張濤+于翔+龔元+李軍+張健

菲牛蛭（Hirudinaria manillensis）屬于無吻蛭目，俗名金邊螞蟥，主要以吸食人和動物的血液為生，在我國華南地區(qū)分布較廣，福建、海南、香港等地均有發(fā)現(xiàn)[1]。近幾年，國內(nèi)外學(xué)者通過大量研究發(fā)現(xiàn)其體內(nèi)存在生物活性物質(zhì)[2-8]，功能與水蛭素相似，具有抗凝活性，對降低血酸和血脂有一定藥理作用，在心血管疾病和血栓疾病方面療效明顯。因此，菲牛蛭的人工養(yǎng)殖開發(fā)具有廣大的市場前景。

目前，隨著我國野生菲牛蛭采捕量逐年減少，人工繁殖菲牛蛭技術(shù)至關(guān)重要，于翔[9]報道了菲牛蛭產(chǎn)卵繭孵化溫度24.0～30.0 ℃下，產(chǎn)卵繭周期一般從幾天到幾十天；張彬[10]報道了溫度對菲牛蛭卵繭孵化影響顯著，26 ℃和28 ℃下菲牛蛭卵繭孵化率較高；筆者通過越冬實驗發(fā)現(xiàn)，菲牛蛭冬季也有產(chǎn)繭孵化現(xiàn)象。因此，能否通過一定物理刺激或強化飼料等因素作用，縮短菲牛蛭繁殖周期，并在發(fā)育成熟階段集中繁殖產(chǎn)卵繭，是人工繁殖菲牛蛭最重要的一環(huán)。而本文則通過生物組織學(xué)角度來剖析菲牛蛭在飼喂強化飼料條件下的性腺發(fā)育成熟度，為人工繁殖菲牛蛭技術(shù)的發(fā)展提供了一定的科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

菲牛蛭由湖北省荊州市民康生物技術(shù)公司提供，挑選健康無病，平均每條體重為1.24±0.13 g亞成體菲牛蛭。

1.2 方法

實驗在室內(nèi)進行，將實驗小水蛭暫養(yǎng)到土壤厚度為20～30 mm 的380 mm×275 mm×140 mm的60目網(wǎng)箱中，再將網(wǎng)箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，用水調(diào)節(jié)干濕度至70%～80%。每箱實驗組投放100尾小水蛭，并設(shè)三個平行組，暫養(yǎng)周期為7 d。

在養(yǎng)殖室溫為21～28 ℃，土層溫度為19～24 ℃條件下，試驗飼料采用人工配合飼料（NP90血球粉30 g，NP2002血漿粉5 g，基礎(chǔ)液，雞蛋100 mL）灌腸后飼喂，每次飼喂前挑取全部試驗小水蛭放到380 mm×275 mm×140 mm的60 目空網(wǎng)箱中，再將網(wǎng)箱置于同等大小的聚乙烯塑料箱中，塑料箱中放入少量的37 ℃左右的溫水，最后將配好的飼料放入網(wǎng)箱中，每5～10 d飼喂一次。每次飼喂前后要稱量全部水蛭個體體重，并在飼喂前隨機采取3～5條體質(zhì)健壯、體色正常、無傷病的小水蛭，用吸水濾紙擦拭干凈后稱其體重，經(jīng)麻醉劑麻醉，解剖截取精巢和卵巢后用波恩氏液固定24 h、梯度酒精脫水，二甲苯透明，石蠟（56～60 ℃）包埋；通過DQP-9010電腦切片機連續(xù)切片，厚度7～8 μm，再進行蘇木精—曙紅（H.E）染色、中性樹膠封片，最后用ECLIPSE E600光學(xué)顯微鏡觀察、拍照[11-12]。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差（Mean±SD）表示， 每次飼料實驗前與實驗后代謝5～10 d的體重增重率（W，%）。

W（%）=（W2-W1）/W1×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 人工飼料飼喂菲牛蛭前后體重與形態(tài)變化

2014年6月14日至2014年9月19日期間，用人工飼料飼喂菲牛蛭14次。每次飼料實驗前與實驗后代謝5～10 d的平均體重增重率（%）達到14.1±1.32%。飼喂后菲牛蛭全身腫脹，行動遲緩，經(jīng)過5～10 d的代謝過程，身體基本恢復(fù)到飼喂前狀態(tài)，體表顏色無顯著變化，身體健康。當(dāng)水蛭體重達到6 g左右時，發(fā)現(xiàn)部分菲牛蛭前端有黃色生殖環(huán)帶出現(xiàn)。

2.2 人工飼料飼喂菲牛蛭的精巢發(fā)育及組織學(xué)特征

菲牛蛭精巢位于身體兩側(cè)，為球形，共11對。每個精巢有輸精小管通到輸精管，各自膨大成貯精囊，再通到射精管，兩側(cè)的射精管在中部匯合到一個精管膨腔。不同發(fā)育時期的精巢，其特征不同。

本實驗中，菲牛蛭通過人工飼料強化喂養(yǎng)，精巢才逐步成熟，其集中的高峰成熟期是在8月24日—9月19日的6次喂養(yǎng)過程中。本文為便于描述，將精巢發(fā)育過程分為5個時期。

2.2.1 精巢發(fā)展適應(yīng)期Ⅰ（6月14日—6月24日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色透明，精巢最大直徑為110 μm。由圖1-1可知，組織切片觀察：精巢由結(jié)締組織分割成許多不規(guī)則的小室，小室內(nèi)生殖細胞大量增值成精原細胞，聚集成團，精原細胞大小不一，不規(guī)則的排列于精巢之中，組織學(xué)為第Ⅰ時期。該結(jié)構(gòu)為初生期精囊。

2.2.2 精巢發(fā)展適應(yīng)期Ⅱ（6月24日—7月9日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色透明，精巢最大直徑150 μm。由圖1-2可知，組織切片觀察：生精囊之間較為寬松，精小葉之間可見精原細胞和初級精母細胞，精原細胞大量增殖聚集成初級精母細胞，核染色較深，結(jié)締組織有明顯的血管分布，精小葉無腔隙或腔隙較小，精小囊內(nèi)初級精母細胞同步發(fā)育，細胞體積與精原細胞相差不多，組織學(xué)為第Ⅱ時期。

2.2.3 精巢發(fā)展啟動期（7月9日—7月29日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色半透明，精巢最大直徑為190 μm。由圖1-3，1-4可知，組織切片觀察：生精囊有豐富的微血管分布，精母細胞發(fā)育不同步性，除少數(shù)精原細胞外，大多數(shù)為初級精母細胞和次級精母細胞，細胞嗜堿性很強，被蘇木精染成藍色，細胞核明顯，生精囊中空存在，生精囊壁較薄，組織學(xué)為第Ⅲ時期。

2.2.4 精巢發(fā)展生長期（7月29日—8月24日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色，精巢最大直徑為240 μm。由圖1-5可知，組織切片觀察：精小葉生精囊破裂，中空消失，腔隙增大，精小葉主要以次級精母細胞為主，同時伴有少量的精原細胞，初級精母細胞和精子細胞，這些不同發(fā)育階段的各類精母細胞在一個精小葉內(nèi)是以同型的細胞群排列，組織學(xué)為第Ⅳ時期。

2.2.5 精巢發(fā)展成熟期（8月24日—9月19日）

解剖后肉眼觀察精巢為圓形，白色，精巢最大直徑為270 μm。由圖1-6，1-7可知，組織切片觀察：精小葉生精囊破裂，中空消失，次級精母細胞很少，幾乎看不到精原細胞和初級精母細胞，成熟的精子細胞進入腔隙擠滿整個空間，精小葉中腔隙縮小，精小葉的小葉腔隙充滿大量的成熟精子，組織學(xué)為第Ⅴ時期。

2.3 人工飼料飼喂菲牛蛭的卵巢發(fā)育及組織學(xué)特征

菲牛蛭卵巢被上皮結(jié)締和脂肪組織包裹明顯，位于雌性生殖孔第36，37環(huán)節(jié)中間的環(huán)溝上，蛋白腺兩側(cè)，為圓形或橢圓形，與輸卵管相連，共1對。不同發(fā)育時期的卵巢，其特征不同。

本實驗中，菲牛蛭通過人工飼料強化喂養(yǎng)，卵巢才逐步成熟，其集中的高峰成熟期也是在8月24日—9月19日的6次喂養(yǎng)過程中。本文為便于描述，將卵巢發(fā)育過程分為5個時期。

2.3.1 卵巢發(fā)育適應(yīng)期（6月14日—7月9日）

卵巢發(fā)育到第Ⅰ期時，肉眼觀察卵巢為淺灰色半透明，橢圓形，最大直徑為100 μm。由圖2-1可知，組織切片觀察：生殖細胞成團，不規(guī)則的排列在卵巢中，主要以卵原細胞為主，細胞質(zhì)分布均勻，并表現(xiàn)為明顯的嗜堿性，細胞核圓形，較大，位于細胞中央，占據(jù)整個細胞體積的1/3-1/2左右，卵母細胞直徑0.8～1.2 μm。

2.3.2 卵巢發(fā)育啟動期（7月9日—8月8日）

卵巢發(fā)育到第Ⅱ期時，肉眼觀察卵巢為白色半透明，橢圓形或圓形，最大直徑為120 μm。由圖2-2， 2-3可知，組織切片觀察：生殖細胞由卵原細胞向初級卵母細胞過渡，細胞質(zhì)嗜堿性減弱，細胞核多位于細胞中央，細胞為卵圓形或圓形，部分細胞核仁增多，核區(qū)嗜酸性增強，卵母細胞質(zhì)膜外層出現(xiàn)皮質(zhì)液泡層并向內(nèi)延伸，細胞直徑1.5～2.1 μm。

2.3.3 卵巢發(fā)育小生長期（8月8日—8月24日）

卵巢發(fā)育到第Ⅲ期時，肉眼觀察卵巢體積增大不明顯，為白色透明，橢圓形或圓形，最大直徑為145 μm。由圖2-4，2-5可知，組織切片觀察：初級卵母細胞進入卵黃積累時期，細胞質(zhì)嗜堿性繼續(xù)減弱，細胞膜和細胞核界限模糊不清，細胞核向細胞一側(cè)移動，核仁已經(jīng)排出，皮質(zhì)液泡層液泡減小，并出現(xiàn)嗜酸性卵黃顆粒，呈放射狀和淺紫色，卵母細胞直徑1.8～2.4 μm。

2.3.4 卵巢發(fā)育大生長期（8月24日—9月9日）

卵巢發(fā)育到第Ⅳ期時，肉眼觀察卵巢體積明顯增大，為淡黃色 ，橢圓形或圓形，最大直徑為210 μm。由圖2-6可知，組織切片觀察：細胞質(zhì)減少，核膜開始消失，核仁溶解，皮質(zhì)液泡層消失，卵黃顆粒由外向內(nèi)延伸，充滿卵母細胞，卵母細胞直徑2.7～3.2 μm。

2.3.5 卵巢發(fā)育成熟期（9月9日—9月19日）

卵巢發(fā)育到第Ⅴ期時，肉眼觀察卵巢體積，形狀與Ⅳ期變化不明顯，顏色為黃色，最大直徑為215 μm。由圖2-7可知，組織切片觀察：卵母細胞已經(jīng)達到成熟標準，卵黃顆粒在卵母細胞聚集成卵黃，并充滿整個卵母細胞， 卵母細胞直徑2.8～3.4 μm。

3 討論

3.1 菲牛蛭繁殖生物學(xué)特性

菲牛蛭是雌雄同體，雄性先成熟[1]的環(huán)節(jié)動物，這與本實驗組織切片觀察結(jié)果相似。菲牛蛭行異體受精，由身體前端產(chǎn)繭后繭繁殖后代。其有一可以翻出的陰莖，交配時兩個體身體相反的腹部貼緊，一個個體陰莖插入另一個體陰道內(nèi)，一般是單方面輸送精子到另一方。當(dāng)一方個體的卵巢成熟后，卵巢囊中的卵與來自另一方個體的精子結(jié)合形成受精卵，最后被輸卵管的蛋白包上，此時受精卵就通過雌孔迅速地產(chǎn)到水蛭前端生殖體節(jié)的腺體中，這是為什么我們在觀察水蛭在產(chǎn)繭結(jié)束前，身體前部有黃色的生殖環(huán)帶的主要原因。

3.2 人工飼料飼喂次數(shù)、體重對菲牛蛭繁殖性能的影響

菲牛蛭在經(jīng)過三個月時間，14次人工飼料飼喂后，每次飼料實驗前與實驗后代謝5～10 d的平均體重增重率W（%）達到14.1±1.32%。 隨著人工飼料飼喂次數(shù)增多，當(dāng)菲牛蛭體重為6 g左右時，發(fā)現(xiàn)部分水蛭前端出現(xiàn)黃色的生殖環(huán)帶，表明水蛭性腺已經(jīng)達到成熟標準。這與張斌[10]報道的當(dāng)菲牛蛭體重在5～15 g范圍內(nèi)，性腺系數(shù)隨體重的增加而增大的內(nèi)容一致。但是，水蛭成熟時軀體大小與飼喂次數(shù)并非固定，而是具有一定的可塑性[13]。生長情況良好的菲牛蛭個體可能提前性成熟。同一種群中菲牛蛭性腺成熟的時間與個體大小有可能來自遺傳的差異[14]，也有可能來自對同一環(huán)境的適應(yīng)性不同的影響[15]。

3.3 人工飼料飼喂菲牛蛭性腺成熟時間與周期

精小葉的小葉腔隙中是否充滿大量的成熟精子是判斷精母細胞成熟的標志，而卵黃的發(fā)生是卵子發(fā)育過程中極為重要的代謝活動，是卵母細胞能否發(fā)育成熟的關(guān)鍵。本實驗切片觀察可知，7月29日飼喂人工飼料前的菲牛蛭生精囊中出現(xiàn)少量精子，此為組織學(xué)雄性生殖器官第Ⅳ時期；8月24日飼喂人工飼料前的菲牛蛭生精囊破裂，精小葉的小葉腔隙中充滿大量精子，精母細胞成熟，此為組織學(xué)雄性生殖器官第Ⅴ時期。8月8日飼喂人工飼料前的菲牛蛭卵母細胞出現(xiàn)放射狀的卵黃顆粒，此為組織學(xué)雌性生殖器官第Ⅲ時期；9月9日飼喂人工飼料前的菲牛蛭卵黃顆粒在卵母細胞聚集呈卵黃，并充滿整個卵母細胞，此為組織學(xué)雌性生殖器官第Ⅴ時期。因此，由以上結(jié)論推出菲牛蛭是雄性先成熟個體，這與張斌[10]報道一致。

4 小結(jié)

通過本實驗可得知，平均質(zhì)量為1.24±0.13 g的亞成體菲牛蛭在夏季自然變溫和光照條件下，經(jīng)過三個多月14次人工飼料的飼喂，部分菲牛蛭性腺出現(xiàn)生殖環(huán)帶，性腺成熟。其成熟時間遠低于譚恩光[16]報道的廣東菲牛蛭在自然變溫和光照在60 W燈泡，早上8：00 亮燈， 17：30 熄燈， 下雨天不亮燈條件下，菲牛蛭從亞成體通過3次飼喂飼料，10個月才發(fā)現(xiàn)菲牛蛭有生殖環(huán)帶，完成一個生命周期所用的時間，因而適當(dāng)?shù)脑鰪婏暳系娘曃诡l率，可以有助于菲牛蛭性腺早日成熟。

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（收稿日期：2017-02-03）