劉 龍，張 煒*，陳元濤，劉海彬，張 琪，高中超，雷 蕾

（青海師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青海 西寧 810008）

紫花苜蓿葉蛋白制備抗氧化肽酶解條件優(yōu)化及氨基酸組成分析

劉 龍，張 煒*，陳元濤，劉海彬，張 琪，高中超，雷 蕾

（青海師范大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，青海 西寧 810008）

為開發(fā)利用苜蓿葉蛋白資源，以紫花苜蓿葉蛋白為原料，利用堿性蛋白酶酶解制備抗氧化肽。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以抗氧化活性為指標(biāo)，選取酶解時(shí)間、堿性蛋白酶用量、酶解溫度和pH值為考察因素。采用響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化，其最佳酶解條件為酶解時(shí)間240 min、堿性蛋白酶用量4.80%、酶解溫度60 ℃、pH 11.60，在此條件下清除率達(dá)到64.25%。用制備色譜純化并收集抗氧化性最強(qiáng)的抗氧化肽組分，表明純化后的抗氧化肽具有更強(qiáng)的抗氧化活性。用高效液相色譜測(cè)定純化后抗氧化肽的氨基酸組成，其組成為天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和賴氨酸（Lys）。

苜蓿葉蛋白；酶解條件優(yōu)化；抗氧化肽純化；氨基酸組成；清除率；響應(yīng)面

自由基是生物體新陳代謝過程中產(chǎn)生的一類帶有一個(gè)或幾個(gè)不配對(duì)電子的分子或原子，其化學(xué)性質(zhì)相當(dāng)活躍并具有高度的氧化活性[1]。研究發(fā)現(xiàn)，氧化作用會(huì)引起一系列的生物學(xué)反應(yīng)，導(dǎo)致分子、細(xì)胞和組織結(jié)構(gòu)的破壞，造成功能損傷，引起心臟病、癌癥和衰老等疾病[2-3]。高活性抗氧化劑的攝入是清除體內(nèi)過量自由基的一種有效方法?？寡趸瘎┌雌鋪碓床煌煞譃槿斯ず铣煽寡趸瘎┡c天然抗氧化劑2 種，但人工合成抗氧化劑因其明顯的毒副作用和安全性問題而受到使用限制[4-5]，因此尋找高抗氧化活性的天然成分已成為功能食品領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，抗氧化肽為其典型代表。

抗氧化肽是生物活性肽的一種，具有抑制、延緩脂質(zhì)氧化，保護(hù)人體組織器官免受自由基侵害的作用。它除自身具有營養(yǎng)功能特性外，還具有高安全性、強(qiáng)抗氧化性和易被吸收等特點(diǎn)[6-7]，因此在食品、制藥和化妝品等行業(yè)中具有極大的潛在利用價(jià)值[8]。目前，抗氧化肽主要是通過酶法、發(fā)酵法等手段從天然動(dòng)植物蛋白質(zhì)中獲得，且已從大豆蛋白、小麥胚芽蛋白、玉米蛋白、花生蛋白、菜籽蛋白等[9]原料中制備出了抗氧化肽。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）為豆科苜蓿屬多年生草本植物，具有產(chǎn)草量高、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，素以“牧草之王”著稱[10]，我國種植面積居世界第5位。 紫花苜蓿葉含有32%～65%的粗蛋白和40%～40.6%的人體必需氨基酸[11]，蛋白質(zhì)含量豐富、氨基酸種類齊全，營養(yǎng)價(jià)值高于大豆、花生餅，非常符合聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織的規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)[12-13]，更重要的是紫花苜蓿葉蛋白還含有豐富的抗氧化活性成分[14-15]，是制取抗氧化肽的理想材料。

目前，國內(nèi)外對(duì)苜蓿葉蛋白的研究與開發(fā)主要停留在提取和營養(yǎng)源水平上，對(duì)其抗氧化肽制備及純化分析的研究報(bào)道卻很少，且謝正軍等[16]研究發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶更適合紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽的水解制備，因此，本研究以紫花苜蓿葉蛋白為原料，采用堿性蛋白酶酶解紫花苜蓿葉蛋白制備抗氧化肽，以1,1-二苯基-2-苦基肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率為指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對(duì)酶解條件進(jìn)行優(yōu)化，制備色譜純化以獲得抗氧化活性較高的抗氧化肽，并對(duì)抗氧化肽的成分進(jìn)行分析。為紫花苜蓿葉蛋白資源的開發(fā)利用和精深加工提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫花苜蓿葉蛋白粉由本實(shí)驗(yàn)室泡沫分離提純制備[17]；堿性蛋白酶（100 000 U/g） 江蘇銳陽生物科技有限公司；DPPH（分析純） 上海源葉生物科技有限公司；無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、三氯乙酸等（均為分析純） 天津市凱信化學(xué)工業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PB-10（數(shù)顯）pH計(jì) 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；TU-1901雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；制備色譜（DAC-HB50動(dòng)態(tài)壓縮柱） 江蘇漢邦科技有限公司；20AT高效液相色譜儀（配二極管陣列檢測(cè)器、Inertsustain C18（50 mm×4.6 mm，5 μm）） 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽的制備

將紫花苜蓿葉蛋白粉配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的反應(yīng)體系，在溫度為50 ℃水浴中預(yù)熱處理30 min。處理后調(diào)節(jié)至實(shí)驗(yàn)設(shè)定的酶解溫度和酶解pH值。隨著酶解反應(yīng)的進(jìn)行，酶解液的pH值逐漸下降，滴加0.5 mol/L NaOH溶液保持pH值不變，到達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)定酶解時(shí)間后，將酶解液放入95 ℃沸水中保持5 min滅酶活性，取出冷卻。

1.3.2 DPPH自由基清除率的測(cè)定

各取4.0 mL酶解液，依次加入4.0 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%的三氯乙酸溶液離心分離10 min，各取1.0 mL上清液加蒸餾水定容到100.0 mL，取上述溶液4.0 mL依次與1.0 mL質(zhì)量濃度為0.025 g/L的DPPH無水乙醇溶液室溫避光反應(yīng)20 min，在517 nm波長處測(cè)吸光度。另取5.0 mL待測(cè)樣品避光反應(yīng)20 min，在517 nm波長處測(cè)吸光度；以1.0 mL 0.025 g/L DPPH無水乙醇溶液和4.0 mL蒸餾水反應(yīng)作為參比，按式（1）計(jì)算待測(cè)樣品的DPPH自由基清除率[18-19]：

式中：AX為樣品加DPPH無水乙醇溶液的吸光度；AX0為樣品本底吸光度；A0為蒸餾水加DPPH無水乙醇溶液的吸光度。

1.3.3 紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽制備的單因素試驗(yàn)

以酶解時(shí)間240 min、酶解溫度55 ℃、酶解pH 12.0、堿性蛋白酶用量4%為基本條件，固定其他條件不變，設(shè)置酶解溫度35、40、45、50、55、60 ℃；酶解時(shí)間20、40、60、90、120、150、180、210、240 min；堿性蛋白酶用量1%、2%、3%、4%、5%、6%；酶解pH 8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0。以DPPH自由基清除率為指標(biāo)進(jìn)行優(yōu)選試驗(yàn)。

1.3.4 紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽制備響應(yīng)面試驗(yàn)

利用響應(yīng)面軟件Design-Expert 8.0.6，根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以DPPH自由基清除率為響應(yīng)值，選擇單因素較優(yōu)因素及水平進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，探究紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽制備的最佳工藝條件組合，因素與水平設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and their levels used in response surface analysis

1.3.5 多肽含量的測(cè)定

在苜蓿葉蛋白酶解液中加入等體積的16%三氯乙酸溶液，在35 ℃的水浴中反應(yīng)5 min，然后在高速離心機(jī)上離心30 min，取上清液作為待測(cè)樣，取1.00 mL的樣品，每個(gè)試管中加入堿性銅試劑1.00 mL，混勻，在35 ℃的水浴中反應(yīng)5 min，冷卻至常溫，再迅速加入Folin-酚試劑4.00 mL，混勻，在55 ℃水浴中反應(yīng)10 min，冷卻至常溫，以1.00 mL蒸餾水+1.00 mL堿性銅試劑+ 4.00 mL Folin-酚試劑的反應(yīng)液為空白，在762 nm波長處測(cè)定吸光度，以此表示多肽含量。

1.3.6 水解度的測(cè)定

取待測(cè)液1.00 mL，加入5.00 mL的考馬斯亮藍(lán)溶液，混勻后，常溫放置5 min，然后在595 nm波長處進(jìn)行吸光度測(cè)定，空白組以等體積的蒸餾水替待測(cè)液。按式（2）計(jì)算苜蓿葉蛋白的水解度[20]：

式中：AX為蛋白質(zhì)溶液水解前的吸光度；A0為蛋白質(zhì)溶液水解后的吸光度。

1.3.7 抗氧化肽的純化[21-22]

將苜蓿葉蛋白酶解液加入等體積16%的三氯乙酸溶液，在35 ℃的水浴中反應(yīng)5 min，然后在高速離心機(jī)上離心30 min，取上清液，用0.45 μm的TPEF濾膜過濾，將過濾液取2.5 mL注入制備色譜中分離純化。

制備色譜條件：色譜柱：C18（250 nm×12 mm， 10 μm）；流動(dòng)相：V（0.1%三氟乙酸）∶V（乙腈）= 80∶20，等度洗脫；流速10.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量2.5 mL；檢測(cè)波長214 nm。

1.3.8 多肽的水解

取10 mL樣品加入到20 mL的酸解液（V（三氟乙酸）∶V（6 mol/L HCl）=1∶2），在酸液中加入0.2%的苯酚）中[20,23]，放入水解瓶中，充入氮?dú)猓芊?，放?60 ℃水解60 min。打開水解瓶，用0.1 mol/L的鹽酸定容到10.00 mL。

1.3.9 氨基酸組成分析

氨基酸的柱前衍生：分別準(zhǔn)確移取標(biāo)準(zhǔn)品溶液、多肽水解液和水各200 μL，0.1 mol/L的異硫氰酸苯酯的乙腈溶液100 μL，1 mol/L的三乙胺的乙腈溶液100 μL，混勻，室溫放置30 min，加入正己烷400 μL，充分振搖混勻后，靜置10 min，吸取下層溶液，用0.45 μm濾膜濾過，即得標(biāo)準(zhǔn)品、多肽水解液和空白的衍生化溶液[23]。

分析色譜條件：色譜柱：C18（250 nm×4.6mm， 5 μm）；流動(dòng)相：A相0.1 mol/L的乙酸鈉（pH值調(diào)至6.5）-乙腈（97∶3，V/V），B相乙腈-水（4∶1，V/V）；流速1.0 mL/min；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量20 μL；檢測(cè)波長254 nm。進(jìn)行梯度洗脫[20]，梯度洗脫見表2。

表2 液相色譜梯度洗脫Table 2 Gradient elution program for LC analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 水解度、多肽含量與DPPH自由基清除率的關(guān)系

圖1 清除率與酶解時(shí)間的關(guān)系圖Fig. 1 Effect of hydrolysis time on DPPH scavenging activity of hydrolysates

圖2 多肽含量與酶解時(shí)間的關(guān)系Fig. 2 Effect of hydrolysis time on polypeptide content of hydrolysates

從圖1可以看出，清除率隨酶解時(shí)間的延長而增大，在240 min時(shí)達(dá)到最大值，從圖2可以看出，多肽含量也隨酶解時(shí)間延長而逐漸增大，在120 min時(shí)達(dá)到最大值，由圖1及圖2能看出，多肽含量和清除率不完全呈正比，這是因?yàn)榻^大部分具有生理活性的多肽主要是一些分子質(zhì)量較小的肽段[24]，因此不能以多肽含量的大小來衡量紫花苜蓿葉蛋白多肽的抗氧化性。

圖3顯示，水解度隨酶解時(shí)間延長逐漸增大，在240 min達(dá)到最大值后無明顯變化。對(duì)比圖1說明水解度與自由基清除能力之間并不存在線性關(guān)系，這是因?yàn)橹苽淇寡趸牡哪康氖潜M可能多地獲得功能性多肽，而水解度過大可能會(huì)產(chǎn)生過多不具抗氧化性的游離氨基酸和寡肽，抗氧化多肽含量下降[25-26]。

圖3 水解度與酶解時(shí)間的關(guān)系Fig. 3 Relationship between degree of hydrolysis and hydrolysis time

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 酶解時(shí)間的影響

圖4 酶解時(shí)間對(duì)紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽制備的影響Fig. 4 Effect of hydrolysis time on DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖4可以看出，隨著酶解時(shí)間的延長，清除率逐漸增大，但上升速率逐漸趨緩。這是因?yàn)槊附夥磻?yīng)之初酶解程度較低肽鏈過長，具有抗氧化活性的氨基酸殘基不能暴露出來，顯示不出抗氧化活性。隨著反應(yīng)進(jìn)行，當(dāng)酶解到一定程度后，紫花苜蓿葉蛋白大部分已經(jīng)酶解，氨基酸殘基完全暴露[27]。這時(shí)抗氧化能力隨時(shí)間變化趨于穩(wěn)定，再延長反應(yīng)時(shí)間也不能達(dá)到更好的酶解效果，因此選用酶解時(shí)間240 min作為下一步研究條件。

2.2.2 酶解溫度的影響

圖5 酶解溫度對(duì)紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽制備的影響Fig. 5 Effect of hydrolysis temperature on DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖5可以看出，清除率先隨酶解溫度的升高而增大，達(dá)到最大值后，清除率隨溫度的升高而減小。這是因?yàn)槊附夥磻?yīng)之初溫度較低，隨著溫度的升高，反應(yīng)速率加快，清除率逐漸增大。但溫度升高到一定程度后，酶蛋白會(huì)逐漸變性而失活，引起酶反應(yīng)速率下降，導(dǎo)致清除率下降，因此選用溫度55 ℃作為下一步研究條件。

2.2.3 堿性蛋白酶用量的影響

圖6 堿性蛋白酶用量對(duì)紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽制備的影響Fig. 6 Effect of alkaline protease concentration on DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖6可以看出，清除率隨堿性蛋白酶用量的增大而增大，但上升速率逐漸趨緩，這是因?yàn)樵谝欢ǖ孜镉昧織l件下，酶量較低時(shí)，清除率隨酶解速率上升明顯。隨著加酶量的逐漸加大，反應(yīng)體系中酶的用量升高，堿性蛋白酶可能被飽和，導(dǎo)致盡管酶量成倍增加，清除率卻僅有少許的上升[28]，因此選用堿性蛋白酶用量4%作為下一步研究條件。

2.2.4 酶解pH值對(duì)紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽制備的影響

圖7 酶解pH值對(duì)紫花苜蓿葉蛋白抗氧化肽制備的影響Fig. 7 Effect of pH on DPPH scavenging activity of hydrolysates

由圖7可以看出，清除率隨pH值升高而增大，達(dá)到最大值后開始減小，這是因?yàn)樵趐H值較小時(shí)，酶活性被抑制，清除率小。隨著pH值的逐漸增大，逐漸接近酶的最適pH值范圍，當(dāng)反應(yīng)體系pH值達(dá)到12.0時(shí)清除率最大，這是因?yàn)槊傅拇呋饔弥挥性谔囟ǖ膒H值條件下，才能保持最大催化活性的酶構(gòu)象[29]，因此選用pH 12.0作為下一步研究條件。

2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共29 個(gè)試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如3表所示。

表3 苜蓿葉蛋白水解的響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Response surface design with experimental results

運(yùn)用Design-Expert軟件進(jìn)行擬合，苜蓿葉蛋白酶解液清除率的響應(yīng)值經(jīng)回歸擬合后，得到的最優(yōu)方程為：清除率/%=0.51+0.024A+0.10B－0.18C－003D－0.024AB－0.066AC－0.091BC－0.038B2-0.30C2+ 0.023D2。對(duì)該回歸模型進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)及方差分析，其結(jié)果如表4所示。

表4 響應(yīng)面試驗(yàn)方差分析Table 4 Analysis of variance of quadratic polynomial equation

由表4可知，模型P值小于0.000 1，說明所建立的模型極顯著。其因變量和全體自變量之間的線性關(guān)系顯著（R2=99.05%），說明響應(yīng)值的變化有99.05%來源于所選變量，即所選的4 個(gè)因素基本上決定了苜蓿蛋白水解效率。因此，該回歸方程對(duì)試驗(yàn)擬合情況較好，可以較好地描述各因素與響應(yīng)值之間的真實(shí)關(guān)系。A、B、C、AC、BC、B2、C2和D2項(xiàng)的影響顯著；F值越大，因素對(duì)響應(yīng)值的影響越大，影響因素的順序：酶解pH值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間＞堿性蛋白酶用量。

圖8 各因素交互影響的響應(yīng)面圖Fig. 8 Response surface plots showing the effects of various factors on DPPH scavenging activity of hydrolysates

選擇4 個(gè)交互作用的響應(yīng)面作為代表，如圖8所示，隨著酶解溫度和酶解時(shí)間水平的增加，酶解多肽對(duì)DPPH自由基的清除率逐漸增加，且酶解溫度的影響明顯強(qiáng)于酶解時(shí)間的影響；隨著酶解pH值水平的增加，酶解多肽對(duì)DPPH自由基的清除率先增加后降低；隨著堿性蛋白酶用量的增加，酶解多肽對(duì)DPPH自由基的清除率基本不變，這是由于酶解溫度、酶解時(shí)間和酶解pH值對(duì)DPPH自由基清除率的影響明顯強(qiáng)于堿性蛋白酶用量（3%～5%）的影響[30]。因素影響作用的大小與方差分析的結(jié)論一致。

2.3.2 模型驗(yàn)證

為了驗(yàn)證所建立模型的可信度，利用Design-Expert軟件，選出紫花苜蓿葉蛋白水解最佳預(yù)測(cè)優(yōu)化工藝為酶解時(shí)間248 min、酶解溫度60 ℃、堿性蛋白酶用量4.85%、酶解pH 11.60，其清除率為65.10%?？紤]到實(shí)際操作，對(duì)選出的優(yōu)化數(shù)據(jù)進(jìn)行相應(yīng)的調(diào)整，其驗(yàn)證工藝為：酶解時(shí)間240 min、酶解溫度60 ℃、堿性蛋白酶用量4.80%、酶解pH 11.60。在此條件下，清除率為64.25%，與模型預(yù)測(cè)清除率基本相符，說明模型符合紫花苜蓿葉蛋白的水解工藝。

2.4 抗氧化肽的純化

圖9 制備色譜純化高效液相色譜圖Fig. 9 Chromatogram of antioxidant peptide purified by preparative HPLC

將苜蓿葉蛋白酶解液按照1.3.8節(jié)中的方法進(jìn)行分離純化，如圖9所示，收集各個(gè)峰的流動(dòng)相，將各個(gè)峰收集的流動(dòng)相進(jìn)行多肽含量和對(duì)DPPH自由基清除率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)最后的一個(gè)峰（保留時(shí)間12～15 min）的抗氧化性最強(qiáng)。取相同體積最后一個(gè)峰收集的流動(dòng)相和苜蓿蛋白酶解液，然后分別進(jìn)行多肽含量和DPPH自由基清除率測(cè)定，其中流動(dòng)相多肽的吸光度和苜蓿葉蛋白酶解液的吸光度分別為0.024和0.253，清除率分別為40.43%、43.52%，在清除率基本一樣的情況下，流動(dòng)相多肽的吸光度（即含量）更小，所以制備色譜純化后的抗氧化肽具有更強(qiáng)的抗氧化能力。

2.5 抗氧化肽氨基酸成分分析

將制備色譜純化好的抗氧化肽按照1.3.8節(jié)方法進(jìn)行水解。將水解得到的氨基酸和氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行柱前衍生，按照1.3.9節(jié)分析色譜條件進(jìn)行梯度洗脫，用高效液相色譜測(cè)定抗氧化肽的氨基酸組成。

圖10 氨基酸的高效液相圖譜Fig. 10 High performance liquid chromatogram of amino acids

由圖10可以看出，抗氧化肽組成中含有的氨基酸有天冬氨酸（Asp）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）和賴氨酸（Lys）。

3 結(jié) 論

通過響應(yīng)面優(yōu)化苜蓿葉蛋白水解的工藝，其最優(yōu)工藝為酶解時(shí)間240 min、堿性蛋白酶用量4.80%、酶解溫度60 ℃、pH 11.60，在此條件下清除率達(dá)到64.25%。對(duì)比制備色譜純化前后的抗氧化肽對(duì)DPPH自由基的清除能力，發(fā)現(xiàn)純化后的抗氧化肽具有更強(qiáng)的抗氧化能力。此外，用高效液相色譜測(cè)定了純化后具有高抗氧化活性肽的氨基酸組成，為紫花苜蓿葉蛋白資源的開發(fā)利用和精深加工提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和技術(shù)參考。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis Conditions for the Preparation of Antioxidant Peptides and Amino Acid Composition Analysis from Alfalfa Leaf Protein

LIU Long, ZHANG Wei*, CHEN Yuantao, LIU Haibin, ZHANG Qi, GAO Zhongchao, LEI Lei
(School of Chemistry and Chemical Engineering, Qinghai Normal University, Xining 810008, China)

In order to develop and utilize alfalfa leaves as a good resource of protein, antioxidant peptides were prepared from alfalfa leaf protein by alkaline protease hydrolysis. Through one-factors-at-a-time experiments, hydrolysis time, enzyme concentration, hydrolysis temperature and pH were selected as independent variables for further optimization using response surface methodology, and the response variable was antioxidant activity. The optimum conditions that provided the maximum percentage scavenging of DPPH radical of 64.25% were found to be hydrolysis time of 240 minutes, enzyme concentration of 4.80%, hydrolysis temperature of 60 ℃ and pH of 11.60. Then the most potent antioxidant peptide was purified and collected by preparative liquid chromatography, having stronger antioxidant activity than the crude hydrolysate. The amino acid composition of the antioxidant peptide was determined by high performance chromatography (HPLC) to consist of Asp, Gly, His, Tyr, Val, Leu, Phe, Trp and Lys.

alfalfa leaf protein; optimization of enzymatic hydrolysis conditions; antioxidant peptide purification; amino acid composition; percentage scavenging; response surface methodology

10.7506/spkx1002-6630-201714041

TS201.1

A

1002-6630（2017）14-0263-07

劉龍, 張煒, 陳元濤, 等. 紫花苜蓿葉蛋白制備抗氧化肽酶解條件優(yōu)化及氨基酸組成分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 263-269.

10.7506/spkx1002-6630-201714041. http://www.spkx.net.cn

LIU Long, ZHANG Wei, CHEN Yuantao, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis conditions for the preparation of antioxidant peptides and amino acid composition analysis from alfalfa leaf protein[J]. Food Science, 2017, 38(14): 263-269. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714041. http://www.spkx.net.cn

2017-04-14

青海省基礎(chǔ)研究計(jì)劃項(xiàng)目（2017-ZJ-712）

劉龍（1989—），男，碩士研究生，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離與提取。E-mail：906297945@qq.com

*通信作者：張煒（1972—），女，教授，碩士，研究方向?yàn)樘烊划a(chǎn)物分離與提取。E-mail：zhangwei@qhnu.edu.cn