋遮陽網(wǎng)。2014年返青后揭去遮陽網(wǎng)，仿野生栽培返青株經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學中草藥栽培與鑒定系陳垣教授鑒定確認為暗紫貝母(Fritillariaunibracteata)。

1.2 開花物候動態(tài)觀察

從鱗莖播種開始定期田間觀察暗紫貝母返青及生長發(fā)育動態(tài)。2015年返青后從5月1日花蕾顯現(xiàn)開始，田間選取暗紫貝母代表性植株20株掛牌標記，每隔3 d觀察測定植株生長發(fā)育指標和花蕾大小、開花進程、開花順序、單花結(jié)構(gòu)、花粉散出和花朵萎蔫等生長發(fā)育動態(tài)，直到蒴果成熟采收為止，采用游標卡尺測定莖粗(stem diameter)、花冠長度(corolla length)和花冠直徑(corolla diameter)等生長發(fā)育指標，莖粗測定部位為莖基部2 cm處，花冠直徑測定部位為花冠上部開口處。每年返青后開花期觀察地上部分植株形態(tài)變化和物候特征，田間觀察統(tǒng)計株型結(jié)構(gòu)和植株形態(tài)。

1.3 花朵操作及人工雜交授粉試驗

暗紫貝母花蕾套袋雜交授粉操作試驗于2015年5-7月在田間進行，花蕾操作處理試驗采用單因素試驗方案，完全隨機設(shè)計，共設(shè)8個處理組，即(1)自然授粉對照(natural pollination CK)：自然條件下不進行任何處理，用來檢測自然結(jié)實率(rate of natural fruit-set)，重復(fù)60朵花；(2)不去雄套紙袋(bagged without castration)：自然條件下對花蕾采用硫酸紙袋套袋處理，以隔絕蟲媒和風媒傳粉機會，用于檢測自動自交能力和自然自交親和性(self-compatibility)，重復(fù)30朵花；(3)不去雄套網(wǎng)袋(netted without castration)：自然條件下對花蕾采用孔徑1 mm的紗網(wǎng)套袋處理，以隔絕蟲媒傳粉機會，用于檢測風媒傳粉能力，重復(fù)30朵花；(4)去雄不套袋(non-bagged after castration)：對花蕾去雄后不再進行其他處理，用以檢測外來花粉的傳粉效率，即自然異花授粉率，包括蟲媒和風媒傳粉成效，重復(fù)30朵花；(5)去雄套紙袋異株異花人工授粉(bagged and cross-pollinated after castration)：對花蕾去雄后套紙袋，采集異株成熟花粉授粉，用于檢測人工異花授粉率，重復(fù)75朵花；(6)去雄套網(wǎng)袋異株異花人工授粉(netted and cross-pollinated after castration)：對花蕾去雄后套孔徑1 mm的紗網(wǎng)，采集異株成熟花粉授粉，用于檢測人工異花授粉率和風媒授粉能力，重復(fù)30朵花；(7)去雄套網(wǎng)袋(netted after castration)：用于檢測風媒傳粉媒介效率，重復(fù)30朵花；(8)去雄套紙袋(bagged with paper after castration)：用于檢測是否存在單性結(jié)實或無融合生殖，重復(fù)30朵花。上述套袋處理花蕾均選擇花被長度小于1.5 cm且花藥尚未成熟的綠色花蕾，經(jīng)顯微鏡檢測后確定其花粉尚未成熟，每次操作前后用75%乙醇徹底消毒，以防雜花粉污染。授粉處理第7 d的18:00去除套袋，第10 d統(tǒng)計坐果數(shù)，種子成熟時采收統(tǒng)計結(jié)種子蒴果數(shù)和種子數(shù)，最后計算各處理結(jié)實率。

結(jié)實果率(%)=結(jié)種子蒴果數(shù)×100/總花數(shù)

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 暗紫貝母開花物候和田間植株形態(tài)觀測結(jié)果

圖1為甘肅漳縣栽培的暗紫貝母田間花蕾期套袋(圖1A)和植株形態(tài)(圖1B-H)。2013年7月采用野生大鱗莖播種的暗紫貝母次年3月下旬返青，90.0%以上植株單葉無莖，葉似飄帶，俗稱“一匹葉” (圖1B-C)，9.0%單株有葉2～5片，莖短縮，俗稱“樹兒子” (圖1D)，開花株稀少，單花頂生，7月上旬地上部分全部枯萎倒苗。仿野生農(nóng)田環(huán)境條件下，隨著栽培年限的延長，田間株形多樣化趨勢愈加明顯(圖2)，2015年返青后，田間有大量“一匹葉”株(圖1 B-C)和多葉未開花“樹兒子”株(圖1 D)，“燈籠花”株明顯增多(圖1 B和圖2)，開花株5月上旬現(xiàn)蕾，下旬進入盛花期，6月中旬蒴果成形，7月中下旬種子成熟。開花株葉片線狀披針形，底部葉對生，上部葉互生，無葉柄，葉片在5片及以上(圖1 E-G)。開花株中，單株花朵數(shù)的年分配比例趨勢更為明顯，95.5%單株頂生1花(圖1 F)，4.5%單株抽生2花(圖1 G)。2016年返青后，盛花期6月4日統(tǒng)計(圖2)，田間株形多樣化，“一匹葉”株仍占據(jù)優(yōu)勢(1/2)，“樹兒子”株占1/3，開花株即“燈籠花”株占1/5，三者差異性達顯著水平(P<0.05)。在開花株中，單株開花數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)，2/3植株頂生1花，近1/3植株著生2花，1.0%的植株著生3花，花自上到下從葉腋處抽出，頂花柄也可分支花蕾，莖易折斷?！耙黄ト~”株地下根莖部著生1枚鱗莖，多葉開花株可見2枚鱗莖，莖桿中空，鱗莖下部著生數(shù)量不等的根(圖1 H)?！耙黄ト~”株和“樹兒子”株7月上旬全部落黃倒苗，開花株7月中下旬蒴果成熟后地上部枯萎倒苗，莖稈中空。群體開花期從5月中旬持續(xù)至6月中旬，開花期田間觀察到訪花昆蟲有蜂類、蜘蛛、蠅類、蝶類和螞蟻，常在花被內(nèi)外穿梭訪花，但種類和數(shù)量較少。峰類主要是蜜蜂，初步鑒定為石蜜，體外黑色(圖1F)，活動頻繁，傳粉效率最高。蜘蛛主要是紅蜘蛛，體小呈紅色，穿行于花器官中。

圖1 漳縣馴化栽培的暗紫貝母試驗田生境及開花期植株形態(tài)Fig.1 Experimental field surrounding and plant shape during anthesis for F. unibracteata domesticated in Zhang County(A) 試驗地生境和套袋株Test field surrounding and the bagged plants；(B) 田間植株形態(tài)Plant shape in field； (C) 單葉株One-leaf plant；(D)多葉株Multiple-leaf plant; (E)現(xiàn)蕾株Budding plant; (F)單花株Single flower plant； (G) 多花株Multiple-flower plant; (H) 全株Full plant

圖2 漳縣馴化栽培暗紫貝母2015-2016年開花期田間單株葉片數(shù)和開花數(shù)植株分布Fig.2 Distribution of Leaf and flower numbers for single plant in F. unibracteata anthesis in Zhang County domesticated field during 2015-2016注：不同小寫字母表示P<0.05差異顯著，不同大寫字母表示P<0.01差異極顯著Note:Different lowercase letters indicate significant difference at the 0.05 level and the capital letters indicate significant difference at the 0.01 level

2.2 暗紫貝母現(xiàn)蕾開花期植株發(fā)育動態(tài)觀測

2015年現(xiàn)蕾期(5月17日)選擇20株定期觀測顯示(圖3)，進入開花結(jié)果期，暗紫貝母營養(yǎng)生長與生殖生長并進，隨發(fā)育進程的遞進植株呈極顯著增高加粗趨勢(P<0.001)。5月19日現(xiàn)蕾期較6月7日結(jié)果期植株平均增高5.13 cm(t=5.177，P<0.001) (圖3A)，增粗0.025 cm(t=4.387，P<0.001) (圖3B)。葉片極顯著加寬和加長(P<0.001)(圖3C-D)，并表現(xiàn)出個體間的極顯著差異性(P<0.001)。5月19日田間株高和莖粗變幅分別為10.18～19.26 cm和0.164～0.242 cm，變異系數(shù)分別17.50%和9.13%。葉長和葉寬變幅分別為2.110～3.850 cm和0.160～0.550 cm，變異系數(shù)分別為17.56%和34.14%。至6月7日株高和莖粗變幅達15.06～26.72 cm和0.192～0.268 cm，葉長和葉寬變幅分別為2.680～4.920 cm和0.216～0.680 cm。現(xiàn)蕾開花期，株高、莖粗、葉長和葉寬等植株形態(tài)指標均隨發(fā)育時間延長呈直線增長趨勢，直線方程擬合指數(shù)R2(相關(guān)指數(shù))均達極顯著水平(P<0.01)，直線方程擬合點(y)與實測點極其接近(圖3)。

圖3 漳縣馴化栽培的暗紫貝母開花株發(fā)育動態(tài)及直線回歸擬合(n=20)Fig.3 Dynamic of abloom plant development and lineal-regressive simulation for F. unibracteata domesticated in Zhang County(n=20)(A) 株高Plant heigh；(B) 株幅Plant diameter；(C) 葉寬Leaf width；(D) 葉長Leaf length。R2為相關(guān)指數(shù)， **表示在P≤0.01達極顯著水平(下同)。R2 indicate correlation index and **indicate significant difference at the 0.01 level (the same below).

2.3 暗紫貝母花被發(fā)育和開花動態(tài)觀測結(jié)果

暗紫貝母初現(xiàn)花蕾綠色，發(fā)育過程中逐漸加深轉(zhuǎn)變?yōu)榘底仙?圖4)，花被彎曲下垂，吊鐘形(圖1B、E-H)。在花朵發(fā)育過程中，未出現(xiàn)花色分離現(xiàn)象，只是轉(zhuǎn)色程度不同，花被轉(zhuǎn)紫過程中極顯著增長和加寬(P<0.01)(圖4)。單花壽命6～8 d，最初3 d花被顯著加長(t=2.467，P<0.05)，花徑極顯著加寬(t=5.837，P<0.01)，后3d加長趨勢不顯著，但加寬趨勢仍極顯著(t=2.958，P<0.01)，開花10d后蒴果顯現(xiàn)?；貧w分析顯示，花被長隨發(fā)育時間呈“S型”曲線增加，符合Logistic曲線方程y=2.782/(1+e-1.262-0.795x)(R2=0.9875，P<0.01)(圖5A)?；◤脚c發(fā)育時間呈直線關(guān)系 (R2=0.9859，P<0.01)，方程擬合點與實際點極其接近(圖5)。

暗紫貝母晴天開花集中在11:00-15:00，這一時間段溫度高，風力大，適宜傳粉。陰雨天開花時間一般滯后或者不開花。單花開花后第1 d花瓣微開(圖4C)，花藥尚未開裂；開花后第2 d雄蕊逐漸分離，花藥開裂，花粉散出(圖4D)；開花后第3 d(圖4E)花藥完全開裂，大量花粉散出；開花后第4 d花藥散出花粉粒明顯減少；開花后第5 d花藥開始萎縮，花被逐漸脫落，開花第10 d后蒴果成形(圖4F和圖6A)。

圖4 漳縣馴化栽培的暗紫貝母花朵發(fā)育過程中花蕾開放及轉(zhuǎn)色變化Fig.4 Changes of bud opening and coloring for F. unibracteata domesticated in Zhang County(A)綠色花蕾Green bud；(B) 紫色花蕾Purple bud；(C)花朵微開Tiny-opening flower；(D)朵半開Half-opening flower；(E) 花朵全開Fully opening flower；(F) 坐果Fruit setting

圖5 漳縣暗紫貝母發(fā)育過程中花朵長度(A)和花朵直徑(B)變化動態(tài)及其線性回歸擬合(n=20)Fig.5 Dynamics and Linear regressive simulation of flower length (A) and diameter (B) during development for F.unibracteata flowers in Zhang County (n=20)

2.4 暗紫貝母傳粉結(jié)實特性

暗紫貝母坐果后，彎曲下垂的花果莖端逐漸向上生長，使蒴果與莖稈呈直立狀，開花50 d后蒴果種子陸續(xù)成熟。成熟蒴果黃褐色，種子褐色，心形(圖6A-H)。經(jīng)選取單花植株花蕾套袋操作試驗結(jié)果顯示(表1)，花朵套袋操作處理后暗紫貝母單花結(jié)實率變幅為0%～82.7%。去雄異株異花人工授粉套紙袋結(jié)實率最高，自然授粉次之，兩者相差7.7%。去雄異株異花人工授粉后套網(wǎng)袋結(jié)實率明顯下降，較自然授粉降低18.3%，較套紙袋降低26.0%。不去雄套紙袋較不去雄套網(wǎng)袋單花結(jié)實率提高6.7%，去雄后不套袋結(jié)實率較自然授粉下降5.0%。去雄套紙袋不結(jié)實，而去雄套網(wǎng)袋結(jié)實率較去雄套紙袋結(jié)實率提高30.0%，不去雄套紙袋較去雄套紙袋結(jié)實率提高26.7%，不去雄套網(wǎng)袋較去雄套網(wǎng)袋結(jié)實率降低10.0%(表1)。

花朵操作處理對暗紫貝母單蒴果結(jié)種子數(shù)具有極顯著影響(F=84.148，P<0.01) (表1)，去雄套紙袋不結(jié)蒴果和種子，其余處理組均有蒴果，蒴果均結(jié)有種子。在結(jié)蒴果的7個處理組中，單果種子數(shù)和百粒重差異性均不顯著。單果平均種子數(shù)從多到少依次為去雄套紙袋異花人工授粉組>自然授粉對照組>去雄套網(wǎng)袋異花人工授粉組>去雄套網(wǎng)袋組>去雄不套袋組>不去雄套網(wǎng)袋組>不去雄套紙袋組。含有種子蒴果處理組中，單果種子數(shù)均在100粒以上。種子百粒鮮重單果間差異性較大，但處理間差異性不顯著，從高到低依次為去雄不套袋>去雄套紙袋異花人工授粉組>自然授粉對照組>去雄套網(wǎng)袋異花人工授粉>不去雄套紙袋>不去雄套網(wǎng)袋>去雄套網(wǎng)袋組，種子平均百粒鮮重為(94.53±53.62) mg。

經(jīng)對各處理獲得的168枚蒴果統(tǒng)計顯示，暗紫貝母中軸胎座，3心皮將子房分隔成6室，每室15～30粒種子，層疊式排列，成熟種子黃褐色(圖6)，單果結(jié)種子70～179粒，平均(110±22)粒，變異系數(shù)20.8%。單果種子數(shù)為80～140粒的蒴果占81.1%，種子在140粒以上的蒴果數(shù)占10.0%，8.9%單果種子數(shù)少于70粒。單果內(nèi)種子重較種子數(shù)變異更大。單果百粒鮮重為23.37～528.00 mg，平均94.53±53.62 mg，百粒鮮重為60～120 mg的蒴果數(shù)占82.1%，12.5%的單果種子百粒鮮重≤60 mg，百粒鮮重>120 mg的單果數(shù)僅占5.4%，變異系數(shù)56.7%。

圖6 漳縣馴化栽培的暗紫貝母自然授粉蒴果和種子形態(tài)Fig.6 Shape of capsules and seeds of nature pollinated F. unibracteata plants domesticated in Zhang County(A)坐果Fruit setting；(B) 鮮果底面Fresh capsule fundus；(C) 1室種子One chamber of seeds；(D) 2室種子Two chambers of seeds；(E)蒴果及枯花被Capsule and dried perianth；(F) 果頂開裂Split capsule on top；(G)裂果底部Split capsule bottom；(H) 種子Seeds

表1 花朵操作對暗紫貝母田間結(jié)實特性的影響Table 1 Effect of flower operations on seed-set traits of F. unibracteata Hsiao et K. C. Hsia plants

花朵處理Flower treatments花朵數(shù)Flower numbers蒴果數(shù)Capsule numbers結(jié)實果率Fruit set rate/%單果種子數(shù)Seed numbers per capsule百粒鮮重100-seed fresh weight/mg自然授粉對照Natural pollination CK604575.0110±23aA91.32±52.01a不去雄套紙袋 Bagged without castration30826.796±18aA85.56±70.12a不去雄套網(wǎng)袋 Netted without castration30620.0104±17aA78.41±19.47a去雄不套袋Nonbagged after castration302170.0105±23aA113.71±94.73a去雄套紙袋異花人工授粉Bagged and cross-pollinated after castration756282.7112±23aA97.37±41.92a去雄套網(wǎng)袋異花人工授粉Bagged after castration301756.7109±25aA88.98±25.47a去雄套網(wǎng)袋 Netted after castration30930.0107±18aA75.35±17.87a去雄套紙袋Bagged after castration30000bB/

注：表中數(shù)據(jù)為平均數(shù)±SD，同列數(shù)字后不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

Note:The data in the
Table indicate means±SD, different small letters after data in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, and the capital letters mean significant difference at the 0.01 level.

3 討論

3.1 暗紫貝母田間植株形態(tài)多樣化，物候特征明顯

種質(zhì)是指親代傳遞給子代的遺傳物質(zhì)，對種質(zhì)資源或遺傳資源的有效保護可以通過對生態(tài)環(huán)境的保護、建立自然保護區(qū)、植物園和生物種質(zhì)庫來實現(xiàn)[17]。人工馴化不僅可以有效保護珍稀瀕危藥用植物物種，甚至能使其不斷繁衍而解除瀕危狀態(tài)[17]。徐波等[4]調(diào)查提出，野生狀態(tài)下暗紫貝母種子萌發(fā)后第1年地上部分僅長出1片葉，俗稱“一根針”；第2年長出一片葉子，俗稱“一匹葉”；第3年才開始抽出莖，長出多片葉，俗稱“樹兒子”；第4年地上莖長出花，進入有性繁殖階段，俗稱“燈籠花”。李西文和陳士林[19]觀察分析，川貝母存在明顯的繁育退化現(xiàn)象，當出現(xiàn)極端氣候時，從燈籠花發(fā)育階段可直接退回到一匹葉階段。陳士林等[20]通過數(shù)值分析顯示，暗紫貝母植株隨生態(tài)分化株形差異較大，花期“燈籠花”植株高約17～35 cm,“一匹葉”植株(營養(yǎng)生長期)高約7～15 cm。本研究發(fā)現(xiàn)，暗紫貝母自然更新速度很慢，2013年經(jīng)采用大鱗莖(4～5年生)播種，次年返青后田間以“一匹葉”居群為主，開花株稀少。隨栽培年限延長，物候有提早增強趨勢，“樹兒子”和“燈籠花”株率提高，但“一匹葉”仍占據(jù)優(yōu)勢，地下鱗莖數(shù)也因株形不同出現(xiàn)差異，單株開花數(shù)年分配比例逐年提高，“燈籠花”株高15～27 cm，莖粗0.192～0.268 cm，而野生條件下因人畜擾動和見花采挖，多年生大鱗莖稀少，很難見到多花單株，單花株較為普遍，開花株莖表觀健壯，實易折斷，這可能是其保護地下繁殖體的應(yīng)對策略，這與Shoichi對日本貝母的觀察描述一致[13]。

暗紫貝母植株形態(tài)差異和開花株比率的年分配是環(huán)境和遺傳共同作用的結(jié)果，在其生長發(fā)育過程中，植株個體間出現(xiàn)的這種差異是其在極端環(huán)境條件下得以生存繁衍的一種本能反應(yīng)，也是稀有物種得以繁衍的暗示[21]。田間株形多樣化也充分顯示出暗紫貝母無性和有性繁殖的疊加可再生性能。盡管暗紫貝母在長期應(yīng)對多變的高山極端環(huán)境過程中形成了獨特的無性繁殖能力，種子還有油脂易被螞蟻擴散[13]，但自然有性繁殖幾率很低，因為2015年返青后有一定比例的結(jié)果株種果開裂落地，但2016年返青后田間少見“一根針”苗，說明成熟蒴果種子自然出苗繁殖幾率很低。野生環(huán)境下，動物踩踏啃食和鳥啄造成種子的流失，加上種子一旦落地后不能持續(xù)保濕則難以完成其后熟，而是進入深休眠，這也印證了常彥莉[14]的研究結(jié)果，即川貝母種子具有明顯的后熟和休眠特性。

本研究還發(fā)現(xiàn)，暗紫貝母抽薹開花期營養(yǎng)生長與生殖生長并進，即植株進入生殖生長階段后，營養(yǎng)生長還繼續(xù)，7月中下旬高溫到來之前地上部分枯萎倒苗，說明暗紫貝母能充分利用極其有限的適溫資源完成其地上年生物量積累分配，溫度急劇升高不利于暗紫貝母地上部分的生長發(fā)育，因為氣候升溫越快，暗紫貝母倒苗越早，雜草叢中植株倒苗期延后，但倒苗可能更有利于地下鱗莖生物量的積累分配和有效成分的轉(zhuǎn)化積累，莖桿的中空結(jié)構(gòu)為地上部分營養(yǎng)成分向根莖部轉(zhuǎn)運提供了暢通無阻的通道，倒苗后地上部分逐漸分解也印證了暗紫貝母植株營養(yǎng)物質(zhì)各器官轉(zhuǎn)運分配的能力。

3.2 暗紫貝母屬異花授粉類型，部分自交親和，不存在無融合生殖現(xiàn)象

植物花開放后由花粉囊散出的花粉借助一定的媒介力量被傳送到同一花或另一花的柱頭上的傳遞過程稱為傳粉作用，傳送花粉的外力有風、動物、水等，傳粉在植物繁殖進化和性狀的遺傳變異等方面具有重要的意義[18]。傳粉受精過程與自然界中的傳粉者和傳粉行為相結(jié)合構(gòu)成了整個植物有性生殖紐帶。有性繁殖藥用植物根據(jù)花器構(gòu)造、開花習性及授粉方式的不同可分為自花授粉、異花授粉和常異花授粉植物3種類型。育種中，一般根據(jù)異交率判斷繁育類型，異交率<5%歸為自花授粉，異交率>50%以上為異花授粉，而介于5%～50%為常異花授粉[16]。張曉軍等[22]研究表明，平貝母(F.ussuriensis)是以自花傳粉為主，蟲媒異花傳粉為輔的兼性自交植物。事實上，在自然界中很難見到絕對的異交或者絕對自交的植物類群，大部分植物是二者兼有的混交模式[18]，因為過度的自交和異交都會導(dǎo)致植物對環(huán)境的應(yīng)變能力減弱，適應(yīng)性下降。

本研究在漳縣3100 m海拔2013年采用大鱗莖播種的暗紫貝母2015年花蕾期田間株型多樣化特征明顯，5葉及以上植株在5月中下旬現(xiàn)蕾開花，花蕾去雄套紙袋處理不結(jié)實，驗證本研究選蕾恰當，此期花蕾雄蕊未熟，去雄有效，也說明不存在無融合生殖現(xiàn)象，這與胡春等[23]對青藏高原優(yōu)勢毒雜草鈍裂銀蓮花(Anemoneobtusiloba)研究的結(jié)論相反，反映出毒草自繁能力更強。自然授粉結(jié)果率為75.0%，去雄套紙袋異花人工授粉結(jié)實率達82.7%，說明屬異花授粉類型，但存在一定的花粉限制，這與任明迅[24]對半邊蓮的研究結(jié)果相似，不去雄套袋自然結(jié)實率20.0%～26.7%，說明暗紫貝母具有一定自交親和性(低于30%)，花成熟前后雌雄蕊高低錯位和花的下垂彎曲結(jié)構(gòu)可能也是花粉自傳幾率較低的根源所在。

自花傳粉植物西卡柱花草(Stylosanthesscabra)在清晨花朵開放前完成授粉,花粉粒萌發(fā)伸長[25]，暗紫貝母自交也可能是極大限度繁衍后代的機能體現(xiàn)。去雄不套袋異花授粉結(jié)實率(70.0%)較去雄套網(wǎng)袋異花授粉結(jié)實率(56.7%)提高13.3%，說明主要傳粉媒介為蟲媒，但也不排除風媒，進一步驗證了陳垣等[7]對其繁育系統(tǒng)研究推測的結(jié)論。可能去雄削弱了花器對柱頭的保溫保濕作用，紙袋從某種程度上可減弱去雄的傷害效應(yīng)，這也從不去雄套網(wǎng)袋(20.0%)較不去雄套紙袋結(jié)實率(26.7%)降低這一結(jié)果加以解釋，因為前者包含自花和風媒傳粉兩層含義，而后者僅包含自花傳粉效率。不去雄套網(wǎng)袋較去雄不套袋結(jié)實率降低也說明傳粉媒介除風媒外，主要為蟲媒，田間也發(fā)現(xiàn)有少量訪花蜂類、蠅類、蜘蛛和螞蟻等，花中有蜜腺且花粉量大而散，去雄不套袋結(jié)實率高于去雄套網(wǎng)袋更支持蟲媒傳粉的證據(jù)，因為套網(wǎng)袋隔離了小昆蟲進入花的幾率，但并沒有排除風傳花粉的可能。

本研究中，去雄操作僅去除花藥，并不影響昆蟲訪花的決定，因為光譜顯示蜜蜂并不能辨別花瓣和花粉的顏色，將花瓣鮮黃色的百合科植物去除雄蕊后訪花昆蟲大大減少，但去除花藥保留花絲種果率最高[12]，顯花植物特有地利用花行使信號傳導(dǎo)功能，吸引傳粉昆蟲而排斥食花害蟲訪花的決定，黃色能吸收紫外光，并能扮演花粉和花粉囊色[13]。暗紫貝母花被內(nèi)鑲嵌黃色格紋，雄蕊和雌蕊柱頭均呈黃綠色，子房呈紫綠相間圓筒形，具有植株小、花大、群體花期長和花粉多而散的特點，這也印證了其蟲媒和風媒交叉?zhèn)鞣鄣目赡苄浴?/p>

4 結(jié)論

人為擾動和氣候變暖趨勢加劇了野生暗紫貝母棲息地的退縮變遷，野生資源趨于枯竭。野生撫育和馴化栽培是促進資源可持續(xù)化發(fā)展的重要途徑，利用種子繁殖可提高繁殖系數(shù)，有效保護野生資源。暗紫貝母田間株形多樣，單株葉片數(shù)和開花數(shù)比率的年分配趨勢明顯，自然異交率約70%，自交率低于30%，屬典型異花授粉植物，不存在無融合生殖現(xiàn)象，群體開花期的延長可為稀有訪花者和風力提供傳粉幾率，高寒區(qū)夜間風力更大，氣溫驟降，低溫更有利于花粉維持足夠時間的活力，提高傳粉效率，這些特有的物候特征、田間株型多樣化和傳粉結(jié)實特性是其適應(yīng)高寒惡劣多變環(huán)境的結(jié)果，高的異交率和自交花粉限制是其克服繁育退化的一種應(yīng)激能力。傳粉媒介以蟲媒為主，風媒為輔，訪花有效傳粉昆蟲有蜜蜂、蠅類、蜘蛛、蝶類和螞蟻等，對有效傳粉昆蟲有待進一步鑒定研究。由于開花株莖稈脆弱易折斷，開花結(jié)果期盡量減少田間人為擾動。種子繁育需采取隔離措施并提倡養(yǎng)蜂，以提高種子產(chǎn)量，確保種子純度。