喻京生，肖霞，李維，龍輝，易妙

祛風(fēng)活血丸對EAU大鼠模型TGF-β2表達(dá)的影響

喻京生1，肖霞2，李維2，龍輝2，易妙2

目的通過觀察祛風(fēng)活血丸對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎（EAU）大鼠模型葡萄膜TGF-β2表達(dá)的影響，探討祛風(fēng)活血丸對EAU模型大鼠的治療效果。方法將60只Lewis大鼠隨機(jī)分為6組，分別為空白對照組、模型對照組、陽性對照組、祛風(fēng)活血丸低、中及高劑量組，每組10只?？瞻讓φ战M不作處理，其余均予以右后足墊注射光感受器間維生素A類結(jié)合蛋白多肽片斷（IRBP），建立EAU大鼠模型，造模成功后進(jìn)行灌胃。空白對照組與模型對照組予以蒸餾水灌胃，祛風(fēng)活血丸低、中、高劑量組分別予以不同劑量祛風(fēng)活血丸灌胃，陽性對照組予以熊膽開明片灌胃。分別于灌胃后第7、14、21、28 d分批處死大鼠，取眼球做免疫組化，檢測TGF-β2的表達(dá)。結(jié)果TGF-β2免疫組化：各時(shí)間點(diǎn)模型對照組與空白對照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；祛風(fēng)活血丸各組大鼠與空白對照組相比，葡萄膜TGF-β2含量明顯降低，各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中以中、高劑量組最為明顯；低劑量組于給藥后第7及21 d差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P7<0.01；P21<0.05）；第14及第28 d差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；陽性對照組于給藥后各時(shí)間點(diǎn)差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P14,21<0.01；P7,28<0.05）。結(jié)論祛風(fēng)活血丸能通過調(diào)節(jié)免疫因子TGF-β2的狀態(tài)，對大鼠葡萄膜炎發(fā)揮一定程度的治療作用。

自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型；祛風(fēng)活血丸；轉(zhuǎn)化生長因子β；葡萄膜炎

葡萄膜炎是一組累及葡萄膜、視網(wǎng)膜、玻璃體及視網(wǎng)膜血管的炎性病變，多發(fā)生于青壯年，易合并全身性自身免疫性疾病，常反復(fù)發(fā)作，治療棘手，可引起一些嚴(yán)重并發(fā)癥。本研究旨在采用具有祛風(fēng)清熱，養(yǎng)血活血作用的祛風(fēng)活血丸，作用于實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎大鼠模型，運(yùn)用相關(guān)的免疫組織化學(xué)法檢測大鼠葡萄膜TGF-β2的表達(dá)，通過觀察TGF-β2對免疫調(diào)節(jié)的作用，從而探討祛風(fēng)活血丸防治葡萄膜炎的機(jī)制和療效，為其治療葡萄膜炎提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)動物：取健康6~8周齡，體重150~180 g Lewis大鼠（由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供）60只，雌雄各半，經(jīng)檢查無眼疾。實(shí)驗(yàn)中所有涉及到實(shí)驗(yàn)動物的過程，均遵循湖南省實(shí)驗(yàn)動物管理辦法。實(shí)驗(yàn)動物喂養(yǎng)要求：（1）動物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境的溫度保持在22-25℃；（2）標(biāo)準(zhǔn)飼料和滅菌用水喂養(yǎng)，可自由飲水和飲食；（3）保持正常光照-黑暗周期，并盡量避免強(qiáng)光和噪音的刺激；（4）實(shí)驗(yàn)操作時(shí)，取放動物輕柔，小心操作。

實(shí)驗(yàn)藥物：祛風(fēng)活血丸由湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院提供（批號：20140917），120 g/瓶。主要藥物組成：熟地黃20 g、當(dāng)歸15 g、川芎6 g、柴胡10 g、黃芩10 g、杭菊花10 g、防風(fēng)10 g、魚腥草20 g。熊膽開明片（國藥準(zhǔn)字：Z19990029）：吉林長白山藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，產(chǎn)品批號：141101。

1.2 分組及給藥

采用隨機(jī)數(shù)字法分為6組，每組10只。分別為：空白對照組，模型對照組，陽性對照組，祛風(fēng)活血丸低、中及高劑量組?？瞻讓φ战M及模型對照組予以等劑量蒸餾水灌胃，每日2次，陽性對照組予以熊膽開明片成人等效劑量0.5 g/kg·d灌胃，祛風(fēng)活血丸低、中、高劑量組分別予以2 g/kg·d、3 g/kg·d、4 g/kg·d灌胃。分別于灌胃后第7、14、21及28 d分批處死動物，每次每組處死2只。每組剩余的2只大鼠于第30 d以內(nèi)毒素誘發(fā)復(fù)發(fā)葡萄膜炎后處死。

1.3 造模方法

以1mg IRBP粉劑與1ml PBS混合調(diào)制成濃度為1mg/ml的含IRBP的PBS溶液，放置備用。以5 ml注射器連接三通閥，分別注入0.6ml含IRBP的PBS溶液，1.4ml單純PBS溶液，2ml完全弗氏佐劑，反復(fù)推注直到充分乳化，制成4ml混合乳劑。常規(guī)消毒后，空白對照組不作處理，其余各實(shí)驗(yàn)組大鼠右后足墊中部皮下進(jìn)針，緩慢推注0.2ml的混合乳劑，使得每只大鼠的IRBP最終免疫量約30μg，出針并按壓進(jìn)針處[1]?？瞻捉M大鼠右后足墊注射等劑量無菌生理鹽水。

1.4 觀察指標(biāo)

一般指標(biāo)：每天于同一時(shí)段在裂隙燈下觀察大鼠眼前節(jié)改變：如結(jié)膜充血水腫，角膜緣血管充血，虹膜血管擴(kuò)張，前房滲出，晶狀體前囊灰白色絮狀沉著物，虹膜后粘連，瞳孔膜閉，玻璃體混濁等情況。評分標(biāo)準(zhǔn)參照Caspi臨床分級進(jìn)行評分[2]：0分：無炎癥，視網(wǎng)膜紅光反射正常；0.5分：虹膜血管輕度擴(kuò)張、充血；1分：虹膜血管中度充血，瞳孔縮??；2分：前房輕度混濁，紅光反射減弱；3分：前房中度混濁，但仍可見瞳孔，眼底紅光反射暗淡；4分：前房重度混濁（積膿），瞳孔膜閉，視網(wǎng)膜紅光反射消失，眼球前突。

采用pv-9000二步法免疫組化檢測葡萄膜中TGF-β2的表達(dá)：用頸椎脫臼法處死大鼠后，用食指和大拇指捏住大鼠頭部，使眼球自然突出，用眼科無齒鑷夾住眼球后視神經(jīng)位置，用小彎剪沿?zé)o齒鑷后緣迅速剪下眼球，放入固定液內(nèi)進(jìn)行固定，并于2h后剪開角鞏膜緣，向球內(nèi)注射少許固定液固定24 h，取出放入10%甲醛溶液中72 h，脫水浸蠟，石蠟包埋后連續(xù)切片。HE染色后使用pv-9000二步法免疫組化檢測試劑盒進(jìn)行檢測。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析進(jìn)行兩兩比較；P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

每天于裂隙燈下觀察，參照Caspi臨床分級進(jìn)行評分，造模第4d，臨床評分為0.48±0.03；造模第5 d為0.60±0.04；第6 d為1.04±0.09；第7 d為1.90± 1.66。采用單因素方差分析，P=0.001,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；兩兩比較：第4與第5 d比較，P=0.257，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其余各組相比P＜0.05,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明造模第5 d左右成功誘發(fā)EAU模型。

2.2 TGF-β2的表達(dá)

免疫組化法檢測：各時(shí)間段空白對照組無明顯TGF-β2表達(dá)，模型對照組TGF-β2表達(dá)明顯增多，陽性對照組及祛風(fēng)活血丸低劑量組隨著時(shí)間變化TGF-β2表達(dá)輕度減少，祛風(fēng)活血丸中劑量組及高劑量組隨著時(shí)間變化TGF-β2表達(dá)明顯減少（圖1-圖2）。

圖1 給藥后第7d光鏡下大鼠葡萄膜TGF-β2的表達(dá)。①空白對照組大鼠葡萄膜TGF-β2表達(dá)較少，偶可見少量異染細(xì)胞；②模型對照組TGF-β2表達(dá)明顯增多，可見強(qiáng)陽性棕黃色陽性物質(zhì)分布，含量多，顏色較深；③陽性對照組可見強(qiáng)陽性棕黃色陽性物質(zhì)分布，顏色較深，以邊緣多見；④祛風(fēng)活血丸低劑量組、⑤祛風(fēng)活血丸中劑量組、⑥祛風(fēng)活血丸高劑量組均可見陽性棕黃色陽性物質(zhì)分布，顏色較深，分布均勻，各組差別不明顯?！?00

圖2 給藥后第28d光鏡下大鼠葡萄膜TGF-β2的表達(dá)。①空白對照組大鼠葡萄膜TGF-β2表達(dá)較少，偶可見少量異染細(xì)胞；②模型對照組TGF-β2表達(dá)明顯，可見棕黃色陽性物質(zhì)分布，顏色稍淡；③陽性對照組可見淡黃色陽性顆粒物質(zhì)分布；④祛風(fēng)活血丸低劑量組可見淡黃色陽性顆粒物質(zhì)分布；⑤中劑量組邊緣部位可見少量淡黃色陽性顆粒物質(zhì)分布，顏色較第7d時(shí)明顯變淡；⑥高劑量組可見少量淡黃色陽性顆粒物質(zhì)分布，顏色較第7d時(shí)變淡?！?00

對免疫組化的結(jié)果進(jìn)行定量分析（表1）：以平均光密度值（OD）表述被測個體單位面積內(nèi)吸光物質(zhì)各像素光密度的平均值，由積分光密度除以測試框內(nèi)像素?cái)?shù)目獲得。OD值越大，說明測定物質(zhì)的量或染色反應(yīng)后顏色越深、數(shù)量越多。各組大鼠葡萄膜TGF-β2表達(dá)變化：模型組與空白組比較，葡萄膜TGF-β2含量顯著上升，各時(shí)間段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），說明IRBP能成功誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜炎，并可使大鼠葡萄膜組織TGF-β2含量明顯增多。各組與模型組比較：陽性對照組給藥后各時(shí)間段，TGF-β2含量逐漸下降，且幅度大，各時(shí)間段差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），其中以第14 d及第21 d下降明顯（P<0.01）；祛風(fēng)活血丸低劑量組在給藥后第7d，TGF-β2含量顯著降低（P<0.01），第21d，TGF-β2含量也有降低（P<0.05），其余時(shí)間段與模型組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）；中劑量組給藥后各時(shí)間段，TGF-β2含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；高劑量組給藥后各時(shí)間段，葡萄膜TGF-β2含量顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），特別是給藥后第7、21及28d下降更明顯（P<0.01）。

表1 各組大鼠葡萄膜TGF-β2光密度值（OD）分布變化ˉ±s）

表1 各組大鼠葡萄膜TGF-β2光密度值（OD）分布變化ˉ±s）

注：同時(shí)間與空白組比較，a：P<0.01。同時(shí)間與模型組比較，b：P<0.05，c：P<0.01。（單因素方差分析）

給藥后時(shí)間（d）組別714 21 28空白對照組0.165±0.005 0.135±0.005 0.170±0.010 0.145±0.005模型對照組0.665±0.015 a 0.460±0.020 a 0.405±0.015 a 0.325±0.035 a陽性對照組0.605±0.015 b 0.355±0.035c 0.270±0.010 c 0.240±0.010 b祛風(fēng)活血丸低劑量組0.530±0.010 c 0.440±0.020 0.350±0.010 b 0.270±0.010祛風(fēng)活血丸中劑量組0.300±0.010 c 0.255±0.005 c 0.225±0.015 c 0.170±0.010 c祛風(fēng)活血丸高劑量組0.375±0.015 c 0.360±0.010 b 0.270±0.020 c 0.230±0.010 c

3 討論

在中醫(yī)學(xué)上，葡萄膜炎按其發(fā)病部位及病癥特點(diǎn)，分別屬于中醫(yī)“瞳神緊小”“瞳神干缺”“云霧移睛”“視瞻昏渺”“狐惑病”等范疇，其病因病機(jī)復(fù)雜，大概可分為以下幾個方面：可因肝經(jīng)風(fēng)熱或肝膽火熾，偱經(jīng)上犯黃仁，或風(fēng)濕熱邪相摶，熏蒸黃仁；或因久病傷陰，肝腎陰虧，虛火上炎，灼傷黃仁，致使瞳神持續(xù)縮小，甚至干缺不圓；也可因痰濁上泛，或濕熱蘊(yùn)蒸，上攻于目；或可因肝腎陰虛，目失濡養(yǎng)所致。目前認(rèn)為，除感染性因素外，葡萄膜炎的發(fā)病主要與免疫相關(guān)，葡萄膜在生理上具有相關(guān)的免疫學(xué)特性，是循環(huán)中免疫復(fù)合物沉積的好發(fā)部位[3]。葡萄膜富有豐富的血管和色素，分布較多的免疫活性物質(zhì)，葡萄膜血管面積廣，容量大，血流緩慢，容易使血流中各種免疫介質(zhì)和抗原、抗體成分在此沉積，從而引發(fā)各種免疫應(yīng)答反應(yīng)，并呈長期反復(fù)的過程[4]。

轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）屬于一組新近發(fā)現(xiàn)的調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和分化的TGF-β超家族蛋白，TGF-β包含多種亞型的細(xì)胞因子，主要有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3，它們在結(jié)構(gòu)上和功能上，對巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞及B細(xì)胞等多種細(xì)胞產(chǎn)生的影響具有相似性。機(jī)體多種細(xì)胞均可分泌非活性狀態(tài)的TGF-β，但是，只有在酸性環(huán)境下通過蛋白的裂解作用才可使TGF-β復(fù)合體變?yōu)榛罨腡GF-β。TGF-β的生物功能包括：對多種正常的和轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的增殖具有可逆性的顯著抑制作用，對細(xì)胞的分化具有誘導(dǎo)或抑制的雙重功能，可以促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的形成，促進(jìn)傷口的愈合，抑制免疫功能等[5]。有研究發(fā)現(xiàn)，TGF-β在預(yù)防和治療自身免疫性葡萄膜炎中具有重要作用[6]。炎癥早期原有的潛在活性的TGF-β2及損傷部位脫顆粒釋放的TGF-β2與局部暴露的細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合而被激活，激活的TGF-β2對白細(xì)胞、單核細(xì)胞、T細(xì)胞和成纖維細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化性[7]。目前認(rèn)為，維持眼的免疫抑制環(huán)境，保持前房的免疫赦免特性與TGF-β2密切相關(guān)[8]。

在本實(shí)驗(yàn)研究中我們發(fā)現(xiàn)，本次造模采用IRBP多肽合成片段，通過經(jīng)大鼠右足后墊皮下注射抗原對實(shí)驗(yàn)動物進(jìn)行主動免疫的方法，成功誘發(fā)了EAU模型。起病時(shí)間在5-7 d，癥狀反應(yīng)劇烈，造模成功率高，在造模第5 d左右大部分大鼠出現(xiàn)葡萄膜炎反應(yīng)。TGF-β2在造模后大鼠葡萄膜組織切片中表達(dá)較空白對照組明顯增加，說明TGF-β2與免疫反應(yīng)具有一定的相關(guān)性，其表現(xiàn)規(guī)律為在炎癥高峰期表達(dá)最多，炎癥消退期逐漸減少，它對白細(xì)胞等炎性細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化性，這可能與其在酸性環(huán)境下被激活，通過抑制淋巴因子和其他剌激淋巴細(xì)胞功能的因子的分化，抑制免疫活性細(xì)胞的增殖等方式達(dá)到免疫調(diào)節(jié)功能相關(guān)。低劑量組在給藥后第7及21d與模型組對比，葡萄膜中TGF-β2含量下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，在給藥后第14及28 d時(shí)與模型組對比低劑量組TGF-β2降低幅度不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而中、高劑量組各時(shí)間段與模型組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這說明祛風(fēng)活血丸治療有效，但療效與藥物劑量有關(guān)，而如何找到最佳治療劑量還需要更進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果證實(shí)在EAU大鼠模型中TGF-β2呈高表達(dá)，有研究表明，TGF-β因子對細(xì)胞增殖、分化和免疫功能均有顯著的調(diào)節(jié)作用，它可抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的增殖，抑制免疫效應(yīng)細(xì)胞的分化和活性，抑制細(xì)胞因子的產(chǎn)生及其免疫調(diào)節(jié)作用[9]，我們推斷IRBP誘導(dǎo)的EAU大鼠模型出現(xiàn)的免疫反應(yīng)紊亂可能是葡萄膜炎發(fā)生發(fā)展的一個重要因素，因此如何重建正常的免疫系統(tǒng)將可能為人類治療葡萄膜炎及預(yù)防其復(fù)發(fā)提供一種新的治療思路。

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OBJECTIVE To explore the treatmentmechanism ofQufeng Huoxue pillon experimentalautoimmune uveitis（EAU）ratsmodel by observing the influence of the pill on TGF-beta 2 expression in themodel. METHODS Sixty Lewis ratswere randomly divided into blank control group,model control group,positive control group,low dose of Qufeng Huoxue pill group,middle dose of Qufeng Huoxue pill group and high dose of Qufeng Huoxue pillgroup,whichmeant10 in each group.Rats in blank controlgroup were not intervened,while subjects in other groupswere injected with interphotoreceptor retinoid-binding protein in right rear foot pad to establish EAU model.After thatprocedure,the blank controlgroup andmodelcontrolgroup were administrated with distilled water, meantime,Qufeng Huoxue pillgroupswere treated with differentdosesofQufeng Huoxue pill respectively by gavage. The ratsweresacrificed inbatch7,14,21,28daysafter treatmentfortheireyeballstodetecttheexpressionofTGF-beta2 by immunohistochemicalprocess.RESULTSComparison of TGF-beta 2 between blank controlgroup andmodel controlgroup showed statistical significance atevery time point（P<0.01）;In contrast to blank controlgroup,TGF-beta 2 ofQufeng Huoxue pillgroupswere lower regardlessof the time point（P<0.01）,especiallywas themiddle and high dose groups.The ratuveitiswere decreased obviously after treatment,withmedium and high dose groupsweremost obviously,each time all have significantly statistical differences（P<0.01）;The Low dose group after treatmenthas significantly statisticaldifferencesatday 7（P<0.01）;ithasstatistically significantatday 21（P<0.05）;Positive controlgroup showed significantly statisticaldifferencesatday 14 and 21（P<0.01）;ithasstatistically significantatday7 and 28（P<0.05）. CONCLUSIONS The Qufeng Huoxue pill showed obviouseffects on ratsuveitis through regulating expression of the TGF-beta 2.

experimental autoimmune uveitis ratmodel; Qufeng Huoxue pill;TGF-beta2;uveitis

R773;R285.5

A

1002-4379（2017）03-0146-05

10.13444/j.cnki.zgzyykzz.2017.03.002

國家自然科學(xué)基金（81273808）湖南省科技計(jì)劃項(xiàng)目（2012SK3136）

1湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，長沙410007 2湖南中醫(yī)藥大學(xué)，長沙410208

喻京生，yujingsheng-mike@163.com

Influence of Qufeng Huoxue pill on TGF-beta 2 expression in experimental autoimmune uveitis rat model

YU Jingsheng1,XIAOXia 2,LIWei2,et,al.

1.The FirstHospitalofHunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208,China;2.Hunan University ofChineseMedicine,Changsha,410208,China