譚韡++于紅剛++羅和生++周巍

[摘要] 目的 探討慢病毒載體靶向攜帶Akt1基因短發(fā)夾RNA（Akt1-shRNA）對胃癌細(xì)胞SGC-7901凋亡和增殖的影響。 方法 構(gòu)建表達(dá)Akt1-shRNA的慢病毒載體，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后獲得Akt1-shRNA的慢病毒顆粒，病毒感染胃癌SGC-7901細(xì)胞（SGC-LV-shAkt1）為實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，SGC7901細(xì)胞和轉(zhuǎn)染慢病毒空載體SGC7901細(xì)胞（SGC-LV-shCON）為對照組細(xì)胞。Real-Time PCR檢測Akt1 mRNA表達(dá)水平，Western blot檢測胃癌細(xì)胞Akt1、phospho-Akt（ser473）和bcl-2蛋白表達(dá)水平，然后流式雙染法、生長速率等方法檢測Akt1 shRNA對SGC-7901細(xì)胞凋亡及增殖能力的影響。 結(jié)果 成功構(gòu)建Akt1基因RNAi的慢病毒載體LV-shAkt1，病毒滴度為5×108 TU/mL。SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，實(shí)驗(yàn)組（SGC-LV-shAkt1）Akt1 mRNA 和Akt1、p-Akt、bcl-2蛋白表達(dá)水平較對照組（SGC-7901、SGC-LV-shCON）降低（P < 0.01）；（38.7±3.5）%的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡（P < 0.05）。SGC-LV-shAkt1細(xì)胞生長曲線平緩，生長速度較另兩種細(xì)胞（SGC-7901、SGC- LV-shCON）明顯降低。 結(jié)論 靶向Akt1的RNAi 能有效抑制胃癌細(xì)胞SGC-7901的生長，誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，下調(diào)抗凋亡蛋白bcl-2有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] Akt1；慢病毒載體；胃癌；凋亡

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（b）-0023-05

Department of Gastroenterology， Renmin Hospital of Wuhan University Hubei Key Laboratory of Digestive System Disease， Hubei Province， Wuhan 430060， China

[Abstract] Objective To investigate the apoptosis and proliferation effect of lentiviral vectors shRNA for Akt1 to human gastric carcinoma SGC-7901 cells. Methods The lentiviral vectors Akt1-shRNA were constructed， lentivirus Akt1-shRNA was transfected into human gastric carcinoma SGC-7901 cells， the SGC-7901 cell strained with Akt1 gene silencing perpetually （SGC-LV-shCON） was as conrol group cell and amplified （SGC LV-shAkt1） was as experiment group cell. Effect of Akt1 on SGC-7901 cells were measured by RT-PCR， Western-blot， flow cytometry of annexin V-FITC/PI， tumor growth curve. Results Akt1 RNAi lentiviral vectors LV-shAkt1 was established successfully， virus titer was 5×108 TU/mL. After SGC-7901 cell transfection， the expression of Akt1 mRNA in experiment group （SGC- LV-shAkt1） was weaker than that in the control group （SGC-7901， SGC- LV-shCON）， and Akt1， p-Akt and bcl-2 protein expressions in experiment group was inhabited （P < 0.01）， （38.7±3.5）% cell in experiment group happened apotosis （P < 0.05）. The cell growth curve of SGC-LV-shAkt1 cell was gentle， compared with SGC-7901 cell or SGC- LV-shCON cell， the growth was lower. Conclusion The lentiviral vectors mediated shRNA for Akt1 can significantly inhibit the expression of Akt1 gene in vitro and markedly inhibit SGC-7901 cell growth and induce the apoptosis of gastric carcinoma cell.The mechanism may be down-regulation of PI3K/Akt signal pathway and anti-apoptosis protein bcl-2 expression.

[Key words] Akt1； Lentiviral vector； Gastric carcinoma； Apotosis

Akt，又稱蛋白激酶B （protein kinase B，PKB） ，是1種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。目前發(fā)現(xiàn)至少存在3種Akt家族成員：Aktl/PKBα、Akt2/PKBβ、Akt3/PKBγ[1]。許多文獻(xiàn)報(bào)道，Akt與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切[2-3]。慢病毒載體靶向介導(dǎo)的RNA干擾（RNA interference，RNAi）是一種高效的基因沉默技術(shù)，能特異性阻斷哺乳動(dòng)物細(xì)胞中靶基因的表達(dá)[4]。本研究通過構(gòu)建Akt1靶向短發(fā)夾RNA（shRNA）真核表達(dá)載體，阻斷胃癌細(xì)胞Akt1的表達(dá)，觀察轉(zhuǎn)染后胃癌細(xì)胞增殖和凋亡的變化，為其在臨床上的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

人胃癌細(xì)胞SGC-7901購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000，Trizol試劑和兔抗人Akt1、phospho-Akt（ser473）購自Invitrogen公司。鼠抗人bcl-2抗體購自Sigma公司、actin抗體和ECL發(fā)光劑購自美國Santa Cruz公司。RT-PCR試劑盒來自TOYOBO公司，引物由上海Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒及磷酸化蛋白提取試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。

慢病毒載體系統(tǒng)：慢病毒載體系統(tǒng)由pGCL-GFP 載體、pHelper1.0（gag/pol 元件）載體、Helper2.0（VSVG 元件）載體3種質(zhì)粒組成，其中pGCSIL-GFP 載體含有能持續(xù)表達(dá)shRNA 的元件，同時(shí)能表達(dá)綠色熒光蛋白GFP；pHelper1.0 和pHelper2.0含有病毒包裝所必須的元件（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 人胃癌細(xì)胞培養(yǎng) 細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37℃、5%CO2，常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞為單層貼壁生長，待貼壁細(xì)胞融合達(dá)70%～80%時(shí)以胰酶消化傳代。

1.2.2 慢病毒靶向Akt1 shRNA表達(dá)載體構(gòu)建 根據(jù)短發(fā)夾RNA設(shè)計(jì)原則和Genebank中報(bào)道的Akt1核苷酸序列（N0.NM005163），設(shè)計(jì)合成3對針對Akt1基因siRNA的寡核苷酸序列，經(jīng)分別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞（慢病毒的包裝細(xì)胞），據(jù)其對Akt1的抑制率，確定有效的靶序列：5'-GGCCAAGTCCTTGCTTTCA-3'。據(jù)此設(shè)計(jì)出針對靶序列的兩條互補(bǔ)DNA序列，具體序列如下：5'-CCGGGAGGCCAAGTCCTTGCTTTC？鄄ATTCAAGAGATGAAAGCAAGGACTTGGCCTCTTTTT？鄄G-3'；5'-AATTCAAAAAGAGGCCAAGTCCTTGCTTT？鄄CATCTCTTGAATGAAAGCAAGGACTTGGCCTC-3'，上述每條鏈序列即為21 nt有效靶序列，插入pGCSIL-GFP再同步合成另一長21 nt與人類基因組無關(guān)堿基序列，并插入相同載體作為陰性對照。將其轉(zhuǎn)化DH5α大腸埃希菌，挑取重組陽性克隆進(jìn)行PCR 及測序鑒定。PCR鑒定陽性克隆的上游引物序列為：5'-CCTATTTCCCATGATTCCTTCATA-3'，下游引物：5'-GTA？鄄ATACGGTTATCCACGCG-3'。合成成功的以上重組載體與pHelper1.0載體、pHelper2.0載體包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，收集轉(zhuǎn)染后48 h的293T細(xì)胞培養(yǎng)上清液體，經(jīng)濃縮獲得有活性的慢病毒顆粒載體（Akt1-RNAi-LV、NC-LV），過濾濃縮、測定病毒滴度，測得病毒滴度為5×108 TU/mL，并獲得SGC-7901的MOI值（SGC-7901 MOI值是10）后-80℃保存。

1.2.3 載體病毒感染人胃癌細(xì)胞 收集SGC-7901細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)，接種至24孔板中。根據(jù)病毒滴度和SGC-7901的MOI值取對照慢病毒（NC-LV）和干擾慢病毒（Akt1-RNAi-LV）載體，感染靶細(xì)胞。感染12 h后，去除含病毒載體的培養(yǎng)液，洗滌后，加入新鮮含血清RPMI 1640繼續(xù)培養(yǎng)48 h，觀察細(xì)胞綠色熒光產(chǎn)生，獲得成功轉(zhuǎn)染Akt1-RNAi-LV和NC-LV的胃癌細(xì)胞，分別命名為SGC-LV-shAkt1（S-LV-A）和SGC-LV-shCON（S-LV-C）細(xì)胞，供進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.4 Real-Time PCR 檢測轉(zhuǎn)染前后Akt1 mRNA的表達(dá)：用0.25%胰蛋白酶消化并收集培養(yǎng)S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并計(jì)算細(xì)胞數(shù)，每個(gè)樣本收集等量細(xì)胞（3.0×106），用Trizol法提取上述3種細(xì)胞的總RNA。然后用RT-PCR 試劑盒鑒定轉(zhuǎn)染Akt1 的細(xì)胞克隆是否低表達(dá)。Akt1上游引物5'-GAGCGGGAGGAGTGGACAA-3'；下游引物5'-GGGACAGGTGGAAGAACAGC-3'，actin上游引物5'-CGAGCGGGAAATCGTG-CGT-GACATTAAGGAGA-3'，下游引物5'-CGTCATCTCCTGCTTGCTGATCCACA？鄄TCTG-3'。actin作為內(nèi)參照。PCR反應(yīng)條件為：94℃4 min變性，循環(huán)條件為94℃ 30 s，57.7℃（Akt1）40 s（β-actin 62.3℃），72 ℃ 40 s ，30次循環(huán)，72℃延伸5 min。7500 Real-Time PCR System儀器反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后，由7500 Real-Time PCR軟件自動(dòng)記錄熒光曲線并分析計(jì)算出Ct值。建立actin作為內(nèi)對照，檢測被測樣品RNA的完整性和可靠性。結(jié)果的計(jì)算：ΔΔCt=（樣品Ct均值-內(nèi)參照Ct均值）-（對照樣品Ct均值-對照內(nèi)參照Ct均值），然后取2-ΔΔCt即代表被檢樣品初始Akt1 mRNA的含量。

1.2.5 Western blot印跡檢測Akt1、p-Akt和bcl-2蛋白表達(dá) 用0.25%胰蛋白酶消化S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液并計(jì)算細(xì)胞數(shù)，每個(gè)樣本收集等量細(xì)胞（5.0×106），加入細(xì)胞裂解液，提取蛋白質(zhì)，以10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，然后將蛋白電泳轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC）上，硝酸纖維膜加入10 %脫脂奶粉封閉2 h后，加入一抗工作液（兔抗人Akt1、p-Akt、bcl-2、β-actin單克隆抗體，工作濃度為1∶1000；兔抗人bcl-2單克隆抗體，工作濃度為1∶400），4℃過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶3000稀釋）孵育1 h，應(yīng)用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光法顯影，暗室曝光于X線膠片上，定影顯影，以actin作為內(nèi)參照。

1.2.6 流式雙染法檢測上述三種細(xì)胞凋亡情況 按試劑盒說明書進(jìn)行操作，分別取S-LV-A、S-LV-C和SGC-7901細(xì)胞，0.25%胰酶消化，收集1×107個(gè)細(xì)胞，冷PBS緩沖液洗2次，重懸于1×結(jié)合緩沖液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×107/mL。取100 μL細(xì)胞懸液至流式專用試管中，再加400 μL 1×結(jié)合緩沖液，再依次加入5 μL AnnexinV-F ITC標(biāo)記液和10 μL PI標(biāo)記液，混勻，室溫避光孵育15 min后，上流式細(xì)胞儀檢測，用MULTICYLE 110 DNA專用分析軟件分析獲得數(shù)據(jù)。

1.2.7 生長速率檢測 上述3種細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液后，接種于6孔板，每種細(xì)胞接種7孔，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，每日取1孔細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，繪制細(xì)胞生長曲線。

1.2.8 細(xì)胞克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的增殖能力 上述3種細(xì)胞經(jīng)0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞懸液后，調(diào)整細(xì)胞密度為5×103/mL，接種至6孔板，10 d后，棄去培養(yǎng)液，固定、染色拍照，倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，大于50個(gè)細(xì)胞集落為1個(gè)克隆，根據(jù)公式計(jì)算克隆形成率：克隆形成率（%）=克隆數(shù)/5000×100%

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒靶向攜帶Akt1 shRNA在SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率的測定

熒光顯微鏡下觀察SGC-7901細(xì)胞轉(zhuǎn)染慢病毒載體情況：轉(zhuǎn)染后先在白光下觀察細(xì)胞形態(tài)，了解細(xì)胞數(shù)目。再在同一視野下選用藍(lán)光觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白的情況以評估轉(zhuǎn)染效率。成功轉(zhuǎn)染慢病毒靶向攜帶Akt1 shRNA的SGC-7901細(xì)胞可表達(dá)綠色熒光蛋白，在病毒（MOI=10）轉(zhuǎn)染48 h后，慢病毒靶向攜帶Akt1 shRNA的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到90%以上。見圖1。

2.2 Real-Time PCR 檢測Akt1 mRNA 表達(dá)水平

實(shí)驗(yàn)組（S-LV-A細(xì)胞）和對照組（S-LV-C和SGC-7901細(xì)胞）三種細(xì)胞中Akt1 mRNA的相對表達(dá)定量分別是（20.33±3.2）%、（45.97±3.7）%、（49.77±4.1）%，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。對照組內(nèi)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見圖2。

2.3 Akt1基因沉默后對SGC-7901生長和凋亡的影響

2.3.1 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細(xì)胞凋亡 實(shí)驗(yàn)組的凋亡率達(dá)到（38.7±3.5）%，而對照組的兩種細(xì)胞凋亡率低（1.3±0.8）%、（2.1±0.6）%，實(shí)驗(yàn)組與對照組比較，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見圖3。

2.3.2 Akt1基因沉默后對SGC-7901細(xì)胞生長速率的影響 三組細(xì)胞的生長曲線詳見圖4。實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞生長曲線較為平緩，生長速度較對照組兩種細(xì)胞降低。三組細(xì)胞接種6孔板10 d后，計(jì)算克隆形成率。結(jié)果表明：實(shí)驗(yàn)組比對照組兩種細(xì)胞的克隆形成能力明顯降低，根據(jù)公式計(jì)算克隆形成率分別為5.5%、27.1%和26.4%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖 5。

2.4 Western blot印跡檢測Akt1、p-Akt和bcl-2蛋白表達(dá)水平

三組細(xì)胞（SGC-7901、S-LV-C和S-LV-A細(xì)胞）Akt1、phospho-Akt（p-Akt）和bcl-2蛋白表達(dá)水平在對照組（SGC-7901和S-LV-C細(xì)胞）中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05），而在實(shí)驗(yàn)組（S-LV-A細(xì)胞）中表達(dá)水平明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見圖6。

3 討論

胃癌是常見的惡性腫瘤，位于全球癌癥相關(guān)死亡原因的第2位[5]，胃癌的發(fā)生發(fā)展與細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的異?；罨嘘P(guān)。在許多細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路中PI3K/Akt信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活已被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞抗凋亡的主要機(jī)制之一[6]。PI3K主要是通過其3位羥基磷酸化產(chǎn)物PIP3轉(zhuǎn)移蛋白激酶B（Akt）到細(xì)胞膜上，并改變Akt的構(gòu)象使之能被3′-磷脂酰肌醇依賴蛋白激酶1/2（PDK1/2）所磷酸化（p-Akt）和激活，從而傳遞抗凋亡和增殖信號(hào)[7]。因此，可以通過抑制Akt基因表達(dá)達(dá)到抑制腫瘤生長的目的[8]。

Akt，又稱蛋白激酶B[9]，該激酶蛋白由3個(gè)高度保守區(qū)組成：末端pleckstrin同源區(qū)（PH），中央激酶催化區(qū)（CAT）和包含一個(gè)疏水調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)的C末端擴(kuò)展區(qū)（EXT）。Akt主要有三種亞型：Akt1，Akt2，Akt3。在這三種亞型之間，PH區(qū)序列有約80%一致性，CAT區(qū)序列有約90%一致性，EXT區(qū)約為70%，而PH區(qū)和CAT區(qū)之間的連接區(qū)（LINK）則呈低保守性，三種亞型之間僅僅有17%～46%一致性[9]。由于缺乏特異性的阻斷劑，我們還無法了解Akt1、2、3三個(gè)亞型中的每個(gè)亞型準(zhǔn)確作用。

RNA干擾（RNAi）是一種新的基因阻斷方法[10]，其作用機(jī)制是將與mRNA序列同源互補(bǔ)一些短片斷的雙鏈RNA（shRNA、siRNA）導(dǎo)入細(xì)胞，從而使特定的mRNA發(fā)生降解，導(dǎo)致其基因沉默。RNAi抑制基因表達(dá)具有高效﹑特異和級(jí)聯(lián)式放大效應(yīng)，因而它更適合惡性腫瘤的研究和基因治療。

慢病毒載體是一種新近開發(fā)的、極具應(yīng)用前景的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)。利用慢病毒構(gòu)建的shRNA載體，可以更高效地轉(zhuǎn)染傳統(tǒng)試劑難于轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系如原代細(xì)胞、懸浮細(xì)胞和處于非分裂狀態(tài)的細(xì)胞，并且在轉(zhuǎn)染后整合到受轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組，從而長時(shí)間穩(wěn)定地抑制特定基因的表達(dá)[11]。

本研究通過成功構(gòu)建靶向人Akt1基因的shRNA 及其慢病毒表達(dá)載體，確定最適合的SGC-7901慢病毒MOI值并轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞。其最大特點(diǎn)是可穩(wěn)定整合于靶細(xì)胞的基因組，治療基因表達(dá)時(shí)間長[10]。本研究表明，轉(zhuǎn)染后S-LV-A細(xì)胞的Akt1 mRNA和蛋白的表達(dá)量較轉(zhuǎn)染S-LV-C細(xì)胞和未轉(zhuǎn)染細(xì)胞明顯減少，而S-LV-C和SGC-7901細(xì)胞Akt1 mRNA和蛋白的表達(dá)量比較無明顯變化，說明表達(dá)載體具有特異性沉默Akt1基因的作用。該載體轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后，細(xì)胞生長顯著受到抑制，并出現(xiàn)明顯的凋亡改變[凋亡率為（38.7±3.5）%]，說明阻斷Akt基因的亞型Akt1有促凋亡作用，進(jìn)一步證實(shí)了shRNA對靶基因的抑制作用。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)慢病毒靶向攜帶shRNA轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞后，活性形式的Akt即磷酸化Akt（phospho-Akt）蛋白和bcl-2蛋白表達(dá)明顯減少，提示SGC-7901細(xì)胞存在PI3K/Akt信號(hào)途徑的異常活化，抑制該通路可以誘導(dǎo)細(xì)胞出現(xiàn)明顯凋亡。其機(jī)制與沉默Akt1基因后，PI3K依賴性的磷酸化Akt（p-Akt）表達(dá)下調(diào)，抑制其下游bcl-2家族成員bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)線粒體調(diào)亡通路激活有關(guān)[12-15]。

本實(shí)驗(yàn)利用RNAi技術(shù)，有效敲低胃癌細(xì)胞Akt1的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)其可抑制胃癌細(xì)胞生長，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡，其機(jī)制與抑制PI3K/Akt通路活化，激活線粒體凋亡通路有關(guān)。Akt1基因是比較理想的腫瘤生物治療的靶點(diǎn)，為胃癌的基因治療提供了新的思路。

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（收稿日期：2017-03-10 本文編輯：蘇 暢）