田連生+陳菲

摘要：為提高木霉菌可濕性粉劑防效和藥效速度，對(duì)影響木霉分生孢子萌發(fā)的不同因子進(jìn)行研究。結(jié)果表明，蛋白胨、酵母粉和乳糖、蔗糖等對(duì)木霉孢子萌發(fā)均有顯著的促進(jìn)作用，溫度25～30 ℃、pH值 4～6和飽和濕度環(huán)境是孢子萌發(fā)的適宜條件。木霉孢子在水中萌發(fā)率很低，光照對(duì)孢子萌發(fā)無(wú)顯著影響；孢子萌發(fā)率和萌發(fā)速率是影響木霉可濕性粉劑生防效果和藥效速度的主要原因。室內(nèi)離體防效試驗(yàn)結(jié)果也證明，添加0.4%蛋白胨和乳糖，調(diào)節(jié)pH值至5，3 d時(shí)對(duì)黃瓜灰霉病防效可達(dá)85.6%，而未作處理的藥液7 d防效才達(dá)84.2%。本研究結(jié)果也對(duì)該產(chǎn)品的生產(chǎn)和田間應(yīng)用提出了改進(jìn)建議。

關(guān)鍵詞：木霉菌；分生孢子；萌發(fā)條件；萌發(fā)率；可濕性粉劑；影響因子；生防效果；室內(nèi)離體防效

中圖分類(lèi)號(hào)： S476文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）10-0097-03

生物農(nóng)藥特別是活體生物農(nóng)藥對(duì)農(nóng)作物病害的防治作用，除與其代謝產(chǎn)物有關(guān)外，還與活體微生物的生物學(xué)特性有更加密切的關(guān)系。一般生物農(nóng)藥具有藥效緩慢、易受環(huán)境因素制約、防效不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，這些都不利于活體微生物農(nóng)藥的使用和推廣。木霉菌（Thichoderma spp.）由于具有多重的生防機(jī)制和良好的防治效果越來(lái)越受到人們的重視。目前，已有商業(yè)化產(chǎn)品——木霉菌可濕性粉劑出售。木霉分生孢子為木霉可濕性粉劑的有效成分，其孢子生物學(xué)特性及孢子萌發(fā)條件是影響木霉菌發(fā)揮其生防作用的首要條件。因?yàn)槟久咕鷮?duì)植物病原菌的生防機(jī)制主要是競(jìng)爭(zhēng)、重寄生和抗生素作用[1-5]。而前2個(gè)影響因子均與木霉分生孢子萌發(fā)有著密切關(guān)系。因此，研究木霉分生孢子萌發(fā)相關(guān)影響因子[6-8]，提高其孢子萌發(fā)率和萌發(fā)速度，就可提高木霉菌可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。本研究結(jié)果無(wú)論是對(duì)廠家生產(chǎn)產(chǎn)品，還是農(nóng)民在田間應(yīng)用該生物農(nóng)藥防治農(nóng)作物病害均具有重要的指導(dǎo)意義。

1材料與方法

1.1供試材料

木霉菌可濕性粉劑（2億個(gè)/g），山東泰諾藥業(yè)有限公司；50%多菌靈可濕性粉劑，日本住友化學(xué)株式會(huì)社；灰葡萄孢菌（Botrytis cinera），由筆者所在實(shí)驗(yàn)室從感染灰霉病的黃瓜上分離、純化得到。

1.2不同氮源對(duì)孢子萌發(fā)的影響

將一定量的木霉菌可濕性粉劑加入0.4%蛋白胨、酵母浸出粉、牛肉浸膏等有機(jī)氮源溶液中，制成100萬(wàn)個(gè)/mL孢子懸浮液；以同樣方法配制NH4NO3、（NH4）2SO4等無(wú)機(jī)氮源的孢子懸浮液。分別取上述懸浮液0.05 mL滴于載玻片上，置于28 ℃恒溫箱中保濕培養(yǎng)12、24 h，觀察分生孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次，計(jì)算孢子萌發(fā)率，同時(shí)用無(wú)菌水制成相同濃度的孢子懸浮液作空白對(duì)照。孢子萌發(fā)率=萌發(fā)孢子平均數(shù)/（ 萌發(fā)孢子平均數(shù)+未萌發(fā)孢子平均數(shù)）×100%。

1.3不同碳源對(duì)孢子萌發(fā)的影響

將木霉可濕性粉劑分別用0.4%葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖和可溶性淀粉溶液稀釋成100萬(wàn)個(gè)/mL孢子懸浮液。按“1.2”節(jié)方法進(jìn)行處理，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

[HTK]1.4溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響[HT]

取一定量木霉可濕性粉劑，分別用0.4%蛋白胨溶液和無(wú)菌水稀釋為含孢子濃度100萬(wàn)個(gè)/mL的懸浮液，各取 0.05 mL 滴于萌發(fā)載玻片上，分別置于10、20、25、28、30、40 ℃ 不同溫度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，鏡檢孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.5相對(duì)濕度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

將木霉可濕性粉劑用0.4%蛋白胨溶液配制成孢子濃度為100萬(wàn)個(gè)/mL 懸浮液，取 0.05 mL滴于載玻片上快速風(fēng)干，置于人工氣候箱中，分別在80%、90%、95%、100%相對(duì)濕度下作孢子萌發(fā)試驗(yàn)，每處理重復(fù)3次，培養(yǎng)24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.6pH值對(duì)孢子萌發(fā)的影響

取木霉菌可濕性粉劑，用0.4%蛋白胨溶液稀釋為100萬(wàn)個(gè)/mL 懸浮液，用0.1 mol/L NaOH或0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)溶液pH值分別為2、3、4、5、6、7、8、9，各取 0.05 mL溶液滴于載玻片上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，24 h后鏡檢孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次，計(jì)算孢子萌發(fā)率。

1.7光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響

用0.4%蛋白胨作營(yíng)養(yǎng)液制成100萬(wàn)個(gè)/mL木霉孢子懸浮液，取 0.05 mL滴于載玻片上，在光照和黑暗條件下于 28 ℃ 恒溫培養(yǎng)24 h，鏡檢孢子萌發(fā)情況，每處理重復(fù)3次。

[HTK]1.8室內(nèi)離體防效測(cè)定[HT]

采用離體葉片法[9]測(cè)定防效。選取健康無(wú)病的黃瓜葉片，剪下后用無(wú)菌水反復(fù)沖洗，先噴濃度為0.1億個(gè)/mL的灰霉菌孢子懸浮液，保溫培養(yǎng)1 d后再?lài)夾（用0.4%蛋白胨和乳糖溶液把木霉可濕性粉劑稀釋成500倍液，并用0.1 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值到5）、B（用無(wú)菌水把木霉可濕性粉劑稀釋成500倍液）、C（用等量無(wú)菌水作空白對(duì)照）3個(gè)處理藥液；葉柄用脫脂棉纏繞，滴加0.5%葡萄糖無(wú)菌液，置于培養(yǎng)皿內(nèi)，于25 ℃下保溫保濕培養(yǎng)；每個(gè)處理10張葉片，重復(fù)3次，分別在培養(yǎng)后3、7 d調(diào)查葉片病情指數(shù)，并計(jì)算防治效果。其中病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)：0級(jí)，無(wú)病斑；1級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的5%以下；2級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的 6%～10%；3級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的11%～25%；4級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的26%～50%；5級(jí)，病斑面積占整個(gè)葉面積的50%以上。病情指數(shù)=100×∑（各級(jí)病葉數(shù)×相應(yīng)級(jí)數(shù)）/（調(diào)查總?cè)~數(shù)×最高級(jí)級(jí)數(shù)）；防治效果=（對(duì)照病情指數(shù)-用藥病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100%。

2結(jié)果與分析

2.1不同氮源對(duì)孢子萌發(fā)的影響

由圖1可見(jiàn)，有機(jī)氮源對(duì)木霉分生孢子萌發(fā)促進(jìn)作用明顯，在蛋白胨溶液中培養(yǎng)后12 h，萌發(fā)率即可達(dá)到87.56%；培養(yǎng)后24 h，達(dá)88.62%，在牛肉膏和酵母粉溶液中培養(yǎng)也達(dá)到75.2%和79.1%。而無(wú)機(jī)氮源促進(jìn)作用較弱，只有（NH4）2SO4溶液中達(dá)到46.6%，NH4NO3達(dá)到30.5%。說(shuō)明有機(jī)氮源對(duì)孢子萌發(fā)有明顯的促進(jìn)作用。木霉分生孢子在水中培養(yǎng)12 h沒(méi)有萌發(fā)，培養(yǎng)24 h也只有15.3%，培養(yǎng)后 152 h 萌發(fā)率僅達(dá)到80%。由此可見(jiàn)，木霉孢子在純水中萌發(fā)率低，萌發(fā)速度慢，這也是導(dǎo)致其藥效緩慢的主要原因。

2.2不同碳源對(duì)孢子萌發(fā)的影響

碳源對(duì)木霉孢子萌發(fā)促進(jìn)的作用不如氮源明顯。由圖2

可知，乳糖對(duì)孢子萌發(fā)促進(jìn)作用較大，培養(yǎng)后24 h，萌發(fā)率達(dá)到32.8%；蔗糖次之，為27.9%；麥芽糖和葡萄糖對(duì)孢子萌發(fā)促進(jìn)作用較小，萌發(fā)率分別為19.6%和16.7%；可溶性淀粉則對(duì)孢子萌發(fā)基本無(wú)促進(jìn)作用。木霉孢子在無(wú)菌水中培養(yǎng)12 h未萌發(fā)，培養(yǎng)24 h萌發(fā)率只有15.5%。

2.3溫度對(duì)孢子萌發(fā)的影響

溫度對(duì)木霉孢子萌發(fā)作用明顯。由表1可以看出，木霉孢子在10～40 ℃均可萌發(fā)。開(kāi)始時(shí)，隨著溫度升高，孢子萌發(fā)率逐漸升高；但28 ℃后，孢子萌發(fā)率呈下降趨勢(shì)?？梢?jiàn)孢子萌發(fā)適宜溫度為25～30 ℃，在此溫度條件下孢子萌發(fā)率較高，且芽管生長(zhǎng)旺盛。而在無(wú)菌水中的孢子萌發(fā)率均較低。

木霉孢子萌發(fā)需要高濕環(huán)境。由圖3可見(jiàn)，木霉孢子在相對(duì)濕度為80%的條件下培養(yǎng)24 h不萌發(fā)；相對(duì)濕度為90%時(shí)，孢子萌發(fā)率達(dá)到13%；相對(duì)濕度為95%時(shí)，萌發(fā)率為55.2%；而在液滴中孢子萌發(fā)率高達(dá)88.8%。表明木霉分生孢子萌發(fā)率與相對(duì)濕度呈正相關(guān)性。

2.5pH值對(duì)孢子萌發(fā)的影響

pH值對(duì)孢子萌發(fā)作用明顯（圖4），pH值為2～9范圍內(nèi)，木霉孢子均能萌發(fā)，其中以pH值為5時(shí)萌發(fā)率最高，24 h

達(dá)到87.8%；適宜pH值為4～6，萌發(fā)率均達(dá)到80%以上。而當(dāng)pH值<3或>7時(shí)，萌發(fā)率則明顯下降。說(shuō)明木霉孢子在弱酸性條件下萌發(fā)較好，而堿性或強(qiáng)酸性時(shí)均不適于孢子萌發(fā)。

2.6光照對(duì)孢子萌發(fā)的影響

連續(xù)光照24 h后，木霉孢子萌發(fā)率為87.1%；避光黑暗處理24 h后，萌發(fā)率為86.7%，2個(gè)處理無(wú)明顯區(qū)別，說(shuō)明光照對(duì)木霉孢子萌發(fā)沒(méi)有明顯作用。

2.7室內(nèi)離體防效試驗(yàn)

由室內(nèi)防治效果（表2）可以看出，碳源、氮源的加入與適宜的pH值確實(shí)可以提高木霉可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。培養(yǎng)3 d時(shí)，A處理的防治效果已達(dá)到85.6%，與培養(yǎng)7 d的防效比較接近；而B(niǎo)處理在培養(yǎng)3 d時(shí)的防效只有677%，培養(yǎng)7 d時(shí)也只達(dá)到84.2%。進(jìn)一步驗(yàn)證了添加少量的氮源、碳源和調(diào)整藥液適宜pH值，可提高木霉可濕性粉劑的防治效果和藥效速度。

3討論與結(jié)論

本試驗(yàn)就氮源、碳源、溫度、pH值、相對(duì)濕度和光照6個(gè)因素對(duì)木霉分生孢子萌發(fā)的影響進(jìn)行研究，結(jié)果表明，有機(jī)氮源蛋白胨、牛肉膏和酵母粉等對(duì)孢子萌發(fā)有較好的促進(jìn)作用，而無(wú)機(jī)氮源作用不大；碳源及光照對(duì)木霉孢子萌發(fā)促進(jìn)作用不明顯；適宜溫度為25～30 ℃、pH值為4～6，這與木霉屬的菌落生長(zhǎng)特性相一致。試驗(yàn)結(jié)果與高克祥等的研究結(jié)論[6-7]基本一致。為了進(jìn)一步驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果，本研究還通過(guò)室內(nèi)離體防效試驗(yàn)，在配制木霉可濕性粉劑藥液時(shí)添加04%蛋白胨和乳糖，并調(diào)pH值至5，對(duì)黃瓜灰霉病的防效和作用速度明顯優(yōu)于純水配制的藥效。為了增加活體生物農(nóng)藥的藥效速度、提高防治效果，生產(chǎn)廠家在配制產(chǎn)品以及農(nóng)民在使用木霉菌劑時(shí)應(yīng)注意以下幾點(diǎn)。

3.1合理添加碳氮元素

根據(jù)“2.1”“2.2”“2.5”節(jié)試驗(yàn)結(jié)果，廠家在配制產(chǎn)品時(shí)可添加少量蛋白胨粉或酵母粉和蔗糖等物質(zhì)，在不影響農(nóng)藥質(zhì)量前提下，盡量選擇酸性助劑；農(nóng)民在噴施木霉可濕性粉劑時(shí)，也可在水中添加少量硫酸銨、蔗糖等，還可加少量食醋降低藥液pH值。

3.2選擇施藥時(shí)間

根據(jù)“2.3”“2.4”“2.6”節(jié)試驗(yàn)結(jié)果，在春秋季節(jié)噴施農(nóng)藥時(shí)應(yīng)選擇在氣溫較高的中午進(jìn)行，這樣夜里相對(duì)濕度大，從而有利于孢子萌發(fā)；但夏季中午溫度較高，藥液很容易被蒸發(fā)而減少相對(duì)濕度，所以應(yīng)在16：00后或陰天時(shí)進(jìn)行噴施；在冬季溫室大棚中使用時(shí)，中午施藥不但棚內(nèi)溫度高，相對(duì)濕度也大，更利于木霉孢子萌發(fā)?？傊瑧?yīng)根據(jù)季節(jié)和天氣情況選擇適宜的時(shí)間施藥，才能提高藥效，減少環(huán)境因素對(duì)活體生物農(nóng)藥的藥效影響。

木霉菌可濕性粉劑是活體生防菌劑，研究其分生孢子萌發(fā)的影響因子，對(duì)生產(chǎn)廠家配制藥劑和農(nóng)民田間應(yīng)用都具有重要的指導(dǎo)意義。有關(guān)木霉可濕性粉劑在植物病害防治的微生態(tài)環(huán)境及其分生孢子萌發(fā)和在植物葉面上的定殖條件等影響因子，都有待進(jìn)一步深入研究。

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