徐怡++邱斌++熊永興++蘇鈦++李云

摘要：目的建立用高效液相色譜法測定八角蓮中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量的方法，比較不同產(chǎn)地八角蓮藥材3種化合物的含量。方法色譜柱：Waters Sunfire C18柱（5 μm，46×150 mm）；流動相：甲醇-04%磷酸溶液（45：55）；流速：10 mL/min；檢測波長：290 nm；進樣量：10 μL；柱溫30℃。結(jié)果槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的線性范圍分別為000973 μg-973 μg（r=09999）、001001 μg-1001 μg（r=09999）、000998 μg-998 μg（r=09999），平均回收率分別為9835%（RSD=26%）、10025%（RSD=23%）、10080%（RSD=27%）。結(jié)論該方法簡便可行，重復(fù)性好，可用于同時測定八角蓮藥材中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素3種成分的含量，為八角蓮藥材的質(zhì)量控制提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：八角蓮；槲皮素；鬼臼毒素；山柰素；高效液相色譜法

中圖分類號：R9272文獻標志碼：A文章編號：1007-2349（2017）07-0065-03

八角蓮（Dysosma versipellis Hance MCheng）隸屬于小檗科（Berberidaceae）八角蓮屬（Dysosma Woodson），為我國特有二級瀕危保護植物，主要分布在四川、云南、廣西和湖北神農(nóng)架林區(qū)及周邊地區(qū)[1-2]，其根和根莖入藥，有清熱解毒、化痰散結(jié)、祛瘀消腫之功效。用于治療癰癤腫痛、毒蛇咬傷、風濕關(guān)節(jié)痛、半身不遂、氣管炎、乙型肝炎等，也可做殺蟲劑。其主要有效成分有木脂素類物質(zhì)鬼臼毒素及其衍生物、黃酮類物質(zhì)山柰素和槲皮素等?，F(xiàn)代藥理研究表明[3-6]，鬼臼毒素具有抗腫瘤、抗菌、抗病毒和抗蛇毒等作用；黃酮類成分則在心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)和抗腫瘤方面具有明顯的藥理作用。目前對八角蓮中有效成分的含量測定研究僅限于鬼臼毒素，且對不同產(chǎn)地八角蓮中鬼臼毒素、槲皮素、山柰素等三種有效成分的含量比較尚未見報道。本文采用高效液相色譜法同時測定八角蓮中三種成分的方法，為客觀評價八角蓮藥材質(zhì)量提供了科學依據(jù)。

1儀器與試藥

11儀器美國Agilent 1100高效液相色譜儀（四元泵、DAD檢測器、自動進樣器、在線真空脫氣機、智能化柱溫箱及化學工作站）；恒溫水浴鍋；梅特勒-托利多AG285電子天平。

12試藥十二批八角蓮藥材由云南省藥物研究所收集，經(jīng)中國科學院昆明植物研究所李恒研究員鑒定為小檗科植物八角蓮Dysosma versipellis（Hance）MCheng，見表1。

對照品槲皮素（批號：100081-200406，純度973%）、鬼臼毒素（批號：111645-200301）、山柰素（批號：110861-200304）均由中國藥品生物制品檢定所提供；所用流動相甲醇、磷酸為色譜純，處理樣品的甲醇為分析純，水為超純水。

2方法與結(jié)果

21色譜條件色譜柱：Wasters Sunfire C18柱（5 μm，46×150 mm）；流動相：甲醇-04%磷酸溶液（45：55）；流速：10 mL/min；檢測波長：290 nm；進樣量：10 μL；柱溫30℃，理論塔板按槲皮素計算不低于4000，在該色譜條件下，供試品、對照品分離較好，與其他雜質(zhì)峰均能達到基線分離（見圖1）。

22溶液的制備

221對照品溶液的制備精密稱取對照品適量，加甲醇制成每1 mL中含槲皮素01 mg，鬼臼毒素01 mg，山柰素01 mg的溶液，作為對照品溶液。

222供試品溶液的制備取樣品05 g（過4號篩），精密稱定，置150 mL圓底燒瓶中，精密量取甲醇25 mL，稱重，80℃水浴回流30 min，放至室溫后，用甲醇補重，搖勻，用045 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液即得。

23線性關(guān)系考察精密稱取槲皮素1000 mg，鬼臼毒素1001 mg，山柰素998 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，得濃度分別為0973 mg/mL、1001 mg/mL、0998 mg/mL的混合標準品儲備液。精密吸取此儲備液逐級稀釋，分別注入液相色譜儀中，以對照品含量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線。得回歸方程為：Y槲皮素=14109X+18353，r=09999；Y鬼臼毒素=4837X +9504，r=09999；Y山奈素=15916X+16558，r =09999。結(jié)果表明，在上述色譜條件下，槲皮素在000973μg～973μg，鬼臼毒素在001001μg～1001μg，山柰素在000998μg～998μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

24準確度試驗（加樣回收試驗）精密稱取9份樣品（已測槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量分別為00645%、0125%、0241%，每份約025 g），分別添加適量對照品（含量的50%、100%、150%），然后按供試品溶液處理方法同法處理，將處理好的供試品溶液按含量測定方法同法測定，計算：槲皮素平均回收率=9835%，RSD=26%（n=9）、鬼臼毒素平均回收率=10025%，RSD=23%（n=9）、山柰素平均回收率=10080%，RSD=27%（n=9）。

25精密度試驗

251儀器精密度取混合對照品溶液（槲皮素00973 mg/mL、鬼臼毒素01001 mg/mL、山柰素00998 mg/mL），按照“21”項色譜條件，連續(xù)進樣6次，進樣10μL，記錄峰面積，RSD%分別為11%、12%、082%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度較好。

252重復(fù)性試驗取同一樣品按“222”項平行制備供試品6份，按照“21”項色譜條件進樣，測定結(jié)果，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素含量的RSD分別為：29%、24%、22%，表明本法具有良好的重復(fù)性（RSD3%）。

26穩(wěn)定性試驗取同一份樣品溶液，按“21”項色譜條件，分別于0、3、6、16、20h進樣，測定峰面積，槲皮素、鬼臼毒素、山柰素峰面積的RSD%（n=5）分別為：091%、079%、059%，結(jié)果表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定。

27樣品測定取12批樣品按上述供試品制備方法制備，分別精密吸取對照品溶液與供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，按上述“21”項色譜條件測定，記錄峰面積，以外標法計算樣品中槲皮素、鬼臼毒素、山柰素的含量，結(jié)果見表2。

3討論

本試驗參考了有關(guān)文獻[7-9]，對提取方法、提取溶劑、提取時間分別作單因素考察，最終確定了供試品溶液的制備方法為甲醇回流提取法。通過對三種成分的甲醇溶液進行全波長掃描，結(jié)果槲皮素、山柰素在254 nm、360 nm處有最大吸收，但鬼臼毒素的最大吸收波長為290 nm，考慮到槲皮素和山柰素的響應(yīng)值偏高，且鬼臼毒素在其他兩個波長下吸收值均不理想，故選擇290 nm為檢測波長，實驗表明該波長檢測靈敏度高，雜質(zhì)吸收峰少，干擾小，效果理想。

本研究建立了八角蓮中三個主要化學成分的高效液相色譜定量分析方法。該方法專屬性強，精密度、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，可為八角蓮質(zhì)量標準的研究及種質(zhì)資源評價建立基礎(chǔ)。

從12批不同產(chǎn)地的樣品測定結(jié)果可以看出，各地八角蓮三個成分含量存在較大差異。其中，湖北、江西、安徽等地的八角蓮樣品鬼臼毒素含量明顯高于云南、四川等地。影響藥材品質(zhì)的因素很多，主要有產(chǎn)地、采收期、加工方法等。本文收集的樣品有限，一定程度上影響了研究的深度，后續(xù)將擴大樣本量，并對其他影響因素與含量間的相關(guān)性開展更深入研究。

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