安曼云 焦麗麗 伊煒 崔立華

摘要：采用微生物篩選培養(yǎng)和酶學(xué)方法，研究了云南松毛蟲腸道內(nèi)產(chǎn)脂肪酶菌群及產(chǎn)酶特性，為松毛蟲的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，從云南松毛蟲幼蟲腸道內(nèi)共分離篩選獲得193株產(chǎn)脂肪酶的菌株，涉及3個(gè)菌屬：82株假單胞菌屬（Pseudomonas）、67株芽孢桿菌屬（Bacillus）和44株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）；其中，假單胞菌屬為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)量的42.49%；供試的9株菌株表現(xiàn)出不同的產(chǎn)脂肪酶活性，并從中篩選得到了1株高產(chǎn)脂肪酶菌株P(guān)-50，最適作用溫度為35 ℃，pH值為8，經(jīng)發(fā)酵至60 h時(shí)生長量達(dá)到最大，在48 h左右時(shí)酶活性達(dá)到最高；P-50初步確定為中溫產(chǎn)堿性脂肪酶菌。

關(guān)鍵詞：云南松毛蟲；產(chǎn)脂肪酶菌；酶活性；假單胞菌屬

中圖分類號： Q814文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0093-03

近年來，隨著胃腸道微生態(tài)理論的深入研究，有關(guān)昆蟲腸道微生物的研究已成為新熱點(diǎn)[1-2]。脂肪酶是一類特殊酯鍵水解酶，廣泛存在于動植物組織微生物體中，其中發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)脂肪酶的細(xì)菌約有28個(gè)屬[3-4]。目前，已在多種昆蟲腸道中發(fā)現(xiàn)各類產(chǎn)酶菌群，并對酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究，昆蟲腸道中存在不同功能的菌群[5-8]。由于微生物脂肪酶作用的溫度和pH值范圍比動植物脂肪酶的更寬，易獲得較高純度酶制劑，適合于工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)[9-10]。因此，不斷篩選出具有新特性和高活性的脂肪酶是一項(xiàng)非常有意義的工作。

云南松毛蟲（Dendrolimus houi Lajonquiere）屬鱗翅目（Lepidoptera）枯葉蛾科（Lasiocampidae），是林業(yè)的重大害蟲之一，但是從營養(yǎng)學(xué)和資源學(xué)的角度來看，它又具有極大的開發(fā)利用價(jià)值[11-12]。目前國內(nèi)外對松毛蟲的研究主要集中在防治方面，且在相關(guān)產(chǎn)酶微生物資源研究時(shí)，多從土壤、淤泥中分離篩選，但對松毛蟲的利用以及腸道微生物的研究報(bào)道較少[13]。由于松毛蟲長期食用多種松類針葉，對松油脂有著特殊的消化體系，可能腸道內(nèi)存在著特殊的微生物菌群資源[14-15]。因此，本研究擬以云南松毛蟲為試驗(yàn)材料，研究松毛蟲腸道內(nèi)產(chǎn)脂肪酶菌株及酶學(xué)特性，為松毛蟲的綜合利用及產(chǎn)脂肪酶微生物新資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1云南松毛蟲

采自云南省楚雄州永仁縣云南松母樹林，共計(jì)60只幼蟲。

1.1.2培養(yǎng)基

試驗(yàn)培養(yǎng)基名稱及配方[16]。分離培養(yǎng)基：肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂15.0 g/L，pH值=7.0；脂肪酶篩選培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨 10.0 g/L、橄欖油20.0 mL、瓊脂15.0 g/L，pH值=7.0；活化培養(yǎng)基：牛肉膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、橄欖油20.0 mL、瓊脂15.0 g/L，pH值=7.0；高產(chǎn)脂肪酶菌株篩選培養(yǎng)液：酵母膏5.0 g/L、（NH4）2SO4 5.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、橄欖油20.0 mL、云南松節(jié)油 20 mL，pH值=7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母膏5.0 g/L、（NH4）2SO4 5.0 g/L、K2HPO4 2.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 3.0 g/L、云南松節(jié)油20 mL，pH值=8.0。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)脂肪酶菌株的分離篩選及分子鑒定

用無菌水飼養(yǎng)云南松毛蟲1 d后，解剖蟲體取其腸道，經(jīng)研磨、稀釋后涂布于分離培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h。挑取形態(tài)各異的純菌落接種到脂肪酶篩選培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，篩選能產(chǎn)生透明圈的菌株。對菌株進(jìn)行DNA提取[細(xì)菌DNA提取試劑盒，生工生物工程（上海）股份有限公司]，采用16S rDNA通用引物進(jìn)行16S rDNA序列的擴(kuò)增和測序分析。計(jì)算分離率及分離頻率。

[JZ]分離頻率=a/b×100%。

式中：a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數(shù)量，株；b為分離的真菌菌株數(shù)量，株。

[JZ]分離率=a/c×100%。

式中：a為分離到的某一指定類型真菌的菌株數(shù)量，株；c為分離樣品總數(shù)，60只。

1.2.2高產(chǎn)脂肪酶菌株篩選

從假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、克雷伯氏菌3個(gè)菌屬中分別選取3株供試菌株篩選高產(chǎn)脂肪酶，分別為P-13、P-50、P-106；P-03、P-19、P-154；P-06、P-28、P-67。將這9株供試菌株分別接種于高產(chǎn)脂肪酶菌株篩選培養(yǎng)液中培養(yǎng)（以云南松節(jié)油為底物，橄欖油作對照底物），48 h后測定脂肪酶活性（采用醋酸銅比色法[17]）。

1.2.3高產(chǎn)菌株酶解特性、生長量、產(chǎn)酶特性確定

設(shè)置5個(gè)反應(yīng)溫度梯度（25、30、35、40、45 ℃）和5個(gè)pH值梯度（50、6.0、7.0、8.0、9.0）測定酶活性，確定最適溫度以及在最適溫度下的最適pH值。將高產(chǎn)脂肪酶菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后每隔12 h測定菌株生長量及酶活性。

2結(jié)果與分析

2.1云南松毛蟲腸道中產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

從云南松毛蟲幼蟲腸道內(nèi)共分離篩選獲得193株產(chǎn)脂肪酶的菌株，涉及3個(gè)菌屬：82株假單胞菌屬（Pseudomonas）、67株芽孢桿菌屬（Bacillus）和44株克雷伯氏菌屬（Klebsiella）（表1）。產(chǎn)脂酶菌在云南松毛蟲腸道中的分離率較高，最低的為73.33%，說明云南松毛蟲腸道中存在有大量的產(chǎn)脂酶菌群。在這3個(gè)菌屬中，假單胞菌屬為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)量的42.49%；克雷伯氏菌屬最少，為22.80%。

2.2云南松毛蟲腸道中高產(chǎn)脂肪酶菌株的篩選

9株產(chǎn)脂肪酶菌株對橄欖油和云南松節(jié)油2種底物的水解活性不同。由圖1可知，當(dāng)以松節(jié)油為底物時(shí)的酶活性大于對照橄欖油為底物時(shí)的酶活性（菌株P(guān)-154除外），菌株 P-154的酶活性表現(xiàn)最低，而且偏向于底物橄欖油。以松節(jié)油為底物時(shí)，云南松毛蟲腸道中產(chǎn)脂肪酶菌群的酶活性表現(xiàn)為假單胞菌屬（酶活性平均值4.80 U/mL）>克雷伯氏菌屬（2.94 U/mL）>芽孢桿菌屬（2.65 U/mL），其中假單胞菌屬中菌株P(guān)-50的酶活性最大，為5.06 U/mL，初步確定為高產(chǎn)脂肪酶菌株。

2.3高產(chǎn)脂肪酶菌株酶學(xué)性質(zhì)分析

由圖2可知，P-50的最適宜溫度為35 ℃，其酶活性達(dá)4.7 U/mL（圖2-a）。在最適溫度35 ℃條件下，P-50的最適pH值為8時(shí)，酶活性達(dá)到最大值（圖2-b），說明菌株 P-50 為中溫產(chǎn)堿性脂肪酶菌。

2.4高產(chǎn)脂肪酶菌株生長及產(chǎn)酶特性

以D600 nm值來衡量菌株P(guān)-50的生長量，P-50的生長量是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而增加，當(dāng)培養(yǎng)60 h左右時(shí)，生長量達(dá)到最大值，隨后不再增加（圖3-a）。而在P-50生長對數(shù)時(shí)期，培養(yǎng)48 h時(shí)P-50表現(xiàn)出較高的酶活性，為 5.8 U/mL，隨后緩慢下降（圖3-b）。

3結(jié)論與討論

昆蟲腸道中蘊(yùn)含豐富的微生物資源，從中篩選出具有新特性和高活性的脂肪酶是一項(xiàng)非常有意義的工作。本研究首次從云南松毛蟲幼蟲腸道內(nèi)共分離獲得193株產(chǎn)脂肪酶的菌株，涉及3個(gè)菌屬：假單胞菌屬、芽孢桿菌屬和克雷伯氏菌屬，其中假單胞菌屬為優(yōu)勢菌群，占總菌株數(shù)量的42.49%。結(jié)果表明，長期寄生于松毛蟲腸道中的產(chǎn)脂酶菌群種類豐富多樣，為脂肪酶菌資源的開發(fā)利用提供了新的來源途徑。目前，生產(chǎn)上常見的產(chǎn)脂肪酶菌株主要有假單胞菌屬、芽孢桿菌屬、

[FL（2K2]無色桿菌屬（Photorhabdus）、色桿菌屬（Chromobacterium）和產(chǎn)堿菌屬（Alcaligenes）5個(gè)菌屬[3]。本研究中分離的假單胞菌屬和芽胞桿菌屬為常見菌屬，已在多種昆蟲[桑天牛（Apripona germari）、白蟻（Tsaitermes ampliceps）、蝗蟲（Atractomorpha sinensis）]中分離獲得，但分離得到的克雷伯氏菌屬的菌株研究還較少，有待進(jìn)一步研究。

云南松毛蟲腸道中產(chǎn)脂肪酶菌群的酶活性表現(xiàn)不同，從中篩選得到了1株高產(chǎn)脂肪酶菌株P(guān)-50，屬于假單胞菌屬。以松節(jié)油為專一底物時(shí)，該菌株表現(xiàn)出較高的脂肪酶活性，并初步確定為中溫產(chǎn)堿性脂肪酶菌（最適作用溫度為35 ℃，最適pH值為8）這與鱗翅目昆蟲堿性腸道（pH值為8.0～100）環(huán)境相關(guān)聯(lián)。然而，P-50與已有高產(chǎn)酶菌株的酶活性相比還有很大的差距，有待進(jìn)一步研究。

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