陳 陽， 金一鋒， 孫華山， 趙春麗， 王 琦， 王玉書

(1. 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2. 東北農(nóng)業(yè)大學園藝園林學院， 黑龍江 哈爾濱 150030； 3. 福建農(nóng)林大學園藝植物生物工程研究所， 福建 福州350002)

草地早熟禾(PoapratensisL.)是隸屬于禾本科早熟禾屬多年生草本植物，其具備抗寒、葉色濃綠、分蘗性強等優(yōu)勢，常用于我國北方住宅區(qū)、街道、公園等園林綠化[1-4]。草坪業(yè)是耗水耗肥產(chǎn)業(yè)，易受外界環(huán)境因素影響。草坪草逆境脅迫下的生長形態(tài)和生理代謝研究一直是研究重點[5-7]。采用石蠟切片技術觀察植物解剖結構已經(jīng)成為研究植物逆境脅迫后生長形態(tài)發(fā)育過程的重要手段[8-10]。石蠟切片其快速、便捷、易觀察等特點，廣泛應用于各植物材料中，但不同植物其組織、器官結構特點不同，使得針對不同植物優(yōu)化篩選得到適宜的、有針對性的石蠟切片制作過程十分有必要。目前針對草地早熟禾解剖結構的研究集中于研究器官結構、花芽分化，但石蠟切片效果存在器官結構破裂、染色效果不佳、制片模糊不宜觀察等情況，針對草地早熟禾的石蠟切片技術優(yōu)化甚少。本研究以草地早熟禾根、莖、葉為供試器官，對石蠟切片操作過程中的關鍵因素進行優(yōu)化，深入探究染色時間處理對石蠟切片效果的影響，以期獲取完整的、清晰的、易觀察的草地早熟禾解剖結構質(zhì)，為進一步開展草地早熟禾逆境脅迫后生長形態(tài)發(fā)育過程的研究提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試材料為黑龍江野生草地早熟禾，選取生長兩年的植株，取其根、莖、葉三個部位制作成石蠟切片，然后用顯微鏡觀察。

1.2 方法

1.2.1固定與沖洗 采用FAA固定劑對其各部位固定24 h。用50%乙醇(180 ml)+冰醋酸(10 ml)+40%甲醛(10 ml)的FAA固定劑對草地早熟禾根、莖、葉進行固定。用70%乙醇(180 ml)+冰醋酸(10ml)+40%甲醛(10 ml)的FAA固定劑對草地早熟禾各組的根頸、須根進行固定。將經(jīng)FAA固定的實驗材料，用50%或70%(與固定液同濃度)的乙醇沖洗，每次沖洗1～2 h，每20 min晃動一次U形管可以保證沖洗的更徹底，共沖洗3次。

1.2.2脫水 經(jīng) 70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐級梯度脫水后再用無水乙醇脫水5次(每次 30 min)，乙醇逐級脫水時間進行兩組處理：a.70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐級梯度脫水1 h；b.70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐級梯度脫水2 h。

1.2.3透明 采用逐級過渡的方法將材料從乙醇中逐漸過渡到純二甲苯。其中純二甲苯更換方式分為兩種：a.純二甲苯更換兩次，每次1 h；b.純二甲苯更換三次，每次0.8 h。透明具體過程：將材料置于2/3乙醇+1/3二甲苯混合后處理1 h，重復3次，再將材料轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)入二甲苯處理1 h或0.8 h(注：1/3、2/3代表體積比)。

1.2.4浸蠟 將試驗材料從低溫(55℃)到高溫(65℃)，從低濃度石蠟(1/2透明劑+1/2石蠟)，共處理9 h轉(zhuǎn)移到純石蠟中，共浸蠟24 h，期間更換5次純蠟。

1.2.5包埋、切片、展片及貼片 烘箱調(diào)至為70℃包埋，將實驗材料插入裝有熔化石蠟的方形紙盒中，在石蠟表面凝固前要將所有植物材料迅速插入其中，均勻排布。切片刀口的傾斜角度在5～8度為佳，切片的厚度調(diào)整到8 μm為最佳。展片時采用50℃恒溫水浴鍋展片，展好的片用粘有粘貼劑的載玻片撈出，石蠟切片正好位于載玻片中央且保持完整性。展片后，在工作臺上停留片刻使多余的溶液蒸發(fā)掉讓實驗材料緊密的貼在載玻片上，然后等其自然風干(10天左右)。

1.2.6染色與封片 本實驗采用番紅-固綠染色法，對其染色時間進行了篩選，見表1。草地早熟禾染色過程為：將材料置于二甲苯中處理3 min，重復2次；轉(zhuǎn)入到1/2二甲苯+1/2乙醇中3 min，依次轉(zhuǎn)入到100%、90%、80%、70%乙醇，每次處理2 min；將材料置于番紅溶液中數(shù)小時，再依次轉(zhuǎn)入到60%、70%、80%的乙醇，每次處理2 min；將材料置于固綠溶液數(shù)秒后，轉(zhuǎn)入到乙醇中處理三次，每次2 min，再將材料逐漸過渡到二甲苯中。本實驗采用加拿大樹膠作為封固劑，將適量的封固劑滴到材料上，最后蓋上蓋玻片，等其在自然條件風干。

1.2.7觀察及測量 石蠟切片制作好后，用顯微鏡進行觀察、測量、記錄、拍攝植物各典型結構解剖圖。

表1 染色時間的篩選Table 1 Screening of staining time

2 結果與分析

2.1 不同脫水方式對于浸蠟和切片的影響

脫水目的是除凈材料中的水分，使材料變硬，形狀更穩(wěn)定，使包埋劑(石蠟)和封固劑(加拿大樹膠)滲透到草地早熟禾的各組織中。若脫水不徹底，后續(xù)浸蠟時蠟將不能完全滲入植物組織的每一個細胞，導致石蠟切片上的植物材料脫落，形成孔、洞。實驗中發(fā)現(xiàn)，a組70%，80%，85%，90%，95%乙醇逐級梯度脫水1 h后，發(fā)現(xiàn)脫水不徹底導致了草地早熟禾材料從石蠟切片上脫落下來，而b組逐級梯度脫水2 h后未發(fā)生材料脫落現(xiàn)象，效果較好。

2.2 不同透明方式對于切片的影響

本實驗中采用逐級過渡方法將草地早熟禾從乙醇中逐漸過渡到純二甲苯。實驗發(fā)現(xiàn)：a組純二甲苯更換兩次，每次1 h后，其草地早熟禾組織部位透明不徹底，影響后續(xù)染色；b組將純二甲苯更換三次，每次0.8 h，增加了更換頻率，同時減少了每次處理時間，其透明較徹底，效果良好。

2.3 不同染色方式對于切片的影響

本實驗采用番紅-固綠染色法，進行石蠟切片染色，番紅溶液將木質(zhì)化部分染成紅色，固綠溶液將纖維素的細胞壁染成綠色，對于維管束，木質(zhì)部被染番紅溶液成紅色，韌皮部被固綠溶液染成綠色。番紅和固綠的染色時間對石蠟切片的制作至關重要，不同植物其解剖結構差異較大，需篩選適宜的染色方法，故本實驗進行了篩選實驗(見表2)，來探索哪種方法對草地早熟禾的石蠟切片的染色效果更好。

表2 番紅-固綠染色時間處理下的效果比較Table 2 Comparison of dying effects with Sarranine-Fast green dying times

從表2、圖1可以看到，當番紅處理同為2h時，固綠溶液僅處理5s時，紅色區(qū)域較多，其中細胞壁、韌皮部都被染成紅色，圖像整體呈現(xiàn)紅色，結構不易區(qū)分。隨著固綠溶液處理時間逐漸增多，圖像綠色區(qū)域隨之增加，但是當固綠溶液處理40～120 s時，圖像整體呈現(xiàn)綠色，結構不易區(qū)分。綜合幾組實驗圖像，第4組即番紅溶液(3 h)、固綠溶液(40 s)時染色效果更好，紅色和綠色部分更明顯，更易區(qū)分材料橫剖面的各組織，能更好的體現(xiàn)番紅-固綠雙色染色法的價值。

圖1 番紅-固綠不同染色時間下的染色效果圖Fig.1 Comparison of dying effects with Sarranine-Fast green dying times(注：A.番紅2 h，固綠5 s ；B.番紅2 h，固綠20 s；C.番紅2 h，固綠40 s；D.番紅3 h，固綠40 s；E.番紅2 h，固綠120 s)(Note：A.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 5 s；B.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 20 s；C.Safranin solution dyed 2 h， then fast green 40 s；D.Safranin solution dyed 3 h，then fast green 40 s；E.Safranin solution dyed 2 h，then fast green 120 s)

3 討論與結論

本研究通過對草地早熟禾石蠟切片關鍵步驟進行相應優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)不同脫水方式嚴重影響后續(xù)浸蠟的程度，如果脫水不完全，浸蠟不徹底，切片過程中易出現(xiàn)孔、洞，石蠟切片中的器官組織不完整，但有研究發(fā)現(xiàn)，過度脫水易造成后續(xù)展片不完整，出現(xiàn)褶皺的現(xiàn)象[11]。本試驗優(yōu)化不同透明方式對于切片的影響時，增加的二甲苯更換頻率，同時減少了每次更換的時間，可有效使草地早熟禾器官組織中的顏色透明，易于后續(xù)染色。有研究發(fā)現(xiàn)，同一種植物不同器官或者不同植物中的透明過程有較大差異，如草地早熟禾胚胎結構[11]、蘋果花藥[12]、馬鈴薯胚胎[13]、三葉草莖與葉片結構[14,15]等，篩選與優(yōu)化適宜草地早熟禾根莖葉的透明方式很有必要。本實驗篩選染色方式中，進行了傳統(tǒng)番紅-固綠染色方法的優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)針對草地早熟禾染色方法的優(yōu)化十分必要，若方法不當，易出現(xiàn)維管束內(nèi)部結構區(qū)分不明顯、局部顏色過紅或過綠，觀察效果不好。由于植物之間的結構組織不相同，內(nèi)部解剖結構存在一定差異，針對特定植物特定位置的染色方法可以利于更好的觀察。本研究發(fā)現(xiàn)番紅3 h，固綠40 s染色處理下表皮、同化組織、維管束結構清晰，紅色、綠色的染色效果較好，結構易區(qū)分，能較好的觀察草地早熟禾根莖葉中的解剖結構，這有利于后續(xù)觀察草地早熟禾解剖結構與抗逆性的關系、不同時期草地早熟禾形態(tài)結構的發(fā)育過程等。