梁滬蓮+郭小雅+劉洋+劉伶俐+宋志文+徐愛(ài)玲

摘 要：采用聚乙二醇—海藻酸鈉—氯化鈣方法包埋淡水型和海水型硝化細(xì)菌，比較分析鐵離子對(duì)固定化和游離態(tài)硝化細(xì)菌中氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌活性的影響。結(jié)果表明，F(xiàn)e3+對(duì)游離態(tài)硝化細(xì)菌的影響大于固定化硝化細(xì)菌，當(dāng)Fe3+濃度為1 mg·L-1時(shí)固定化淡水硝化細(xì)菌氨氧化活性最高，游離態(tài)淡水型氨氧化活性受Fe3+影響較大，120 h后明顯降低，但對(duì)亞硝酸鹽氧化活性影響均較小。在不同F(xiàn)e3+濃度條件下，固定化海水硝化細(xì)菌氨氧化活性和亞硝酸鹽氧化活性與不加Fe3+組基本相同，而游離態(tài)海水型氨氧化和亞硝酸鹽氧化活性均隨Fe3+濃度增大而略有降低。

關(guān)鍵詞：鐵離子；固定化；硝化細(xì)菌；硝化活性

硝化細(xì)菌屬化能自養(yǎng)菌，具有代時(shí)長(zhǎng)、生長(zhǎng)緩慢、易流失、對(duì)環(huán)境因子變化敏感等特點(diǎn)[1，2]。微生物固定化技術(shù)利用化學(xué)或物理手段將游離微生物固定在特定載體上，使其保持活性并可反復(fù)利用，對(duì)解決硝化細(xì)菌菌體流失，提高抗沖擊負(fù)荷能力，維持系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行有重要作用[3]。

鐵是微生物的礦物營(yíng)養(yǎng)，對(duì)微生物生長(zhǎng)必不可少，其主要作用是：元素鐵存在于細(xì)胞色素、鐵氧還蛋白和鐵硫蛋白中，是氧化還原載體和電子傳遞鏈的組成部分，能使氨氧化的中間物羥氨釋放的2個(gè)電子經(jīng)電子傳遞鏈傳給氧，磷酸化產(chǎn)生能量[4]。硝化細(xì)菌具有復(fù)雜的膜內(nèi)褶結(jié)構(gòu)，鐵離子能夠加大細(xì)胞膜滲透性，從而加快營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收速度。研究表明，在活性污泥系統(tǒng)中，鐵能加快硝化作用的進(jìn)行。但微生物對(duì)礦質(zhì)元素的需要僅是微量的，含量過(guò)高會(huì)引起抑制或毒害作用[5，6]。

本研究利用聚乙二醇—海藻酸鈉—氯化鈣作為包埋載體，分別制備淡水型和海水型硝化細(xì)菌固定化小球，研究Fe3+對(duì)固定化和游離態(tài)硝化細(xì)菌中氨氧化菌和亞硝酸鹽氧化菌活性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

硝化細(xì)菌菌劑包括淡水型硝化細(xì)菌和海水型硝化細(xì)菌兩種，由實(shí)驗(yàn)室自行制備，均由氨氧化菌（AOB）和亞硝酸鹽氧化菌（NOB）組成。

人工海水由海水素（青島通用海大海水素有限公司）配制而成，鹽度28‰。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 硝化細(xì)菌固定化方法

采用4%聚乙二醇、2.5%海藻酸鈉的混合包埋劑，以4% CaCl2溶液為交聯(lián)劑，按菌膠比1∶2進(jìn)行包埋，交聯(lián)時(shí)間24 h，詳細(xì)方法參見文獻(xiàn)[7]。

1.2.2 Fe3+對(duì)氨氧化菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)分為淡水和海水硝化細(xì)菌組。淡水實(shí)驗(yàn)組用氯化銨配制10 mg·L-1氨氮溶液，加入三氯化鐵使Fe3+濃度分別為0、0.5、1、5、10 mg·L-1，分別加入1 g固定化小球或相當(dāng)劑量的游離態(tài)硝化細(xì)菌，設(shè)定空白對(duì)照組。25 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每24 h測(cè)定氨氮濃度。海水實(shí)驗(yàn)組采用人工海水溶液，氨氮濃度15 mg·L-1，其余同淡水組。

1.2.3 Fe3+對(duì)亞硝酸鹽氧化菌活性的影響

實(shí)驗(yàn)分為淡水和海水硝化細(xì)菌組。淡水試驗(yàn)組用亞硝酸鈉試劑配制20 mg·L-1亞硝酸鹽溶液，加入三氯化鐵使Fe3+濃度為0、0.5、1、5、10 mg·L-1，分別加入1 g固定化小球或相當(dāng)劑量的游離態(tài)硝化細(xì)菌，設(shè)定空白對(duì)照組。25 ℃、150 r/min條件下?lián)u床培養(yǎng)，每24 h測(cè)定亞硝酸鹽氮濃度。海水實(shí)驗(yàn)組采用人工海水溶液，其余同淡水組。

1.3 分析方法

氨氮采用納氏試劑分光光度法測(cè)定；亞硝酸鹽氮采用N-（1-萘基）-乙二胺光度法測(cè)定[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝化細(xì)菌固定化效果

研究發(fā)現(xiàn)，采用聚乙二醇包埋硝化細(xì)菌無(wú)法成球。海藻酸鈉對(duì)微生物細(xì)胞起一定保護(hù)作用，可提高固定化細(xì)胞活性[9]；水溶液中海藻酸鈉會(huì)電解產(chǎn)生海藻酸陰離子，與氯化鈣產(chǎn)生的二價(jià)鈣離子發(fā)生靜電作用而交聯(lián)[10]。添加海藻酸鈉，以氯化鈣作為交聯(lián)劑，不僅容易成球，無(wú)粘連現(xiàn)象，而且制作的小球機(jī)械強(qiáng)度高，傳質(zhì)性能好。但海藻酸鈉濃度過(guò)高會(huì)出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，濃度過(guò)低，不易形成小球；氯化鈣濃度過(guò)高，不利于硝化細(xì)菌活性，濃度低時(shí)，交聯(lián)不徹底，固定化小球易破碎溶解[11]。通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)，確定了制備的固定化小球的最佳方法，采用該方法制備的小球彈性好，無(wú)破損（見圖1）。

2.2 Fe3+對(duì)固定化和游離態(tài)硝化細(xì)菌AOB活性的影響

考察Fe3+對(duì)固定化和游離態(tài)硝化細(xì)菌菌劑中氨氧化菌活性的影響。結(jié)果見圖2。

從圖2中可以看出，F(xiàn)e3+對(duì)固定化淡水硝化細(xì)菌的影響較固定化海水硝化細(xì)菌大，當(dāng)Fe3+濃度為1 mg·L-1和5 mg·L-1時(shí)，固定化淡水硝化細(xì)菌氨氧化活性較高，并且1 mg·L-1濃度組大于5 mg·L-1濃度組，0.5 mg·L-1濃度組氨氧化菌活性則有所降低；在不同F(xiàn)e3+濃度條件下，固定化海水硝化細(xì)菌氨氧化活性基本相同。

Fe3+對(duì)游離態(tài)淡水硝化細(xì)菌活性的影響較游離態(tài)海水硝化細(xì)菌大。反應(yīng)初期Fe3+對(duì)淡水型和海水型氨氧化活性的影響均較小，120 h后氨氧化活性降低，經(jīng)過(guò)168 h處理，游離態(tài)海水組氨氮去除率隨Fe3+濃度增大而降低，均在60%左右；而淡水型10 mg·L-1濃度組氨氮去除率為61%，不加Fe3+組去除率為91.5%，其余組去除率在70%左右。

2.3 Fe3+對(duì)固定化和游離態(tài)硝化細(xì)菌NOB活性的影響

考察Fe3+對(duì)固定化和游離態(tài)硝化細(xì)菌菌劑中亞硝酸鹽氧化菌活性的影響。結(jié)果見圖3。

從圖3中可以看出，F(xiàn)e3+對(duì)固定化淡水硝化細(xì)菌亞硝酸鹽氧化活性的影響較固定化海水硝化細(xì)菌大，前期固定化淡水亞硝酸鹽氧化菌活性明顯降低，72 h后1 mg·L-1濃度組亞硝酸鹽氧化菌活性略有提高；在不同F(xiàn)e3+濃度條件下，固定化海水亞硝酸鹽氧化菌的活性均較高，僅36 h，亞硝酸鹽氮去除率均達(dá)到100%。

Fe3+對(duì)游離態(tài)淡水和海水亞硝酸鹽氧化菌的活性影響較小，游離態(tài)淡水組不加Fe3+的亞硝酸鹽去除率達(dá)到61%，其它組去除率在50%左右；而游離態(tài)海水亞硝酸鹽氧化菌活性隨Fe3+濃度增加而略有降低，24 h后，亞硝酸鹽氧化菌的活性明顯降低，經(jīng)120 h處理，不加Fe3+組亞硝酸鹽去除率為100%，其余組分別為94.5%、910%、891%、85.6%。

3 討論

微生物固定化可以極大限度地保護(hù)菌劑活性，提高硝化細(xì)菌的抗沖擊能力和載體中的微生物密度，維持系統(tǒng)穩(wěn)定運(yùn)行。

本研究考察了不同濃度Fe3+對(duì)固定化淡水型和海水型硝化細(xì)菌氨氧化和亞硝酸鹽氧化活性的影響，并與游離態(tài)硝化細(xì)菌進(jìn)行了對(duì)比分析。從結(jié)果上看，F(xiàn)e3+對(duì)游離態(tài)硝化細(xì)菌活性的影響大于固定化硝化細(xì)菌，游離態(tài)硝化細(xì)菌活性隨Fe3+濃度的增大而降低，可能與Fe3+能與微生物中的酶結(jié)合，使酶失去活性有關(guān)。Fe3+對(duì)游離態(tài)硝化細(xì)菌具有毒害作用，從而影響硝化作用[12]。楊維等[13]研究地下水中鐵錳等對(duì)氮轉(zhuǎn)化的影響，結(jié)果證明低含量的鐵對(duì)硝化有促進(jìn)作用，高含量鐵則對(duì)硝化作用有抑制作用，與本研究結(jié)果一致。

Fe3+對(duì)固定化淡水型和海水型硝化細(xì)菌的活性影響較小，尤其是對(duì)亞硝酸鹽氧化菌活性影響最小。固定化硝化細(xì)菌的氨氧化和亞硝酸鹽氧化速率大于游離態(tài)硝化細(xì)菌，分析原因可能為Fe3+與包埋材料中聚乙二醇會(huì)發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)[14]，減少系統(tǒng)中鐵離子濃度，從而減小了對(duì)硝化細(xì)菌活性的影響。對(duì)于淡水硝化細(xì)菌來(lái)說(shuō)，F(xiàn)e3+對(duì)固定化小球的影響大于游離態(tài)硝化細(xì)菌，但對(duì)海水硝化細(xì)菌活性影響相對(duì)較小，可能是由于海水pH較高，F(xiàn)e3+可與OH-發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生沉淀，降低了Fe3+的濃度[15]。

4 結(jié)論

Fe3+對(duì)游離態(tài)硝化細(xì)菌的影響大于固定化硝化細(xì)菌。Fe3+濃度為1 mg·L-1時(shí)固定化淡水型硝化細(xì)菌氨氧化活性最大，亞硝酸鹽氧化活性受Fe3+影響較??；游離態(tài)淡水型氨氧化活性受Fe3+影響較大，在120 h后明顯降低，亞硝酸鹽去除率則與不加Fe3+組相差不大。

在不同F(xiàn)e3+濃度條件下，固定化海水硝化細(xì)菌氨氧化活性和亞硝酸鹽氧化活性與不加Fe3+組基本相同；而游離態(tài)海水型氨氧化和亞硝酸鹽氧化活性均隨Fe3+濃度增大而略有降低。

參考文獻(xiàn)：

[1] 劉少敏，儲(chǔ)磊，朱敬林.固定化硝化細(xì)菌去除生活污水中的氨氮[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014（10）：4261-4266

[2] 羅小溪，高建忠，陳再忠.硝化細(xì)菌富集培養(yǎng)及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].水產(chǎn)科技情報(bào)，2013（6）：320-323

[3] 南曉梅，宋新山，趙曉祥.硝化細(xì)菌包埋固定化條件的研究[J].應(yīng)用化工，2014（02）：200-202

[4] M Fourquez，A Devez，A Schaumann，et al.Effects of iron limitation on growth and carbon metabolismin oceanic and coastal heterotrophic bacteria[J].Limnology & Oceanography，2014，52（9）：349-353

[5] 劉少敏，儲(chǔ)磊，朱敬林.固定化硝化細(xì)菌去除生活污水中的氨氮[J].環(huán)境工程學(xué)報(bào)，2014（10）：4261-4266

[6] Ahmed J Mugwar，Michael J Harbottle.Toxicity effects on metal sequestration by microbially-induced carbonate precipitation[J].Journal of Hazardous Materials，2016，314：237-248

[7] 劉伶俐.硝化細(xì)菌固定化方法研究[D].青島，青島理工大學(xué)，2012

[8] 國(guó)家環(huán)保局《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》編委會(huì).水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法，第四版[M].北京：中國(guó)環(huán)境科學(xué)出版社，2002

[9] Yongxiang Luo，Guilin Luo，Michael Gelinsky，et al.3D bioprinting scaffold usialginate/Polyvinyl alcohol bioinks[J].Materials Letters，2017，189：295-298

[10] Yuwei Dong，Yanqiu Zhang，Baojun Tu，et al.Immobilization of ammonia-oxidizing bacteria by calcium alginate[J].Ecological Engineering，2014，73：809-814

[11] E Priyadarshini，N Pradhan.Gold nanoparticles as efficient sensors in colorimetric detection of toxic metal ions：A review[J].Sensors and Actuators B：Chemical，2017，238：888-902

[12] LI Tao，JI Xiaojun，WU Na，et al.Progress on effects of metal ions on lipid accumulation of oleaginous microorganism[J].Chemical Industry & Engineering Progress，2016，4：324-327

[13] 楊維，王泳，郭毓，等.地下水中鐵錳對(duì)氮轉(zhuǎn)化影響的實(shí)驗(yàn)研究[J].沈陽(yáng)建筑大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2008（02）：286-290

[14] 李亞峰，張馳，王健.重金屬離子對(duì)亞硝化的影響研究[J].水處理技術(shù)，2016（02）：96-99.

[15] Xiaoming Zou，Xiaoyu Xiao，Yu He，et al.Hormetic effects of metal ions upon V.fischeri and the application of a new parameter for the quantitative assessment of hormesis[J].Journal of Hazardous Materials，2017，322：454-460

Abstract：In order to study the effects of ferric ion on the activity of immobilized and free ammonia-oxidizing and nitrite-oxidizing bacteria，the polyethylene glycol-algin-CaCl2 was used to embed freshwater and marine nitrifying bacteria.The results showed that compared with immobilized nitrifying bacteria，F(xiàn)e3+ had a greater effect on free nitrifying bacteria.Immobilized freshwater nitrifying bacteria was expected to show the highest activity when the concentration of Fe3+ was 1 mg·L-1，after 120 h，the activity of free ammonia-oxidizing bacteria in freshwater decreased significantly，greatly affected by Fe3+ ，but it had a little effect on ammonia-oxidation activity.Under the different concentration of Fe3+ ，the activity of immobilized marine ammonia-oxidizing and nitrite-oxidizing bacteria was similar to that of without Fe3+ ，but the activity of free marine nitrifying bacteria decreased slightly with the increase of Fe3+ concentration.

Key words：ferric ion；immobilization；nitrifying bacteria；nitrification activity

（收稿日期：2017-04-02）