侯維海+王建林+旦巴+胡單

摘要：依據(jù)已公布的蕎麥轉(zhuǎn)錄組測序信息，從Contig文庫中獲得了1個碳酸酐酶（carbonic anhydrase，簡稱CA）轉(zhuǎn)錄本，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）擴增得到CA基因全長序列。生物信息學(xué)分析表明，基因全長1 233 bp，開放閱讀框978 bp，編碼325個氨基酸；分子量35.11 ku，等電點7.59；包含9個α-螺旋、6個β-折疊、多個無規(guī)則卷曲和延伸鏈；含有1個信號肽和1個跨膜區(qū)；具有β-類碳酸酐酶典型的2個氨基酸保守域。亞細胞定位顯示，該蛋白出現(xiàn)在葉綠體中的可能性最大。利用同源建模法構(gòu)建了FsCA1三維結(jié)構(gòu)模型，表明甜蕎CA與豌豆CA同型八聚體能很好地匹配，推測甜蕎CA也是同型八聚體。用實時熒光定量PCR檢測在蕎麥不同器官中的表達水平，結(jié)果顯示，[WTBX][STBX]FsCA1[WTBZ][STBZ] 在葉中表達水平最高，其次是在莖中，在根中表達水平最低。

關(guān)鍵詞：西藏甜蕎；碳酸酐酶；基因；三維結(jié)構(gòu)預(yù)測；生物信息學(xué)

中圖分類號： S188文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）10-0020-04[HS）][HT9.SS]

碳酸酐酶（carbonic anhydrase，簡稱CA，EC4.2.1.1）是一類含鋅的金屬酶，廣泛存在于動物、植物等有機體的組織和器官中[1]。植物中CAs至少包括5個基因家族（α、β、γ、δ和ε），主要分布在綠色組織中，可逆地催化CO2的水合反應(yīng)，產(chǎn)生HCO-3和H+，參與植物光合CO2的固定、CO2轉(zhuǎn)運、呼吸作用、離子交換等生理過程[2-3]。CA能加快CO2在細胞內(nèi)的水合速度，有助于CO2運輸?shù)交钴S的光合細胞中，從而提高光合速率；同時，CA活性隨著葉綠素含量、鋅含量增加而增強，具有明顯提高光合作用的能力，在一定程度上CA活性與光合作用呈正相關(guān)[4-6]。近年來，前人對植物CA的研究主要涉及生理生化作用和酶學(xué)特性，而對編碼該酶基因的組成、結(jié)構(gòu)和功能等尚未形成統(tǒng)一認識；現(xiàn)有研究僅限于少數(shù)幾種植物，如擬南芥（Arabidopsis thaliana）[4，7]、黃頂菊（Flaveria）[8]、玉米（Zea mays）[2]、龍眼（Dimocarpus longan Lour）[9]等，尚未見關(guān)于蕎麥CA基因克隆和表達分析的報道。在高等植物中CA主要有3類，即α-CA、β-CA和γ-CA，各種類型之間氨基酸序列保守性較低，同時每個亞基因家族又包含多個成員，其成員亞細胞定位有較大差異。例如，擬南芥β-CA基因家族有6個成員（[WTBX][STBX]β-CA1～β-CA6），其中β-CA1、β-CA5定位于葉綠體中，β-CA2、β-CA3、β-CA4定位于細胞質(zhì)中，β-CA6[WTBZ][STBZ]定位于線粒體中[4-5，10-11]；在黃頂菊屬（Flaveria）中，C3類F. pringlei、C4類F. bidentis的葉片中均分離到3個不同的[WTBX][STBX]β-CA單體（βCA1～βCA3[WTBZ][STBZ]），這些成員基因之間的序列相似性或保守性超過90%。CA基因的功能驗證在模式植物擬南芥上已取得進展，以β-CA基因家族的研究較為深入。有研究發(fā)現(xiàn)，[WTBX][STBX]Atβ-CA1[WTBZ][STBZ]編碼蛋白可發(fā)生巰基亞硝酸化，降低與水楊酸結(jié)合的能力，進而影響CA活性，其表達豐度與擬南芥幼苗存活率相關(guān)[12-13]；同時Atβ-CA1、Atβ-CA4參與調(diào)控保衛(wèi)細胞氣孔運動，是保衛(wèi)細胞氣孔運動的上游調(diào)節(jié)因子[14]。但是，關(guān)于其他β-CA的功能目前還不清楚[10]。總體而言，在C3植物中，β-CA主要分布在葉綠體葉肉細胞的基質(zhì)中[7]，可能參與協(xié)助CO2從葉綠體被膜擴散或者催化HCO-3快速脫水形成CO2；質(zhì)粒中也存在β-CA，可能與氣孔的關(guān)閉、脂類合成和抗病性有關(guān)[12，15-17]。

甜蕎屬蓼科（Polygonaceae）蕎麥屬（Fagopyrum），是一種重要的雜糧兼藥用植物。隨著市場上對蕎麥需求量的增加，蕎麥育種研究顯得愈發(fā)重要。蕎麥起源于西藏地區(qū)，該區(qū)是世界蕎麥的起源中心之一[18]，屬于低緯度高海拔農(nóng)業(yè)區(qū)，具有全球最典型的立體生境，其地質(zhì)獨特，地形地貌復(fù)雜，土壤種類繁多，生態(tài)環(huán)境千差萬別，產(chǎn)生了豐富的蕎麥變異類型，具有區(qū)域獨特的蕎麥種質(zhì)。本研究擬以西藏林芝市郊區(qū)野生甜蕎為材料，根據(jù)已公布的甜蕎轉(zhuǎn)錄組Contig文庫中篩選出的碳酸酐酶轉(zhuǎn)錄本信息，設(shè)計CA基因的特異引物，通過逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）獲得蕎麥CA基因全長序列，并進行生物學(xué)信息分析，初步明確蕎麥CA基因的結(jié)構(gòu)和表達特點，為蕎麥抗逆品種的選育提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料及其總RNA提取

甜蕎種子于2013年10月在西藏林芝市章麥村（地理位置29°50′N、93°25′E，海拔3 000 m）野外收集，次年4月初，將收集的野生甜蕎種子散播種植于西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院試驗田內(nèi)，除人工除草、澆水外，均在自然條件下生長。在蕎麥5葉期，選取5株健壯植株的幼嫩葉片，作為提取RNA的試驗材料。選取材料均設(shè)3次重復(fù)，用清水沖洗5～8次，然后再用吸水紙輕輕吸去水分，立刻置于液氮中速凍，-80 ℃保存?zhèn)溆?。[JP]

取新鮮幼葉3.0 g，在液氮保護中快速研磨成粉末狀，然后按照TRIzol試劑盒（北京康為世紀生物科技有限公司）說明書介紹的方法提取總RNA，用DNaseⅠ去除RNA中的痕量DNA。用1%瓊脂糖凝膠檢測總RNA的完整性，紫外分光光度計分析其濃度、純度。

1.2基因全長序列的克隆

測序結(jié)果經(jīng)NCBI網(wǎng)站（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）進行BLAST比對和開放閱讀框（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）分析，用DNAMAN軟件進行同源核苷酸和氨基酸序列多重比對分析，確定克隆序列為[WTBX][STBX]β-CA1[WTBZ][STBZ]。利用在線工具ExPASy Proteomics Server（http：//www.expasy.org）預(yù)測編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)，用Psipred Server、SWISS-MODEL （http：//swissmodel.expasy.org）分別對編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)進行預(yù)測和三級結(jié)構(gòu)建模。用Scan Prosite（http：//prosite.expasy.org/scanprosite）在線工具預(yù)測FsCA1編碼蛋白的motif保守序列，并用Signal P4.0 （http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）預(yù)測蛋白定位信號。用WOLF PSORT （http：//wolfpsort.org）對FsCA1進行亞細胞定位，用TMHMM Server v. 2.0軟件（http：//www.ch.embnet.org/software/TMPRED_form.html）預(yù)測跨膜區(qū)。用Clustalx、MEGA5.1[JP]構(gòu)建鄰接（Neighbor-Joining）系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.4蕎麥不同器官中實時定量PCR分析

在蕎麥開花期，選取葉片、主莖和主根作為試驗材料，按照“1.2”節(jié)的cDNA第1鏈合成法分別獲得葉片、主莖和主根cDNA第1鏈，將3種器官的cDNA溶液按倍比稀釋成相同濃度，再按SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒說明書操作方法，在CFX-96 PCR儀（Bio-Rad）上進行qRT-RCR反應(yīng)，每個樣品至少重復(fù)3次。反應(yīng)體系20 μL，含10 μL 2×PrimeScript buffer，各1 μL 10 μmol上、下游引物，10 ng cDNA模板。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 30 s；94 ℃ 15 s，退火溫度56～95 ℃，每個循環(huán)增加0.5 ℃，持續(xù)20 s，72 ℃延伸15 s，40個循環(huán)。延伸階段搜集信號，持續(xù)0.05 s獲得解鏈溫度，采集熔解曲線熒光信號。程序運行結(jié)束后，系統(tǒng)自帶的CFX管理軟件根據(jù)設(shè)定的參數(shù)給出結(jié)果。qRT-RCR擴增片段長度均為150 bp。以三磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）為內(nèi)參基因（表1），以葉片中的表達量為對照。

2結(jié)果與分析

[HTK]2.1全長基因的獲得[HT]

測序結(jié)果表明，目的基因長1 233 bp，是正確的CA基因序列。ORF finder預(yù)測發(fā)現(xiàn)，該序列具有完整的開放閱讀框（ORF），長度為978 bp，編碼325個氨基酸殘基，詳見圖1。

2.2編碼蛋白的理化性質(zhì)和高級結(jié)構(gòu)預(yù)測

預(yù)測FsCA1的分子式為C1 574H2 484N412O470S13，分子量 35.11 ku；正電殘基（Arg+Lys）、負電殘基（Asp+Glu）分別為34、33個，等電點7.59；不穩(wěn)定指數(shù)為50.78，表明該蛋白不穩(wěn)定；脂肪系數(shù)89.75；親水性系數(shù)0.023。

預(yù)測FsCA1蛋白的二級結(jié)構(gòu)主要有4種類型，由9個α-螺旋、6個β-折疊、多個延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成。利用SWISS MODEL蛋白質(zhì)在線建模工具Alignment Model，以蕎麥FsCA1為目標序列，以同源性高達82.38%的豌豆CA蛋白三維結(jié)構(gòu)（POB：1ekj.1.B）為模板進行同源建模，建模殘基范圍116～325個，目標序列和模板蛋白序列相似性達到56%。豌豆CA蛋白為同型八聚體，而FsCA1蛋白三維結(jié)構(gòu)具有豐富的α-螺旋、無規(guī)則卷曲，因此推測本研究獲得的編碼產(chǎn)物也是同型八聚體（圖2）。

編碼蛋白信號肽、亞細胞定位和跨膜區(qū)的預(yù)測

Signal P4.0軟件預(yù)測表明，F(xiàn)sAC1的第1～25位氨基酸殘基間有1個信號肽。用WoLF PSORT預(yù)測表明，該蛋白在葉綠體的定位系數(shù)為12.0（chlo：12），在線粒體的定位系數(shù)為2.0 （mito：2.0），在其他細胞器官中無分布。據(jù)此判斷，[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]編碼蛋白最有可能在葉綠體、線粒體內(nèi)發(fā)揮作用，或附著在這些細胞器上共同完成。HMMTOP分析結(jié)果顯示，第192～214位氨基酸之間有23個氨基酸形成的跨膜區(qū)。

編碼蛋白的motif分析

β-碳酸酐酶具有2個典型的保守區(qū)，保守區(qū)H1：C-[SA]-D-S-R-[LIVM]-x-[AP]，保守序列L2[EQ]-[JP3][YF]-A-[LIVM]-x（2）-[LIVM]-x（4）-[LIVMF]（3）-x-G-H-x（2）-C-G。FsAC1序列完全與此符合，其中保守區(qū)H（第156～163位）的保守序列為CSDSRVcP，保守區(qū)F（第200～220位）的保守序列為EYAVlhLkvsnIVViGHsaCG。[JP]

2.5不同物種[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]基因及其編碼蛋白的序列同源比對

以[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因序列為探針，通過BLASTn同源對比，發(fā)現(xiàn)9條與[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因相似度較高的序列，分別為大豆（Glycine max）GmCA（XM_003553786.1）、擬南芥（Arabidopsis thaliana）[WTBX][STBX]AtCA1[WTBZ][STBZ]（NM_111016.3）、豇豆（Vigna unguiculata）VuCA（JQ429799）、黃百合（Flaveria brownii）FbCA（FBU08402）、綠豆（[WTBX][STBX]Vigna radiata）VrCA1[WTBZ][STBZ]（AF139464.2）、豌豆（Pisum sativum）PsCA（M63627.1）、線葉黃頂菊（Flaveria linearis）FICA1[JP3]（FLU19738）、甘藍（Brassica oleracea）BoCA1（XM_003553786.1）、[JP]甘藍型油菜（Brassica napus）BnCA（GQ36780）、鷹嘴豆（Cicer atietinum）CaCA（XM_004489219.1）、煙草（Nicotiana tabacum）NtCA（AF4479.2）、蓖麻（Ricinus communis）RcCA（XM_002524596.1）、亞洲棉（Gossypium arboreum）GaCA（KHG255181）、亞麻薺（Camelina sativa）CaCA1（XP_010496563）、日中花（[WTBX][STBX]Mesembryanthemum nodiflorum）MnCA1[WTBZ][STBZ]（JN228098.1）、川桑（Morus notabilis）MnCA（XM_010110474）、龍眼（Dimocarpus longan）DlCA（JN033201）、歐洲與美洲山楊雜種（Populus tremula×Populus tremuloides）PtCA（PTU838）、胡楊（Populus euphratica）PeCA2（XM_011049011）、富貴草（Pachysandra terminalis）PtCA（DQ781308.1）、銀合歡（Leucaena leucocephala）LICA（KC92476.1）、菠菜（Spinacia）SpCA（J05403.1）和葡萄（[WTBX][STBX]Vitis vinifera）VvCA1[WTBZ][STBZ]（XM_002277921.3）。利用ClustalX、MEGA5.1軟件，構(gòu)建[WTBX][STBX]FsCA1和其他物種CA1[WTBZ][STBZ]編碼蛋白的系統(tǒng)進化樹，可見5種豆科植物CA1蛋白序列相似度較高，明顯聚為一類，除莧科藜亞科的菠菜、番杏科的日中花[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]序列有一定相似度外，其他物種均單獨成類（圖3）。[FL）]

3討論

碳酸酐酶（CA）普遍存在于綠色植物中，但物種間CA活

性差別很大。本試驗對蕎麥CA基因進行全長克隆和序列分析，通過生物信息學(xué)分析、多物種同源序列比對，初步明確了[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因編碼蛋白的基本特性、高級結(jié)構(gòu)。亞細胞定位和跨膜區(qū)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)sCA1主要定位于葉綠體中，少量分布于線粒體中；組織特異性表達分析印證了上述結(jié)果，表明β-CA主要分布在葉綠體葉肉細胞的基質(zhì)中[16]。在蕎麥綠色組織中的表達豐度顯著高于在非綠色組織中，暗示FsCA1可能與光合作用有關(guān)。編碼蛋白motif預(yù)測發(fā)現(xiàn)2個保守序列，具有β-CA典型結(jié)構(gòu)特征，進一步證明編碼蛋白是β-CA，似乎也支持FsCA1可能在光合作用中發(fā)揮功能的推測。這些結(jié)果為深入研究[WTBX][STBX]FsAC1[WTBZ][STBZ]基因奠定了基礎(chǔ)。

不同物種[WTBX][STBX]AC1[WTBZ][STBZ]基因序列比對結(jié)果顯示，蕎麥與菠菜的同源性（64%）略高于豌豆（61%），遠高于日中花（58%）。有趣的是，根據(jù)蛋白序列比對生成的進化樹卻顯示，蕎麥FsAC1卻與MnCA關(guān)系最近，其次是菠菜，而與豌豆的進化距離較遠。分析蛋白序列發(fā)現(xiàn)，蕎麥與日中花存在1段完全相同的序列（FMVFACSDSRVCPSHVLDFQPGEAFVVRNIANMVP），與菠菜的片段僅差異1個氨基酸（CEKEAVNVSLGHLLTYPFVRDGLVKKTLALKGGYYDFI），而與豌豆在2段蛋白片段上都有差異，分別相差1、2個氨基酸。這種同源基因保守序列上的差異可能反映物種的親緣關(guān)系，也可能與蛋白官能團有關(guān)，但與預(yù)測的motif保守序列存在異議，還須進一步論證。根據(jù)現(xiàn)有結(jié)果推測，蕎麥CA可能由上述2個官能團決定功能，F(xiàn)sCA1在功能上可能更接近MnCA。本研究建立[WTBX][STBX]FSCA1[WTBZ][STBZ]編碼蛋白的三維結(jié)構(gòu)時，是以已知的同源豌豆CA（POB：1ekj.1.B）為模板的，這可能會帶來誤差，但是POB數(shù)據(jù)庫現(xiàn)存的模板數(shù)量有限，未發(fā)現(xiàn)與蕎麥CA功能最接近物種的模板，因此，F(xiàn)SCA1三維結(jié)構(gòu)還需進一步完善。

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