王瑞飛 +王妍 姜恬++李學梅 楊清香

摘要：以連作地黃根際土壤中的微生物為對象，篩選既能夠固氮又能夠耐受酚酸類物質的細菌，并對其進行鑒定，為克服連作障礙的菌劑開發(fā)提供菌種資源。通過阿須貝無氮培養(yǎng)基平板涂布及分離純化試驗，最終獲得菌落形態(tài)特征鮮明的2株固氮菌：7號菌菌落濕潤、邊緣光滑、個體較大，橘黃色；12號菌菌落邊緣光滑、個體較小，乳白色。耐酚酸試驗結果顯示，在125、250 mg/L對羥基苯甲酸濃度下，7號菌液的D600 nm分別是對照組的2.78、1.93倍，12號菌液的D600 nm分別是對照組的3.66、4.66倍，因此，2株固氮菌能有效耐受一定濃度的對羥基苯甲酸。生理生化分析結果顯示，2株菌均具備水解淀粉、分解丙酮酸和產(chǎn)生吲哚的能力。16S rRNA測序及遺傳進化分析結果顯示，7號菌、12號菌分別與芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus）、假單胞菌屬的地中海假單胞菌（Pseudomonas mediterranea）聚到一起，相似度均高于99%。

關鍵詞：地黃；連作障礙；固氮；耐酚酸；短小芽孢桿菌；地中海假單胞菌

中圖分類號： S182文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0229-03

連作障礙指的是同種或同類植物在同一田地連年種植所造成的植物生長受阻、病蟲害增加、質量產(chǎn)量嚴重下滑的現(xiàn)象。蔬菜、水果及中藥材等植物種植過程中都存在不同程度的連作障礙問題[1-3]。其中，藥用植物的連作障礙問題尤其突出。調查顯示，約70%的藥用植物因發(fā)生連作障礙而導致減產(chǎn)和質量下降[3]，這制約了中藥資源的開發(fā)應用及中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

地黃是一種重要的傳統(tǒng)中藥，在我國醫(yī)學藥典中占有重要的地位。它具有清熱涼血、益陰生津等功效。近年來的研究表明，地黃抽提物具有抗腫瘤、抗炎、調整機體穩(wěn)態(tài)等多重功能[4-5]，這為其臨床上的大量應用賦予了很好的科學解釋，同時，也使其蘊含巨大的經(jīng)濟價值。但是，地黃的連作障礙極為嚴重，在同一塊土地上2次種植地黃的時間間隔需達到 8～10年，否則其作為主要藥用部分的塊根將無法膨大，最終導致減產(chǎn)甚至絕收[3]。

研究表明，植物的連作障礙主要有以下3個方面的原因：酚酸類物質所導致的化感自毒作用、土壤中營養(yǎng)成分（尤其是氮、磷、鉀類）的不平衡性和不可利用性、土壤微生物生態(tài)的失衡[6]。針對以上3種原因開發(fā)相關的技術方法克服植物連作障礙是可行的。已有研究指出，單純地通過化學方法消除化感自毒作用，增加土壤養(yǎng)分并不能有效地解決連作障礙[7]。微生物菌劑往往具有多重復合功效，比如，降解土壤中的有毒有害物質，增加作物對氮、磷、鉀等元素的吸收，改善植物根際微生物群落組成，安全環(huán)保等。因此，篩選有益微生物，制備能緩解植物連作障礙的微生物菌劑已成為目前的一個研究熱點。

本研究選擇連作地黃的根際土壤，對其所含固氮微生物進行阿須貝無氮培養(yǎng)基平板分離，獲得多個細菌克隆。經(jīng)多次分離純化，最終獲得2株固氮菌，并證實這2株菌能夠耐受對羥基苯甲酸——地黃根際土壤中一種重要的一元酚酸類化感物質[8]。通過生理生化分析、16S rRNA測序及遺傳進化樹的構建，初步確定這2株菌分別屬于芽孢桿菌屬、假單胞菌屬。

1材料與方法

1.1固氮菌的分離、純化

連作地黃根際土壤，取自地黃道地產(chǎn)區(qū)河南省焦作市溫縣趙堡鎮(zhèn)。土壤樣品裝入無菌樣品袋中，放于冰盒內(nèi)帶回實驗室，保存于4 ℃冰箱內(nèi)。取10 g土壤加入裝有100 mL無菌水和無菌玻璃珠的三角瓶中，置于28 ℃、200 r/min搖床上 30 min。取100 μL土壤懸液，梯度稀釋，然后將稀釋過的菌液（80 μL）涂布在阿須貝無氮培養(yǎng)基平板上并標記，置于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱中，3 d后，選擇菌落生長狀態(tài)良好的平板，挑取菌落，進一步劃線純化。

1.2菌株的生理生化測定

淀粉水解試驗、甲基紅試驗、伏普二氏試驗（V.P試驗）、吲哚試驗均參照《微生物學實驗》進行[9]。

1.3菌株的酚酸耐受能力檢測

本研究選用酚酸類物質中的對羥基苯甲酸進行試驗，檢測其對固氮菌生長的影響。制備含不同濃度（0、125、250、500 mg/L）對羥基苯甲酸的液態(tài)阿須貝無氮培養(yǎng)基，分裝到相應標記的試管中（5 mL/支），121 ℃、20 min高壓蒸汽滅菌。然后將分離純化的固氮菌分別接入對應濃度的試管中，每個濃度設置3個平行，置于28 ℃、200 r/min的搖床上，4 d后，測定不同試管中菌液的D600 nm，評估菌株的耐受能力。

1.416S rRNA測序及分析

參考文獻[10]中的做法，提取純化菌株的DNA。采用16S rRNA 通用引物27F：5′ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 進行PCR 擴增[11]。將擴增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。利用Blast將所得16S rRNA基因序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的序列進行比對分析。通過MEGA 4.1軟件，應用鄰近（NJ）法構建系統(tǒng)進化樹，確定所得菌株的分類地位。

2結果與分析

2.1固氮菌的分離與純化

土壤樣品經(jīng)梯度稀釋并涂布于阿須貝無氮培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d后，可看到有多個菌落產(chǎn)生。挑取平板上長勢良好的18個菌落進行克隆，進行多次劃線分離純化，進一步篩選得到2株菌落形態(tài)特征鮮明的固氮菌，編號是7號和12號。其中，7號菌形成濕潤、邊緣光滑、較大的橘黃色菌落；12號菌形成邊緣光滑、較小的乳白色菌落。

2.22株固氮菌的酚酸耐受能力

對羥基苯甲酸是酚酸類物質的代表之一。為了檢測2株固氮菌的酚酸耐受能力，將2株菌分別接入加有不同濃度對羥基苯甲酸的阿須貝液體培養(yǎng)基中，4 d后測定菌液D600 nm。如圖1所示，在125、250 mg/L對羥基苯甲酸濃度下，2株固氮菌生長速度均高于對照組（0 mg/L），7號菌液的D600 nm分別是對照組的2.78、1.93倍，12號菌液的D600 nm分別是對照組的3.66、4.66倍，且7號菌在125 mg/L對羥基苯甲酸的濃度下生長情況最好，而12號菌在250 mg/L對羥基苯甲酸的濃度下生長情況最好。進一步分析發(fā)現(xiàn)，這2株菌在 500 mg/L 酚酸培養(yǎng)基中的生長速度均低于對照組。這些結果表明，在一定濃度范圍內(nèi)，對羥基苯甲酸能夠促進這2株菌生長繁殖，但是，過高濃度的對羥基苯甲酸會對這2株菌的生長繁殖造成一定程度的抑制作用。已有研究表明，一些從土壤中分離獲得的微生物，如假單胞菌、芽孢桿菌等可以利用酚酸作為碳源和能量[12]，在限制性條件下，酚酸甚至可為固氮菌提供碳源[13]。因此，7號菌和12號菌極有可能通過利用對羥基苯甲酸作為碳源完成對對羥基苯甲酸的降解進而產(chǎn)生耐受性，實現(xiàn)自身的生長繁殖。

2.32株固氮菌的生理生化分析

由圖2可知，淀粉水解試驗中，2株固氮菌都能產(chǎn)生水解圈（箭頭所指），表明它們均能不同程度地產(chǎn)生淀粉水解酶，其中7號菌產(chǎn)生能力較弱。甲基紅試驗中，2株菌在葡萄糖蛋白胨液體培養(yǎng)基中生長后，將甲基紅加入試管內(nèi)，均出現(xiàn)黃色陰性反應（箭頭所指），說明這2株菌產(chǎn)生的酸性物質較少。V.P試驗中，2株菌置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，取 2 mL 培養(yǎng)液，加入等體積的V.P試劑，充分振蕩后置于37 ℃溫箱中30 min，觀察到培養(yǎng)液變紅，均呈強陽性反應（箭頭所指），且7號菌比12號菌反應明顯，這表明2株固氮菌能將葡萄糖分解成丙酮酸并進一步脫羧、氧化生成二乙酰。吲哚試驗結果表明，2株固氮菌均能產(chǎn)生吲哚分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生紅色的玫瑰吲哚（箭頭所指），其中，12號菌產(chǎn)生能力稍弱。

2.4菌株的16S rRNA基因測序及遺傳進化關系分析

為了進一步確定這2株菌的分類地位，采用16S rRNA 通用引物進行PCR 擴增和測序，所得結果在EzBioCloud數(shù)據(jù)庫進行Blast比對，并利用MEGA 4.1構建系統(tǒng)發(fā)育樹對2株菌與序列同源性菌株的親緣關系進行分析。Blast比對結果顯示，12號菌與假單胞菌屬的地中海假單胞菌（P.mediterranea）的相似度達到99.56%，7號菌與芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌（B.pumilus）的相似度達到99.78%。由圖3可知，12號菌與假單胞菌屬的地中海假單胞菌（P.mediterranea）聚到一起，兩者具有密切的親緣關系；7號菌與芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌（B.pumilus）聚到一起，兩者具有密切的親緣關系。

3結論與討論

地黃作為一種傳統(tǒng)的中藥材，具有很高的經(jīng)濟效益，但是卻存在嚴重的連作障礙。一個普遍的觀點是：酚酸類物質所導致的化感自毒作用、土壤中營養(yǎng)成分（尤其是氮、磷、鉀）的不平衡性和不可利用性、土壤微生物生態(tài)的失衡是植物連作障礙的3個最關鍵因素。本研究從連作地黃土壤中篩選獲得了2株既具有固氮能力又具有耐酚酸特性的高活性菌株，它們[CM（25]分別與芽孢桿菌屬的短小芽孢桿菌、假單胞菌屬的地中海

[FL（2K2]假單胞菌具有極為密切的親緣關系。

Lise等于2000年的報道中顯示，短小芽孢桿菌具有降解酚酸類物質的fdc基因[14]。最新的研究顯示，短小芽孢桿菌菌株S1r1能夠通過固氮及參與氮的重吸收，提高玉米的產(chǎn)量和質量[15]。假單胞菌屬的地中海假單胞菌是2002年被報道的1個新種，目前，其在降解酚酸類物質及固氮方面的研究尚未見報道。盡管如此，假單胞菌屬被認為普遍存在于自然界中，具有多種代謝功能，是多種污染物（如酚酸和多環(huán)芳烴類）降解的關鍵微生物[16]。Narbad等早在1998年就報道來自土壤中的熒光假單胞菌（P.fluorescens）菌株AN103具有一系列的酶系統(tǒng)能夠對酚酸物質中的阿魏酸進行側鏈剪切，從而以阿魏酸作為唯一碳源進行生長[17]。另外，燕永亮等報道，假單胞菌屬中的斯氏假單胞菌（P.stutzeri）具有固氮酶基因，能夠固定氮氣為植物可利用的氨[18]。因此，12號菌株可能同時具有酚酸類物質降解基因和固氮酶基因?？紤]到篩選所得的7號菌和12號菌所兼有的固氮和耐酚酸能力，以兩者為基礎研發(fā)的微生物菌劑將有助于改善土壤肥力，維持健康的土壤菌落組成，對于緩解地黃以及其他植物的連作障礙具有潛在的應用價值。

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