魏高文，魏歆然，裴 異，肖作為，朱 旭，劉蕓青，陳 書，裴 蕓*

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南 長沙 410004)

蜂膠類黃酮對糖尿病合并肺結(jié)核患者外周血WBC與T淋巴細胞亞群的影響

魏高文1，魏歆然1，裴 異2，肖作為1，朱 旭1，劉蕓青1，陳 書1，裴 蕓1*

(1.湖南中醫(yī)藥大學，湖南 長沙 410208；2.長沙市中心醫(yī)院，湖南 長沙 410004)

目的 探討蜂膠類黃酮對糖尿病合并肺結(jié)核（diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis,DM-PTB）患者外周血中WBC與T淋巴細胞亞群的影響。方法 以DM-PTB患者120人為對象，利用隨機數(shù)字表采用完全隨機法分成A（蜂膠黃酮1 000 mg/d）、B（蜂膠黃酮2 000 mg/d）、C（條件對照）三組，每組 40人，觀察 6個月，比較綜合治療前后白細胞計數(shù)（WBC）及分類（淋巴細胞L和中性粒細胞N）、T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+數(shù)量及CD4+/CD8+比值的變化，并比較組內(nèi)前后差異和組間差異。結(jié)果 三組7項觀測指標自身前后配對差值（治療后-治療前）的均數(shù)比較Hotelling T2＝515.359，P＝0.000；治療7項觀測指標差別Wilks λ=0.017，P＝0.000，其中多重比較結(jié)果為WBC的B組大于A與C組，L的B組>A組>C組，N的B組大于A與C組，CD3+的B 與A組大于C組，CD4+的B組>A組>C組，CD4+/CD8+比值多重比較結(jié)果為B 與A組大于C組。結(jié)論 蜂膠類黃酮能提高DM-PTB患者的細胞免疫水平。

蜂膠類黃酮；DM-PTB；WBC；T淋巴細胞亞群；細胞免疫

糖尿病(diabetes mellitus，DM)已成為繼心腦血管疾病、惡性腫瘤之后的另一種嚴重危害人民健康的慢性非傳染性疾病[1]。長期的高血糖可導(dǎo)致CD3+、CD4+、CD4+/CD8+、B 細胞、NK 細胞顯著性減低，機體免疫功能下降，從而引起肺結(jié)核、腎病等并發(fā)癥的發(fā)生[2]。糖尿病合并肺結(jié)核（diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis,DM-PTB）是指集糖尿病和肺結(jié)核于一身的綜合病癥，是導(dǎo)致肺結(jié)核治療失敗最常見的因素之一[3-4]。蜂膠中包含300多種已知的物質(zhì)，其主要有效成份為類黃酮等[5]，一般說明書上以類黃酮標注為有效成份，其具有抗菌消炎、增強免疫、改善微循環(huán)、抗氧化、促進組織再生等廣泛的生物學作用[6-9]。本課題的研究，旨在探討蜂膠類黃酮對DM-PTB患者的細胞免疫水平的影響，為臨床應(yīng)用提供參考。

1 研究對象

1.1 一般資料

以2014年1月到2015年12月期間來長沙市中心醫(yī)院就診的DM-PTB患者120人為對象，其中男性62人，女性 58人，平均年齡56.3歲，最小42歲，最大72歲。利用隨機數(shù)字表采用完全隨機法分成A、B、C三組，每組40人，各組治療前的年齡、性別差別無統(tǒng)計學意義(以P＞0.20為均衡可比)。

1.2 納入標準

肺結(jié)核的診斷依據(jù)中華醫(yī)學會結(jié)核病學分會2013年修訂的《肺結(jié)核診斷和治療指南》進行［10］，糖尿病的診斷依據(jù)中華醫(yī)學會糖尿病學分會制定的《中國血糖監(jiān)測臨床應(yīng)用指南(2011 年版)》［11］。 對所有符合條件的DM-PTB患者進行宣傳教育，在充分了解本研究的前提下，自愿接受本研究治療方案的治療及檢測，簽署《知情同意書》后方納入研究。

1.3 排除標準

符合下列條件之一者排除出研究對象：（1）廣泛耐藥肺結(jié)核（XDR-PTB）患者；（2）合并 HIV 感染者；（3）肝功能異常者（AST、ALT 超過正常上限 1.2倍） 或HbsAg、HbeAg和HbcAg 同時陽性者；（4）慢性腎病及腎功能異常者；（5）合并有心腦血管、腎臟、造血系統(tǒng)等嚴重原發(fā)性疾病，消化道潰瘍病，或影響其生存的嚴重疾病（如腫瘤）；（6）對試驗方案西藥治療藥物過敏或?qū)χ兴帍?fù)方中藥物過敏者；（7）妊娠、準備妊娠或哺乳期婦女；（8）精神或法律上的殘疾患者。

1.4 退出（脫落）病例標準

因以下原因未完成臨床方案的入組病例應(yīng)視為脫落（脫落的病例應(yīng)詳細記錄原因）：（1）患者自行退出（療效太差、不良反應(yīng)等）；（2）失訪；（3）研究者令其退出（依從性差、出現(xiàn)夾雜癥、嚴重不良事件）。

2 研究方法

2.1 治療方法

2.1.1 常規(guī)臨床治療 對所有DM-PTB患者全程督導(dǎo)短程化學治療(directly observed treatment shortcourse，DOTS)， 初治痰涂片陽性者用 2H3R3Z3S3／4H3R3方案，其中鏈霉素過敏者予2H3R3Z3E3／4H3R3方案，初治痰涂片陰性者予2H3R3Z3／4H3R3方案，復(fù)治痰涂片陽性者予2H3R3Z3E3S3／6H3R3E3方案，其中鏈霉素過敏者用3H3R3Z3E3S3／6H3R3E3，所有病例均給予降糖治療，采用控制飲食、適當運動，對空腹血糖 7.0～11.1 mmol/L 者予口服降糖藥 (二甲雙胍、格列齊特或格列吡嗪等)，空腹血糖超過11.1 mmol/L者予早期正規(guī)使用小劑量(12～60 U/d)短效胰島素，待癥狀控制后，胰島素逐步減量，直至停用，后改為口服降糖藥［11-13］。

2.1.2 治療分組 蜂膠黃酮低劑量組(A組)：在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上輔以低劑量蜂膠黃酮口服，蜂膠軟膠囊購自浙江康恩貝集團規(guī)格為500 mg/粒，服用1 000 mg/d，連續(xù)觀察6個月；蜂膠黃酮常規(guī)劑量組(B組)：在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上輔以高劑量蜂膠黃酮口服，標準為2 000 mg/d(廠家推薦劑量)，連續(xù)觀察6個月；對照組(C組)：常規(guī)臨床治療，輔以口服不含蜂膠黃酮的純化水軟膠囊，連續(xù)觀察6個月，作為試驗條件對照。

2.2 觀測指標

所有入選病例均在治療前空腹抽取外周靜脈血液各測定一次白細胞計數(shù)(WBC)及分類（淋巴細胞L與中性粒細胞 N）、T 淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+比值，治療結(jié)束（6 個月）時再次檢測上述觀測指標。

2.3 檢驗方法

血常規(guī)檢查試劑異硫氰酸（FITC）熒光抗體抗CD3+、CD4+、CD8+，藻紅蛋白（PE）熒光抗體抗 CD3+購于美國 Pharmingen公司，均為小鼠抗人IgG抗體。檢測 CD3+、CD4+、CD8+T 淋巴細胞使用美國 BD公司FACS calibur流式細胞儀，用美國雅培公司全自動血細胞分析儀檢測 WBC及L與N，用直接免疫熒光標記法檢測外周血淋巴細胞亞群，并用流式細胞儀配套軟件（cell quest）分析各樣本1×104個細胞中淋巴細胞各亞群陽性表達率。每個樣本都以FITC和PE標記同型 IgG作為相應(yīng)的陰性對照。

2.4 統(tǒng)計學分析

本研究所獲得的數(shù)據(jù)應(yīng)用Epidata軟件建立數(shù)據(jù)庫，采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件對資料進行統(tǒng)計學分析，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。本次研究所獲取資料為計量資料，采用“±s”描述，組內(nèi)多變量治療前后配對比較采用Hotelling T2檢驗，三組間比較采用單因素方差分析或多元方差分析（MANO-VA）［14］。

3 結(jié)果

3.1 三組白細胞計數(shù)及分類的變化

三組治療前與治療6個月結(jié)束時，各空腹抽取外周靜脈血測定白細胞計數(shù)(WBC)及分類（淋巴細胞L與中性粒細胞N），三組3項觀測指標自身前后配對差值 （治療后-治療前）的均數(shù)，Hotelling T2＝515.359，P＝0.000，差別有統(tǒng)計學意義，說明治療后均有所提高；治療后3項觀測指標比較，Wilks λ=0.017，P＝0.000，差別有統(tǒng)計學意義，為 B 組高于A、C組，結(jié)果如表1所示。

表1三組DM-PTB患者白細胞計數(shù)及分類的變化 （±s，×109/L)

表1三組DM-PTB患者白細胞計數(shù)及分類的變化 （±s，×109/L)

注：與同組治療前比較，*P＜0.05；與對照組（C 組）比較，＃P＜0.05。

組別 n治療前WBC L N治療后WBC L N ABC 39 37 39 3.83±0.53 3.87±0.50 3.91±0.59 0.96±0.13 0.95±0.14 0.94±0.15 2.69±0.38 2.74±0.34 2.77±0.41 5.08±0.56*＃6.76±0.49*＃4.90±0.61*1.71±0.16*＃2.27±0.14*＃1.52±0.20*3.16±0.37*＃4.23±0.34*＃3.23±0.39*

3.2 三組T淋巴細胞亞群平均百分比及CD4+/CD8+比值的變化

三組治療前與治療6個月結(jié)束時，各空腹抽取外周靜脈血測定T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+、CD8+平均百分比及CD4+/CD8+比值，以小數(shù)來表達。三組4項觀測指標自身前后配對差值 （治療后-治療前）的均數(shù)比較，Hotelling T2＝515.359，P＝0.000，差別有統(tǒng)計學意義，說明治療后均有所提高；三組治療后3項觀測指標差別 Wilks λ=0.001，P＝0.000，A、B 組治療后3項觀測指標高于C組，結(jié)果如表2所示。

表2三組DM-PTB患者T淋巴細胞亞群平均百分比及CD4+/CD8+的比值變化 （±s，%)

表2三組DM-PTB患者T淋巴細胞亞群平均百分比及CD4+/CD8+的比值變化 （±s，%)

注：與同組治療前比較，*P＜0.05；與對照組（C 組）比較，＃P＜0.05。

組別 n治療前CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+治療后CD3+ CD4+ CD8+ CD4+/CD8+ABC 39 37 39 47.42±6.60 47.46±5.88 48.52±7.28 20.30±4.10 20.25±2.97 20.71±4.12 25.67±3.01 26.02±3.36 26.39±3.60 0.79±0.11 0.78±0.09 0.78±0.10 61.38±6.84*＃64.86±5.88*＃59.74±7.96*32.09±452*＃34.69±4.65*＃23.93±3.96*27.87±3.41*28.67±2.39*27.82±2.97*1.16±0.15*＃1.22±0.16*＃0.86±0.12*

4 討論

本次研究初始納入120例患者，試驗過程中共脫落失訪5例，最終納入分析數(shù)據(jù)集的病例數(shù)為115例，其中 A 組 39例（男 21、女 18）、B組 37例（男 18、女 19）、C 組 39 例（男 20、女 19），三組性別構(gòu)成差別無統(tǒng)計學意義（χ2＝0.205，P＝0.902），治療前7項觀測指標均滿足方差齊性（P>0.20），差別無統(tǒng)計學意義（P>0.20），說明三組間均衡可比。

蜂膠是由工蜂采集植物樹脂與其上顎腺、蠟腺等的分泌物混合形成的膠黏性物質(zhì)，是一種傳統(tǒng)的天然藥物，在歐洲的應(yīng)用歷史已有兩千多年?！渡褶r(nóng)本草經(jīng)》中記載的“露蜂房”，其主要成分是蜂蠟、蜂膠和蜂房油3種，具有“主治驚疾、寒熱邪氣、癲疾、腸痔”的作用。20世紀90年代以來，我國開始對蜂膠的成分、性質(zhì)、藥理和臨床應(yīng)用等進行了大量研究，蜂膠產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用得到了迅猛的發(fā)展，蜂膠現(xiàn)已收載于《中華人民共和國藥典》2010年版一部。

胸腺依賴性淋巴細胞（T細胞）是淋巴細胞的主要組分，具有殺傷靶細胞、輔助或抑制B細胞產(chǎn)生抗體、對特異性抗原的應(yīng)答反應(yīng)以及產(chǎn)生細胞因子等多種生物學功能，是身體中抵御疾病感染、腫瘤形成的“斗士”。1982年以來，國際上根據(jù)分化群抗原（CD抗原）已經(jīng)命名了CD1-CD166共180個分化抗原群，其中CD4和CD8是區(qū)分成熟T細胞亞群的主要表面標志。

研究結(jié)果表明，三組治療前、后白細胞計數(shù)及分類3項觀測指標自身前后配對差值（治療后-治療前）的均數(shù)差別有高度統(tǒng)計學意義，且各組3項觀測指標95%CI均>0，說明治療后各組3項觀測指標均值較治療前均有提高,其中WBC均值分析的B組高于A與 C組，L均值多重比較結(jié)果為B組最高、A組其次、C組最低，N數(shù)的多重比較結(jié)果為B組高于A與 C組。這一結(jié)果提示蜂膠黃酮可改善DM-PTB患者外周血白細胞總數(shù)。三組觀察對象T淋巴細胞亞群數(shù)量治療后與治療前的均數(shù)差值有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且各組 3 項觀測指標 95%CI均>0，說明治療后各組3項觀測指標均值較治療前均有提高；與治療前比較治療后患者T細胞總數(shù)、T細胞亞群及其CD4+/CD8+比值三組間3項觀測指標差別有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），其中CD3+T的多重比較結(jié)果 B 組、A 組均高于C組，CD4+T的多重比較結(jié)果B組最高、A組其次、C組最低；三組間CD8+的差別無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）;CD4+/CD8+比值自身前后配對差值的均數(shù)差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），各組 CD4+/CD8+比值自身前后配對差值的均數(shù)95%CI均>0，治療后各組CD4+/CD8+比值均有提高（P＜0.05）；三組治療后比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），提示：蜂膠黃酮能提高患者外周血中T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+的比例，提升患者機體的抗結(jié)核菌能力。

肺結(jié)核合并糖尿病患者的體內(nèi)存在復(fù)雜的微環(huán)境，影響T淋巴細胞亞群發(fā)揮其功能，使其保護性的免疫力降低［15］。由于蜂膠類黃酮具有較強的清除自由基和抗氧化能力，具有一定的抗炎功效，能有效抑制炎癥因子的生成，緩解炎癥對細胞造成的傷害［4-6］。因此，在常規(guī)治療的基礎(chǔ)上輔以高劑量蜂膠類黃酮口服，有助于控制血糖、消除炎癥，對PTB-DM患者的細胞免疫水平具有增強作用，從而提高綜合療效。

本課題的研究結(jié)果表明，蜂膠黃酮1 000 mg/d，連續(xù)服用6個月，可以提升T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+的比例，蜂膠黃酮2 000 mg/d時，可顯著改善白細胞計數(shù)總數(shù)、淋巴細胞數(shù)、T淋巴細胞亞群CD3+、CD4+的比例及 CD4+/CD8+比值，說明蜂膠類黃酮對DM-PTB患者的細胞免疫水平具有增強作用，其機制值得進一步探討。

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（本文編輯 李 杰）

Effect of Propolis Flavonoids on WBC and T lymphocyte Subsets in Peripheral Blood of Patients with Diabetes Mellitus Complicated with Pulmonary Tuberculosis

WEI Gaowen1,WEI Xinran1,PEI Yi2,XIAO Zuowei1,ZHU Xu1,LIU Yunqing1,CHEN Shu1,PEI Yun1*
(1.Hunan University of Chinese Medcine,Changsha,Hunan 410208,China;2.Changsha Central Hospital,Changsha,Hunan 410004,China)

ObjectiveTo investigate the effect of propolis flavonoids on the level of the WBC and T lymphocyte subsets in peripheral blood of patients with diabetes mellitus complicated with pulmonary tuberculosis(DM-PTB).MethodsThe 120 DM-PTB patients were randomly divided into group A (propolis flavonoids 1 000 mg/d),group B (propolis flavonoids 2 000 mg/d),group C(control),40 cases in each group.The WBC count and classification (lymphocyte L and neutrophil N),T lymphocyte subsets CD3+,CD4+,CD8+and CD4+/CD8+ratio in within and between groups were compared.ResultsThe 7 sets of indicators before and after the treatment in the three groups were compared,Hotelling T2＝515.359， P＝0.000.The 7 sets of indicators after treatment were tested,Wilks λ=0.017，P＝0.000.Multiple comparison results showed that WBC:group A>group B and group C,L:group B>group A>group C,N:group B>group A and group C,CD3+:group A and B>group C,CD4+:group B>group A>group C,CD4+/CD8+ratio:group A and B>group C.Conclusion Propolis flavonoids can enhance the cellular immunity of DM-PTB patients.

propolis flavonoids;WBC;T lymphocyte subsets;cellular immunity

R932；R521；R587.1

B

doi:10.3969/j.issn.1674－070X.2017.08.019

2016-09-17

湖南省自然科學基金項目（14JJ2112）。

魏高文，男，教授，主要研究方向為中西醫(yī)結(jié)合防治糖尿病。

*裴 蕓，女，講師，E-mail:758090368@qq.com。

本文引用：魏高文，魏歆然，裴 異，肖作為，朱 旭，劉蕓青，陳 書，裴 蕓.蜂膠類黃酮對糖尿病合并肺結(jié)核患者外周血WBC與T淋巴細胞亞群的影響[J].湖南中醫(yī)藥大學學報，2017，37（8）：891-894.