李大列+黎建斌

摘 要：為優(yōu)化漁用莢膜紅假單胞菌（Rhodopseudomona capsulata）商品保存技術(shù)，首先對實驗室選育保存的高效莢膜紅假單胞菌（菌種NC01）進行菌種擴大培養(yǎng)，再采用正交試驗方法，研究不同的保存溫度、菌液pH值、包裝桶規(guī)格、透光度、顏色對漁用莢膜紅假單胞菌商品保存期的影響，并采用單因素試驗方法，研究在菌液中添加保護劑后的保存效果。結(jié)果顯示，在商品菌液中添加 0.5 g/L維生素C，調(diào)節(jié)菌液pH值7.0，采用5 L透光度2 500 lx的綠色塑料桶包裝，在溫度25 ℃下保存效果最好。應(yīng)用最適宜保存技術(shù)保存漁用莢膜紅假單胞菌商品兩個月，菌液的有效活菌數(shù)≥2.76×109個/mL，比普通保存技術(shù)提高了67.27%，兩者差異顯著（P<0.05），為漁用莢膜紅假單胞菌商品的保存提供了一種全新、有效的保存技術(shù)。

關(guān)鍵詞：漁用莢膜紅假單胞菌（Rhodopseudomona capsulata）；商品；保存

光合細菌是在水產(chǎn)養(yǎng)殖上廣泛應(yīng)用的微生物菌種之一。它不僅能凈化水質(zhì)，而且含有豐富的營養(yǎng)，可作為魚蝦的飼料添加劑，同時能促進養(yǎng)殖品種的繁殖，提高魚苗、蝦等的成活率。由于漁用光合細菌不耐高溫，因此，采用成本低的工藝路線研制粉狀制劑較為困難。目前市場上銷售的漁用光合細菌多為液態(tài)產(chǎn)品，而液體產(chǎn)品都存在菌種保質(zhì)期較短，菌種在保存中漸漸死亡的問題，這嚴重影響了漁用光合細菌商品的保存期與應(yīng)用效果。張李陽等（2005）對幾種光合細菌保種方法進行了比較，發(fā)現(xiàn)冷凍干燥法保存光合細菌最好，但成本較高。從綜合考慮，固體、半固體法最適合不同條件的實驗室進行光合細菌菌種保存[1]。張芳蕾等（2009）用正交實驗方法探討菌劑保藏的光線、溫度及pH對液態(tài)濃縮制劑保藏期的影響，以及在菌劑中添加化學(xué)物質(zhì)后的保藏效果。正交試驗結(jié)果表明，光合細菌濃縮菌劑在pH值5.5、室溫及避光條件下保藏效果最好。而在菌劑中添加1%甘油、7%二甲亞砜和0.5～1.1 μg/mL紅霉素對延長菌劑的保藏均較為有效，其中以添加1%甘油的保藏效果更好[2]。王家芳等（2011）以硫酸鋁鉀作絮凝劑，海藻糖作保護劑，陶瓷粉作固定劑，分別在常溫，4～20 ℃下保存光合細菌G3菌株，30 d后測定有效活菌數(shù)并觀察生長情況。結(jié)果表明：固定化保存的光合細菌活性較好，生長繁殖旺盛[3]。目前我國漁用光合細菌商品保質(zhì)期較短，菌種在保存過程中細胞死亡率高、容易造成變異和污染。但目前尚無延長漁用光合細菌商品保存期的研究報道。對實驗室選育保存的高效莢膜紅假單胞菌（Rhodopseudomona capsulata，菌種NC01）進行菌種擴大培養(yǎng)，采用正交和單因素試驗方法對漁用莢膜紅假單胞菌商品進行保存試驗，研發(fā)出一種全新、有效的保存技術(shù)，顯著提高產(chǎn)品的保存期限和細胞活性，為漁用莢膜紅假單胞菌商品在水產(chǎn)養(yǎng)殖上的廣泛應(yīng)用提供有效的保障。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗菌種

試驗菌株P(guān)SB由廣西水產(chǎn)科學(xué)研究院南寧海可海樂微生物工程有限公司從高產(chǎn)蝦塘底泥中分離保存，經(jīng)鑒定為紅螺菌科莢膜紅假單胞菌（菌株編號NC01）。

1.1.2 培養(yǎng)基

液體配方[4]：使用本課題組優(yōu)化篩選的最佳培養(yǎng)基，其基本成分如下： CH3COONa 3.0 g，NH4Cl 0.8 g， KH2PO4 1.0 g，MgSO4·7H2O 050 g，酵母膏1.5 g，CaCl2 50 mg，MnSO4 25 mg，F(xiàn)eSO4 5.00 mg，調(diào)節(jié)pH值至 7.0，曝氣自來水 1 000 mL。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種擴大培養(yǎng)

用5 L無色透明聚乙烯塑料桶培養(yǎng)，將活化后的菌種以30%接種于已滅菌的優(yōu)化培養(yǎng)基中，置于室外自然光源下，溫度控制在30 ℃左右、光照度為6 000～8 000 lx，靜置培養(yǎng)5 d后待細胞培養(yǎng)液呈現(xiàn)深紅色，取樣測定有效活菌數(shù)≥3.18×109個/mL、pH值8.5～8.8備用。

1.2.2 保存條件正交試驗

將擴培后的菌液搖勻分裝到聚乙烯塑料桶中，采用L16（45）正交試驗方法，每個試驗方案做2個重復(fù)，共32桶，保存兩個月，取樣測定菌液的有效活菌數(shù)，取其平均值。研究不同的溫度、菌液pH值、包裝桶規(guī)格、透光度、顏色對漁用莢膜紅假單胞菌商品保存期的影響。試驗以測定保存兩個月的商品菌液有效活菌數(shù)為指標進行評價，優(yōu)化出最適宜的保存條件。正交試驗方案見表1。

1.2.3 保護劑單因素試驗保存試驗

在菌液中添加0.0%（空白對照組）、0.5%、1.0%、1.5%和2%的甘油，每個梯度設(shè)2個重復(fù)，共10桶，在最適宜的保存條件下保存兩個月，每隔15 d取樣測定菌液的有效活菌數(shù)，取其平均值，研究不同濃度的甘油對漁用莢膜紅假單胞菌商品保存效果的影響，優(yōu)化出最適宜的添加量。

在菌液中添加0.0 g/L（空白對照組）、0.25 g/L、0.5 g/L和1.0 g/L的維生素C，每個梯度設(shè)2個重復(fù)，共8桶，在最適宜的保存條件下保存兩個月，每隔15 d取樣測定菌液的有效活菌數(shù)，取其平均值，研究不同濃度的維生素C對漁用莢膜紅假單胞菌商品保存效果的影響，優(yōu)化出最適宜的添加量。

1.2.4 不同保存技術(shù)的綜合對比試驗

將擴培好的菌液在最適宜和普通保存條件下保存漁用莢膜紅假單胞菌商品兩個月，每個梯度設(shè)2個重復(fù)，共4桶，每隔15 d取樣測定菌液的有效活菌數(shù)，取其平均值，并進行轉(zhuǎn)接復(fù)蘇，觀察菌的生長情況。

1.3 測定指標及方法

用ZDS-10型照度計測定透光度；用PHS-3C型pH計測定pH值；用光合細菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基[5]以平板菌落計數(shù)法測定細胞有效活菌數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)處理