陶旻楓++王小榕

[摘要] 目的 研究宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）組織中高危型HPV感染對(duì)凋亡、增殖基因表達(dá)的影響。 方法 選擇2013年5月～2016年10月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院進(jìn)行活檢的CIN組織和炎性病變組織，分別作為CIN組和對(duì)照組。測(cè)定高危型HPV感染情況，根據(jù)HPV-DNA的RLU/CO將CIN組織分為<1 RLU/CO組、1～100 RLU/CO組、>100～1000 RLU/CO組、>1000 RLU/CO組。同時(shí)，測(cè)定宮頸組織中細(xì)胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白的表達(dá)量。 結(jié)果 CIN組宮頸組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。1～100 RLU/CO組、>100～1000 RLU/CO組、>1000 RLU/CO組CIN組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達(dá)量顯著高于<1 RLU/CO組，且HPV-DNA的RLU/CO越高，cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中高危型HPV感染能夠增加細(xì)胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白的基因表達(dá)量。

[關(guān)鍵詞] 宮頸上皮內(nèi)瘤變；高危型人乳頭瘤病毒；細(xì)胞周期；凋亡抑制蛋白

[中圖分類號(hào)] R737.33 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（b）-0080-05

Effect of high risk HPV infection on the genes expression of apoptosis and proliferation in cervical intraepithelial neoplasia

TAO Minfeng1 WANG Xiaorong2

1.Health Department， Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University， Beijing 100026， China； 2.Department of Perinatal Medicine， Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University， Beijing 100026， China

[Abstract] Objective To study the effect of high risk HPV infection on the expression of apoptosis and proliferation genes in cervical intraepithelial neoplasia （CIN）. Methods CIN tissues and inflammatory lesions tissues received biopsy in Beijing Maternal and Child Health Care Hospital， Beijing Obstetrics and Gynecology Hospital， Capital Medical University from May 2013 to December 2016 were collected， respectively enrolled in CIN group and control group. CIN tissues were divided into <1 RLU/CO group， 1-100 RLU/CO group， >100-1000 RLU/CO group， >1000 RLU/CO group according to HPV-DNA RLU/CO. Meanwhile， cell cycle protein and its kinase， inhibitor of apoptosis proteins in cervical tissue were determined. Results Expression levels of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA in cervical tissue of CIN group were significantly higher than those of control group， with statistically significant differences （P < 0.05）. Expression levels of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA in CIN cervical tissue of 1-100 RLU/CO group， >100-1000 RLU/CO group， >1000 RLU/CO group were significantly higher than those of the <1 RLU/CO group， and the higher the HPV-DNA RLU/CO， the higher the expression of cyclinB1， cyclinD1， cyclinE， CDK4， CDK6， Apollon， c-IAP1， Survivin， Livin mRNA， with statistically significant differences （P < 0.05）. Conclusion High risk HPV infection in cervical intraepithelial neoplasia can increase the expression of cyclin and its kinase and inhibitor of apoptosis protein genes.

[Key words] Cervical intraepithelial neoplasia； High risk human papilloma virus； Cell cycle； Inhibitor of apoptosis protein

宮頸上皮內(nèi)瘤變（cervical intraepithelial neoplasia，CIN）是宮頸癌的癌前病變，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染，尤其是高危型HPV感染是造成CIN的明確危險(xiǎn)因素[1-2]。HPV是一類球形DNA病毒，感染局部組織后能夠整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組DNA，進(jìn)而引起宿主細(xì)胞增殖、凋亡等多種生物學(xué)行為的改變[3-5]。但是，目前關(guān)于高危型HPV感染引起宮頸上皮細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)過(guò)程異常的分子機(jī)制并未完全闡明。細(xì)胞的凋亡和增殖過(guò)程受到多種基因表達(dá)產(chǎn)物調(diào)控，細(xì)胞周期蛋白及相應(yīng)的激酶通過(guò)加速細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖，凋亡抑制蛋白通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡促進(jìn)細(xì)胞增殖。本研究檢測(cè)了宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中凋亡、增殖基因的表達(dá)量以及高危型HPV感染對(duì)凋亡、增殖基因表達(dá)的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料

實(shí)驗(yàn)標(biāo)本取自2013年5月～2016年10月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院北京婦幼保健院進(jìn)行活檢的子宮頸組織，均經(jīng)病理學(xué)檢查明確診斷，CIN組織作為CIN組，炎性病變組織作為對(duì)照組。CIN組68例，年齡32～58歲，平均（39.5±6.2）歲；CIN Ⅰ期22例，CIN Ⅱ期29例，CIN Ⅲ期17例；體重指數(shù)（BMI）為（22.8±3.2）kg/m2。對(duì)照組50例，年齡29～60歲，平均（40.2±6.6）歲；BMI為（23.1±3.7）kg/m2。兩組患者年齡、BMI等一般資料比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 試劑 HPV核酸檢測(cè)試劑盒（HC-2法）購(gòu)買于深圳凱杰生物工程公司，Trizol裂解液購(gòu)買于Invitrogen公司，RNA分離提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒以及熒光定量PCR試劑盒購(gòu)買于北京天根生物公司。

1.2.2 高危型HPV檢測(cè) 取30～50 mg宮頸組織，采用HPV核酸檢測(cè)試劑盒（HC-2法）檢測(cè)樣本發(fā)光單位RLU，計(jì)算RLU與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照臨界值CO的比值，將RLU/CO>1.0的樣本判斷為HPV-DNA陽(yáng)性。所選用的試劑盒能檢測(cè)HPV-16、-18、-31、-33、-35、-39、-45、-51、-52、-56、-58、-59、-68共13種高危型HPV DNA。根據(jù)RLU/CO將CIN標(biāo)本分為<1 RLU/CO組、1～100 RLU/CO組、>100～1000 RLU/CO組、>1000 RLU/CO組。

1.2.3 基因檢測(cè) 取30～50 mg宮頸組織，加入1 mL Trizol裂解液充分研磨組織，采用RNA分離提取試劑盒分離得到組織研磨液中的總RNA，采用cDNA第一鏈合成試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取cDNA樣本并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，所用試劑為熒光定量PCR試劑盒，擴(kuò)增的基因包括cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin以及GAPDH，引物序列及產(chǎn)物長(zhǎng)度見(jiàn)表1，PCR條件見(jiàn)表2，均進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。得到擴(kuò)增曲線后以GAPDH為內(nèi)參計(jì)算cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CIN組織和正常宮頸組織中細(xì)胞周期蛋白及其激酶mRNA表達(dá)量

CIN組中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.2 不同高危型HPV感染情況CIN組織中細(xì)胞周期蛋白及其激酶mRNA表達(dá)量

高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表4。

2.3 CIN組織和正常宮頸組織中凋亡抑制蛋白mRNA表達(dá)量

CIN組中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

2.4 不同高危型HPV感染情況CIN組織中凋亡抑制蛋白mRNA表達(dá)量

高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN組織中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達(dá)量越高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見(jiàn)表6。

3 討論

CIN是宮頸癌的癌前病變類型，宮頸上皮細(xì)胞增殖和凋亡過(guò)程異常，細(xì)胞不斷增殖并向惡性表現(xiàn)轉(zhuǎn)化。細(xì)胞周期蛋白及其激酶是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期進(jìn)程以及細(xì)胞增殖的重要分子[6-7]。HPV的E1、E4、E7等蛋白能夠與pPb結(jié)合并使其激活，進(jìn)而增加轉(zhuǎn)錄因子E2F的活性并啟動(dòng)cyclinB1、cyclinD1、cyclinE多種細(xì)胞周期蛋白的表達(dá)[8-9]。上述細(xì)胞周期蛋白與其激酶CDK4、CDK6結(jié)合形成復(fù)合物后能夠促進(jìn)細(xì)胞周期的運(yùn)行以及細(xì)胞的增殖[10-12]。本研究對(duì)CIN組織中上述細(xì)胞周期蛋白及其激酶mRNA表達(dá)量的分析表明：CIN組宮頸組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6 mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。提示細(xì)胞周期蛋白cyclinB1、cyclinD1、cyclinE以及激酶CDK4、CDK6的高表達(dá)與CIN的發(fā)生有關(guān)，CIN組織中細(xì)胞周期蛋白及其激酶形成復(fù)合體后能夠加速細(xì)胞周期發(fā)展，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

在惡性腫瘤及癌前病變的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中，細(xì)胞惡性變的過(guò)程不僅與細(xì)胞周期進(jìn)程的加速有關(guān)，還與多種凋亡抑制蛋白表達(dá)增加有關(guān)。Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin是與宮頸病變密切相關(guān)的幾種凋亡抑制蛋白。Apollon是新發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制蛋白，具有BIR結(jié)構(gòu)域和泛素結(jié)合結(jié)構(gòu)域，能夠抑制Smac所誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡以及caspase-9所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡[13-14]。c-IAP1能夠與TRAF結(jié)合并啟動(dòng)泛素化過(guò)程，進(jìn)而釋放活化的NF-κB因子并促進(jìn)細(xì)胞存活[15]。Survivin和Livin均能夠與caspase家族中的caspase-3、caspase-7結(jié)合并抑制細(xì)胞凋亡[16-17]。本研究對(duì)CIN組織中上述凋亡抑制蛋白mRNA表達(dá)量的分析表明：CIN組宮頸組織中Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin mRNA表達(dá)量顯著高于對(duì)照組（P < 0.05）。說(shuō)明凋亡抑制蛋白Apollon、c-IAP1、Survivin、Livin的高表達(dá)與CIN的發(fā)生有關(guān)，CIN組織中多種凋亡抑制蛋白表達(dá)的增加會(huì)造成宮頸上皮組織中細(xì)胞凋亡過(guò)程受到抑制，進(jìn)而造成細(xì)胞異常增殖。

高危型HPV感染與CIN及宮頸癌之間的密切相關(guān)已經(jīng)得到了一致認(rèn)可，宮頸組織中持續(xù)感染的高危型HPV能夠?qū)⒉《颈旧淼腄NA整合進(jìn)入宿主細(xì)胞的基因組DNA，造成宿主細(xì)胞多種基因表達(dá)改變，進(jìn)而導(dǎo)致宿主細(xì)胞生物學(xué)行為的改變[18-24]。但是，目前關(guān)于宮頸上皮內(nèi)瘤變組織中受到高危型HPV影響的基因尚未明確。本研究中，為了明確高危型HPV感染對(duì)CIN組織中細(xì)胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白表達(dá)的影響，按照HPV-DNA的RLU/CO將CIN組織分為四組并分析了細(xì)胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA表達(dá)量。結(jié)果顯示：高危型HPV感染的RLU/CO比值越高，CIN組織中cyclinB1、cyclinD1、cyclinE、CDK4、CDK6、Apollon、c-IAP1、Survivin、Livinn mRNA表達(dá)量越多。說(shuō)明高危型HPV感染與CIN組織中細(xì)胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA的高表達(dá)有關(guān)，HPV感染能夠增加CIN組織中上述基因的表達(dá)量。

綜上所述，本研究認(rèn)為，CIN組織中高危型HPV感染能夠增加細(xì)胞周期蛋白及其激酶、凋亡抑制蛋白mRNA的表達(dá)量。但是由于臨床樣本量較少，仍需通過(guò)后續(xù)增加樣本量來(lái)進(jìn)一步驗(yàn)證和明確上述研究結(jié)論。

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（收稿日期：2017-03-01 本文編輯：程 銘）