梁滬蓮+郭小雅+劉洋+劉伶俐+宋志文+徐愛玲

摘 要：采用聚乙二醇—海藻酸鈉—氯化鈣方法包埋淡水型和海水型硝化細菌，比較分析鐵離子對固定化和游離態(tài)硝化細菌中氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌活性的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)e3+對游離態(tài)硝化細菌的影響大于固定化硝化細菌，當Fe3+濃度為1 mg·L-1時固定化淡水硝化細菌氨氧化活性最高，游離態(tài)淡水型氨氧化活性受Fe3+影響較大，120 h后明顯降低，但對亞硝酸鹽氧化活性影響均較小。在不同F(xiàn)e3+濃度條件下，固定化海水硝化細菌氨氧化活性和亞硝酸鹽氧化活性與不加Fe3+組基本相同，而游離態(tài)海水型氨氧化和亞硝酸鹽氧化活性均隨Fe3+濃度增大而略有降低。

關(guān)鍵詞：鐵離子；固定化；硝化細菌；硝化活性

硝化細菌屬化能自養(yǎng)菌，具有代時長、生長緩慢、易流失、對環(huán)境因子變化敏感等特點[1，2]。微生物固定化技術(shù)利用化學或物理手段將游離微生物固定在特定載體上，使其保持活性并可反復利用，對解決硝化細菌菌體流失，提高抗沖擊負荷能力，維持系統(tǒng)穩(wěn)定運行有重要作用[3]。

鐵是微生物的礦物營養(yǎng)，對微生物生長必不可少，其主要作用是：元素鐵存在于細胞色素、鐵氧還蛋白和鐵硫蛋白中，是氧化還原載體和電子傳遞鏈的組成部分，能使氨氧化的中間物羥氨釋放的2個電子經(jīng)電子傳遞鏈傳給氧，磷酸化產(chǎn)生能量[4]。硝化細菌具有復雜的膜內(nèi)褶結(jié)構(gòu)，鐵離子能夠加大細胞膜滲透性，從而加快營養(yǎng)物質(zhì)的吸收速度。研究表明，在活性污泥系統(tǒng)中，鐵能加快硝化作用的進行。但微生物對礦質(zhì)元素的需要僅是微量的，含量過高會引起抑制或毒害作用[5，6]。

本研究利用聚乙二醇—海藻酸鈉—氯化鈣作為包埋載體，分別制備淡水型和海水型硝化細菌固定化小球，研究Fe3+對固定化和游離態(tài)硝化細菌中氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

硝化細菌菌劑包括淡水型硝化細菌和海水型硝化細菌兩種，由實驗室自行制備，均由氨氧化菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌（NOB）組成。

人工海水由海水素（青島通用海大海水素有限公司）配制而成，鹽度28‰。

1.2 實驗方法

1.2.1 硝化細菌固定化方法

采用4%聚乙二醇、2.5%海藻酸鈉的混合包埋劑，以4% CaCl2溶液為交聯(lián)劑，按菌膠比1∶2進行包埋，交聯(lián)時間24 h，詳細方法參見文獻[7]。

1.2.2 Fe3+對氨氧化菌活性的影響

實驗分為淡水和海水硝化細菌組。淡水實驗組用氯化銨配制10 mg·L-1氨氮溶液，加入三氯化鐵使Fe3+濃度分別為0、0.5、1、5、10 mg·L-1，分別加入1 g固定化小球或相當劑量的游離態(tài)硝化細菌，設(shè)定空白對照組。25 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每24 h測定氨氮濃度。海水實驗組采用人工海水溶液，氨氮濃度15 mg·L-1，其余同淡水組。

1.2.3 Fe3+對亞硝酸鹽氧化菌活性的影響

實驗分為淡水和海水硝化細菌組。淡水試驗組用亞硝酸鈉試劑配制20 mg·L-1亞硝酸鹽溶液，加入三氯化鐵使Fe3+濃度為0、0.5、1、5、10 mg·L-1，分別加入1 g固定化小球或相當劑量的游離態(tài)硝化細菌，設(shè)定空白對照組。25 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每24 h測定亞硝酸鹽氮濃度。海水實驗組采用人工海水溶液，其余同淡水組。

1.3 分析方法

氨氮采用納氏試劑分光光度法測定；亞硝酸鹽氮采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測定[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝化細菌固定化效果

研究發(fā)現(xiàn)，采用聚乙二醇包埋硝化細菌無法成球。海藻酸鈉對微生物細胞起一定保護作用，可提高固定化細胞活性[9]；水溶液中海藻酸鈉會電解產(chǎn)生海藻酸陰離子，與氯化鈣產(chǎn)生的二價鈣離子發(fā)生靜電作用而交聯(lián)[10]。添加海藻酸鈉，以氯化鈣作為交聯(lián)劑，不僅容易成球，無粘連現(xiàn)象，而且制作的小球機械強度高，傳質(zhì)性能好。但海藻酸鈉濃度過高會出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，濃度過低，不易形成小球；氯化鈣濃度過高，不利于硝化細菌活性，濃度低時，交聯(lián)不徹底，固定化小球易破碎溶解[11]。通過正交實驗，確定了制備的固定化小球的最佳方法，采用該方法制備的小球彈性好，無破損（見圖1）。

2.2 Fe3+對固定化和游離態(tài)硝化細菌AOB活性的影響

考察Fe3+對固定化和游離態(tài)硝化細菌菌劑中氨氧化菌活性的影響。結(jié)果見圖2。

從圖2中可以看出，F(xiàn)e3+對固定化淡水硝化細菌的影響較固定化海水硝化細菌大，當Fe3+濃度為1 mg·L-1和5 mg·L-1時，固定化淡水硝化細菌氨氧化活性較高，并且1 mg·L-1濃度組大于5 mg·L-1濃度組，0.5 mg·L-1濃度組氨氧化菌活性則有所降低；在不同F(xiàn)e3+濃度條件下，固定化海水硝化細菌氨氧化活性基本相同。

Fe3+對游離態(tài)淡水硝化細菌活性的影響較游離態(tài)海水硝化細菌大。反應(yīng)初期Fe3+對淡水型和海水型氨氧化活性的影響均較小，120 h后氨氧化活性降低，經(jīng)過168 h處理，游離態(tài)海水組氨氮去除率隨Fe3+濃度增大而降低，均在60%左右；而淡水型10 mg·L-1濃度組氨氮去除率為61%，不加Fe3+組去除率為91.5%，其余組去除率在70%左右。

2.3 Fe3+對固定化和游離態(tài)硝化細菌NOB活性的影響

考察Fe3+對固定化和游離態(tài)硝化細菌菌劑中亞硝酸鹽氧化菌活性的影響。結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，F(xiàn)e3+對固定化淡水硝化細菌亞硝酸鹽氧化活性的影響較固定化海水硝化細菌大，前期固定化淡水亞硝酸鹽氧化菌活性明顯降低，72 h后1 mg·L-1濃度組亞硝酸鹽氧化菌活性略有提高；在不同F(xiàn)e3+濃度條件下，固定化海水亞硝酸鹽氧化菌的活性均較高，僅36 h，亞硝酸鹽氮去除率均達到100%。

Fe3+對游離態(tài)淡水和海水亞硝酸鹽氧化菌的活性影響較小，游離態(tài)淡水組不加Fe3+的亞硝酸鹽去除率達到61%，其它組去除率在50%左右；而游離態(tài)海水亞硝酸鹽氧化菌活性隨Fe3+濃度增加而略有降低，24 h后，亞硝酸鹽氧化菌的活性明顯降低，經(jīng)120 h處理，不加Fe3+組亞硝酸鹽去除率為100%，其余組分別為94.5%、910%、891%、85.6%。

3 討論

微生物固定化可以極大限度地保護菌劑活性，提高硝化細菌的抗沖擊能力和載體中的微生物密度，維持系統(tǒng)穩(wěn)定運行。

本研究考察了不同濃度Fe3+對固定化淡水型和海水型硝化細菌氨氧化和亞硝酸鹽氧化活性的影響，并與游離態(tài)硝化細菌進行了對比分析。從結(jié)果上看，F(xiàn)e3+對游離態(tài)硝化細菌活性的影響大于固定化硝化細菌，游離態(tài)硝化細菌活性隨Fe3+濃度的增大而降低，可能與Fe3+能與微生物中的酶結(jié)合，使酶失去活性有關(guān)。Fe3+對游離態(tài)硝化細菌具有毒害作用，從而影響硝化作用[12]。楊維等[13]研究地下水中鐵錳等對氮轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果證明低含量的鐵對硝化有促進作用，高含量鐵則對硝化作用有抑制作用，與本研究結(jié)果一致。

Fe3+對固定化淡水型和海水型硝化細菌的活性影響較小，尤其是對亞硝酸鹽氧化菌活性影響最小。固定化硝化細菌的氨氧化和亞硝酸鹽氧化速率大于游離態(tài)硝化細菌，分析原因可能為Fe3+與包埋材料中聚乙二醇會發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[14]，減少系統(tǒng)中鐵離子濃度，從而減小了對硝化細菌活性的影響。對于淡水硝化細菌來說，F(xiàn)e3+對固定化小球的影響大于游離態(tài)硝化細菌，但對海水硝化細菌活性影響相對較小，可能是由于海水pH較高，F(xiàn)e3+可與OH-發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，降低了Fe3+的濃度[15]。

4 結(jié)論

Fe3+對游離態(tài)硝化細菌的影響大于固定化硝化細菌。Fe3+濃度為1 mg·L-1時固定化淡水型硝化細菌氨氧化活性最大，亞硝酸鹽氧化活性受Fe3+影響較小；游離態(tài)淡水型氨氧化活性受Fe3+影響較大，在120 h后明顯降低，亞硝酸鹽去除率則與不加Fe3+組相差不大。

在不同F(xiàn)e3+濃度條件下，固定化海水硝化細菌氨氧化活性和亞硝酸鹽氧化活性與不加Fe3+組基本相同；而游離態(tài)海水型氨氧化和亞硝酸鹽氧化活性均隨Fe3+濃度增大而略有降低。

參考文獻：

[1] 劉少敏，儲磊，朱敬林.固定化硝化細菌去除生活污水中的氨氮[J].環(huán)境工程學報，2014（10）：4261-4266

[2] 羅小溪，高建忠，陳再忠.硝化細菌富集培養(yǎng)及應(yīng)用研究進展[J].水產(chǎn)科技情報，2013（6）：320-323

[3] 南曉梅，宋新山，趙曉祥.硝化細菌包埋固定化條件的研究[J].應(yīng)用化工，2014（02）：200-202

[4] M Fourquez，A Devez，A Schaumann，et al.Effects of iron limitation on growth and carbon metabolismin oceanic and coastal heterotrophic bacteria[J].Limnology & Oceanography，2014，52（9）：349-353

[5] 劉少敏，儲磊，朱敬林.固定化硝化細菌去除生活污水中的氨氮[J].環(huán)境工程學報，2014（10）：4261-4266

[6] Ahmed J Mugwar，Michael J Harbottle.Toxicity effects on metal sequestration by microbially-induced carbonate precipitation[J].Journal of Hazardous Materials，2016，314：237-248

[7] 劉伶俐.硝化細菌固定化方法研究[D].青島，青島理工大學，2012

[8] 國家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測分析方法》編委會.水和廢水監(jiān)測分析方法，第四版[M].北京：中國環(huán)境科學出版社，2002

[9] Yongxiang Luo，Guilin Luo，Michael Gelinsky，et al.3D bioprinting scaffold usialginate/Polyvinyl alcohol bioinks[J].Materials Letters，2017，189：295-298

[10] Yuwei Dong，Yanqiu Zhang，Baojun Tu，et al.Immobilization of ammonia-oxidizing bacteria by calcium alginate[J].Ecological Engineering，2014，73：809-814

[11] E Priyadarshini，N Pradhan.Gold nanoparticles as efficient sensors in colorimetric detection of toxic metal ions：A review[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2017，238：888-902

[12] LI Tao，JI Xiaojun，WU Na，et al.Progress on effects of metal ions on lipid accumulation of oleaginous microorganism[J].Chemical Industry & Engineering Progress，2016，4：324-327

[13] 楊維，王泳，郭毓，等.地下水中鐵錳對氮轉(zhuǎn)化影響的實驗研究[J].沈陽建筑大學學報（自然科學版），2008（02）：286-290

[14] 李亞峰，張馳，王健.重金屬離子對亞硝化的影響研究[J].水處理技術(shù)，2016（02）：96-99.

[15] Xiaoming Zou，Xiaoyu Xiao，Yu He，et al.Hormetic effects of metal ions upon V.fischeri and the application of a new parameter for the quantitative assessment of hormesis[J].Journal of Hazardous Materials，2017，322：454-460

Abstract：In order to study the effects of ferric ion on the activity of immobilized and free ammonia-oxidizing and nitrite-oxidizing bacteria，the polyethylene glycol-algin-CaCl2 was used to embed freshwater and marine nitrifying bacteria.The results showed that compared with immobilized nitrifying bacteria，F(xiàn)e3+ had a greater effect on free nitrifying bacteria.Immobilized freshwater nitrifying bacteria was expected to show the highest activity when the concentration of Fe3+ was 1 mg·L-1，after 120 h，the activity of free ammonia-oxidizing bacteria in freshwater decreased significantly，greatly affected by Fe3+ ，but it had a little effect on ammonia-oxidation activity.Under the different concentration of Fe3+ ，the activity of immobilized marine ammonia-oxidizing and nitrite-oxidizing bacteria was similar to that of without Fe3+ ，but the activity of free marine nitrifying bacteria decreased slightly with the increase of Fe3+ concentration.

Key words：ferric ion；immobilization；nitrifying bacteria；nitrification activity

（收稿日期：2017-04-02）