劉海梅，陳 靜，安孝宇，趙 芹，郭青君，車欣欣，崔 云

（魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025）

牡蠣酶解工藝參數(shù)優(yōu)化及其產(chǎn)物分析與評價

劉海梅，陳 靜，安孝宇，趙 芹，郭青君，車欣欣，崔 云

（魯東大學食品工程學院，山東 煙臺 264025）

采用Protemax復合蛋白酶水解牡蠣肉，以水解度為指標，優(yōu)化酶解時間、加酶量和酶解溫度等酶解工藝參數(shù)，通過氮溶解指數(shù)（nitrogen solubility index，NSI）、三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-NSI、氨基酸評分、化學評分、必需氨基酸指數(shù)評價酶解產(chǎn)物的溶解性能及營養(yǎng)品質。最優(yōu)酶解工藝參數(shù)為加酶量30 AU/kg、酶解溫度55 ℃、酶解時間4 h，水解度達到27.28%。酶解液中18 種氨基酸種類齊全，鮮味氨基酸含量豐富，Glu含量最高，必需氨基酸含量占總氨基酸含量的39.5%，必需氨基酸含量豐富，營養(yǎng)價值高。pH值為4.0～7.0時，酶解液的NSI達到83%以上，且TCA-NSI高達88.64%，酶解液具有高溶解性能。

牡蠣；Protemax復合蛋白酶；水解度；氮溶解指數(shù)；營養(yǎng)評價

牡蠣又名生蠔，是我國主要的經(jīng)濟貝類之一，也是我國四大養(yǎng)殖貝類之一[1]，營養(yǎng)價值高，富含蛋白質，含有一定量的多不飽和脂肪酸、維生素、?；撬峒颁\、硒、鐵、鈣、錳等礦物質，是一種高蛋白的食品[2-4]。牡蠣蛋白質的氨基酸組成完全，必需氨基酸的完全程度和質量優(yōu)于人乳和牛乳，且含有豐富的谷氨酸、天冬氨酸、甘氨酸和丙氨酸等呈味氨基酸，因此牡蠣肉味道鮮美[2,5]，是制備海鮮調味料的良好原料。

天然海鮮調味品的呈味主要來源于氨基酸、呈味肽、核苷酸等呈味物質[6]。研究表明，多肽不僅能提升調味品的整體風味，且能提高必需氨基酸的利用率，增強產(chǎn)品的營養(yǎng)價值。相對于酸、堿法水解蛋白而言，酶法水解條件溫和，且專一性強，產(chǎn)品純度高，易于控制水解程度，產(chǎn)物無毒副作用。而采用酶解技術水解蛋白質時，蛋白酶的選擇至關重要，酶解產(chǎn)物中疏水性多肽的多少直接影響水解液的口感，使其具有苦味[7]。Protemax是一種復合蛋白酶，既有內切酶，也有外切酶，其即使在低水解度的情況下也不會產(chǎn)生苦味的蛋白水解物[8]，而且用Protamex復合蛋白酶處理較單一酶能使產(chǎn)品在色澤、形態(tài)等感官指標方面的品質更佳[9]。蛋白水解肽還具有抗氧化、降血壓等許多生物活性[10-11]，Wang Qiukuan等[12]利用枯草桿菌蛋白酶降解牡蠣蛋白得到了具有抗氧化活性的短肽，Wang Jiapei等[13]利用胃蛋白酶水解牡蠣蛋白得到了具有降血壓的短肽。因此，本研究采用Protemax復合蛋白酶酶解牡蠣肉，優(yōu)化酶解工藝參數(shù)，并對酶解產(chǎn)物進行氨基酸分析、營養(yǎng)評價，為牡蠣水解肽海鮮調味品的開發(fā)及生物活性研究提供理論參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

太平洋牡蠣（Crassostrea gigas） 煙臺振華量販魯東大學店。

Protemax復合蛋白酶（酶活力1.5 AU/g） 諾維信憶諾聯(lián)創(chuàng)生物科技（北京）有限公司。所有試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

K9840型凱式定氮儀 濟南海能儀器股份有限公司；DS-1高速組織搗碎機（轉速10 000～12 000 r/min）上海標本模型廠；Anke-5-A型離心機 上海安亭科學儀器廠；L-8900型高速氨基酸自動分析儀 日本日立集團。

1.3 方法

1.3.1 牡蠣酶解液制備的工藝流程

新鮮牡蠣→組織搗碎機搗碎→調整料液比1∶5（m/m）→沸水浴30 min→冷卻→調pH值→加蛋白酶→恒溫酶解→沸水浴滅酶15 min→冷卻→抽濾→酶解液

1.3.2 游離氨態(tài)氮含量的測定

采用中性甲醛滴定法[14]。

1.3.3 總氮含量的測定

采用凱氏定氮法[14]。

1.3.4 水解度的測定

用中性甲醛滴定法[14]和凱氏定氮法[14]分別測定水解液中游離氨態(tài)氮含量和原料的總氮含量，并按照式（1）[15]計算水解度：

1.3.5 氮溶解度指數(shù)（nitrogen solubility index，NSI）測定[16]

取一定量的酶解液，用2 mol/L的HCl或NaOH溶液調節(jié)pH值，靜置20 min后離心（4 000 r/min，20 min），然后測定上清液及酶解液中總氮含量，NSI按式（2）計算：

式中：N為上清液中總氮含量/g；N0為酶解液中總氮含量/g。

1.3.6 三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）-NSI測定[17]將酶解液與20% TCA溶液等體積混合振蕩，靜置20 min，于4 000 r/min離心20 min，取上清液測定總氮量，按式（3）計算TCA-NSI：

式中：N為上清液中總氮含量/g；N0為酶解液中總氮含量/g。

1.3.7 氨基酸組成的測定

樣品用6 mol/L鹽酸在110 ℃水解24 h，調制上機濃度，用氨基酸自動分析儀測定除色氨酸外的17 種氨基酸[18]，色氨酸采用可見分光光度法[14]測定。

1.3.8 酶解液中氨基酸品質的評價

根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（Food and Agriculture Organization/World Health Organization，F(xiàn)AO/ WHO）1973年建議的氨基酸評分標準模式[19]和全雞蛋蛋白的氨基酸模式[20]分別按式計算氨基酸評分（animo acids score，AAS）、化學評分（chemical score，CS）和必需氨基酸指數(shù)（essential animo acids index，EAAI）[21]。

式中：aa為實驗樣品每克蛋白質中氨基酸含量；AA為FAO/WHO評分模式中同種氨基酸含量；n為比較的氨基酸個數(shù)；a、b、c……j為酶解液中的必需氨基酸含量/（mg/g）；ae、be、ce……je為全雞蛋蛋白質的必需氨基酸含量/（mg/g）。

1.3.9 酶解工藝參數(shù)優(yōu)化正交設計

在單因素試驗和Protemax復合蛋白酶的適宜溫度基礎[22]上，選用L9（33）正交試驗對牡蠣酶解溫度、加酶量和酶解時間進行參數(shù)優(yōu)化，各因素水平設計見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of optimization parameters used in orthogonal array design

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SAS 8.1統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析處理及圖表的制作，方差分析的顯著性水平為P＜0.05，極顯著性水平為P＜0.01。

2 結果與分析

2.1 酶解條件的單因素試驗結果

2.1.1 加酶量的影響

牡蠣勻漿中分別添加10、20、30、40、50 AU/kg的Protemax復合蛋白酶，在自然pH值，于50 ℃恒溫酶解5 h，制備酶解液，并測定酶解液的水解度。牡蠣的水解度隨Protemax復合蛋白酶用量增加的變化趨勢見圖1。

圖1 Protemax復合蛋白酶用量對牡蠣水解度的影響Fig. 1 Effect of Protamex dosage on the degree of hydrolysis of oysters

蛋白酶用量對牡蠣的水解度具有顯著影響（P＜0.05），隨著加酶量的增加，水解度逐漸增加。當加酶量為10 AU/kg時水解度最低，為17.64%，繼續(xù)增加加酶量，水解度顯著增加，水解度隨加酶量增加一直呈顯著增加趨勢，當酶用量為40 AU/kg時，牡蠣的水解度最高，為25.22%。當牡蠣的蛋白質充足時，增加加酶量會促進蛋白質的水解，水解度增加，直至蛋白質幾乎完全從牡蠣中溶出，但是酶解底物的質量有限，過量添加的復合蛋白酶無法再將牡蠣蛋白質水解。隨著酶用量繼續(xù)增大，水解度趨于平緩，確定牡蠣酶解的適宜酶用量為40 AU/kg。

2.1.2 酶解時間的影響

牡蠣勻漿中添加40 AU/kg蛋白酶，在自然pH值，于50 ℃分別酶解1、2、3、4、5 h，制備酶解液，并測定酶解液的水解度。牡蠣的水解度隨酶解時間延長的變化趨勢見圖2。

酶解時間對水解度具有顯著影響（P＜0.05），隨著酶解時間的延長，水解度逐漸增加。當酶解時間為1 h時水解度最低，為24.66%，繼續(xù)延長酶解時間，水解度顯著增加，水解度隨酶解時間延長呈現(xiàn)顯著增加趨勢，當酶解時間為4 h時，牡蠣的水解度最高，為31.46%。由圖2可以看出，隨著酶解時間的繼續(xù)延長，牡蠣的水解度趨于平緩，最終確定牡蠣酶解的適宜酶解時間為4 h。

圖2 酶解時間對水解度的影響Fig. 2 Effect of hydrolysis time on the degree of hydrolysis

2.2 酶解工藝正交試驗結果及條件驗證

2.2.1 酶解工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗結果

表2 正交試驗設計及結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

酶解工藝參數(shù)優(yōu)化的正交試驗設計及結果見表2。由方差分析可知，酶解時間、酶解溫度、加酶量對水解度均具有極顯著的影響（P＜0.000 1），對水解度的影響次序大小為酶解時間＞酶解溫度＞加酶量。由極差分析可知，經(jīng)L9（33）正交試驗后，得到Protemax復合蛋白酶水解的最優(yōu)組合條件為加酶量30 AU/kg、酶解溫度55 ℃、酶解時間4 h。

2.2.2 最優(yōu)組合條件驗證

稱取一定量的新鮮牡蠣，經(jīng)攪碎、熱處理后，按照30 AU/kg的酶量加入牡蠣勻漿中，于55 ℃恒溫酶解4 h后，制備得到酶解液，測得牡蠣的水解度達到27.28%，高于正交試驗中的所有水解度。

2.3 牡蠣酶解液的溶解特性分析

2.3.1 牡蠣酶解液的NSI測定結果

量取酶解液10 mL，分別調節(jié)pH值為3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，測定上清液中的含氮量，并計算NSI值，結果見圖3。

圖3 酶解液在不同pH值的溶解性Fig. 3 Solubility of oyster hydrolysate at different pH values

牡蠣酶解液在pH 3.5～9.0范圍內的溶解性不同，NSI在pH 3.5～6.0范圍內呈下降趨勢，在pH6.0～9.0范圍內呈上升趨勢。在所測pH值范圍內，NSI均大于83%，當pH值在3.5、4.0、9.0，NSI大于90%，且pH值為6.0時，NSI最小，為83.89%。在食品pH 4.0～7.0范圍內，酶解液的NSI值在83.89%～90.73%之間，具有較高的溶解性。

2.3.2 TCA-NSI測定結果

經(jīng)TCA沉淀后，溶液中蛋白質與TCA締合形成微粒被脫除[23]，TCA-NSI的高低反映了酶解產(chǎn)物中肽鏈的長短，TCA-NSI越大，肽鏈越短。小肽和游離氨基酸作為小分子物質，其消化吸收能力高于大分子的蛋白質，酶解液的TCA-NSI越高說明所含的蛋白質分子含量越少。牡蠣經(jīng)酶解后其酶解液的TCA-NSI高達88.64%，說明在酶解液中蛋白質含量較少，酶解產(chǎn)物主要以游離氨基酸和小肽形式存在[24-25]，這種存在形式更有利于人體的消化吸收。多數(shù)蛋白酶解產(chǎn)物的TCA-NSI在85%～95%之間[26-31]。由此可推測，牡蠣酶解液的消化利用率較高，其營養(yǎng)價值高。

2.4 牡蠣酶解液的氨基酸組成及營養(yǎng)品質評價

2.4.1 氨基酸組成

由表3可知，牡蠣酶解液中存在18 種氨基酸，氨基酸種類齊全，其中必需氨基酸8種（Thr、Val、Met、Leu、Ile、Phe、Lys、Trp）、半必需氨基酸2 種（Cys、Tyr）、非必需氨基酸8種（Asp、Gly、Ala、Ser、Glu、Pro、Arg、His）?？偘被岷繛? 008.893 mg/100 mL，在18 種氨基酸中鮮味氨基酸的含量最為豐富，5種鮮味氨基酸（Asp、Glu、Gly、Ala、Arg）齊全，其中Glu含量最高，其含量為146.629 mg/100 mL，占鮮味氨基酸總量的34%，其次為Asp，再其次是Arg和Gly。而Glu、Asp、Gly是重要的鮮味氨基酸，由此可見水解液具有強烈的鮮美味，是良好的海鮮調味料基料。

2.4.2 牡蠣酶解液氨基酸營養(yǎng)品質評價

依據(jù)FAO/WHO建議的氨基酸評分標準模式和全雞蛋蛋白的氨基酸模式，分別計算出牡蠣酶解液中AAS、CS的數(shù)值（表4）。當以AAS為標準的時，Trp含量最高，是標準的1.82 倍，且第1限制性氨基酸為Val，第2限制性氨基酸為Leu。當以CS為標準時Trp含量最高是標準的1.07 倍，第1限制性氨基酸Val，第2限制性氨基酸Met+Cys。因此水解液中的主要限制性氨基酸為Val、Leu、Met+Cys。EAAI是評價蛋白質營養(yǎng)價值的常用指標之一，反映的是必需氨基酸與標準蛋白相接近的程度。酶解液的EAAI為62.827，表明必需氨基酸含量豐富，營養(yǎng)價值高。

表4 牡蠣酶解液中必需氨基酸的營養(yǎng)評價Table 4 Nutritional evaluation in terms of essential amino acids

3 結 論

采用Protemax復合蛋白酶水解新鮮牡蠣肉，通過L9（33）正交試驗優(yōu)化得到該酶的酶解工藝參數(shù)。加酶量、酶解時間和酶解溫度3 個因素對水解度均具有極顯著影響，Protemax復合蛋白酶的優(yōu)化酶解條件為加酶量30 AU/kg、酶解時間4 h、酶解溫度55 ℃，牡蠣酶解液的水解度達到27.28%。酶解液中氨基酸種類齊全，鮮味氨基酸含量豐富，酶解液具有強烈的鮮美味，是良好的海鮮調味料基料。必需氨基酸評分（AAS和CS）高于或接近FAO/WHO推薦的成人需求組成模式，符合成人對必需氨基酸的吸收比例要求，營養(yǎng)價值高。在食品pH 4.0～7.0范圍內具有較高的溶解性，且主要以游離氨基酸和小肽形式存在，可作為營養(yǎng)強化劑添加到食品中。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Oysters and Amino Acid Composition and Nutritional Quality of Oyster Hydrolysates

LIU Haimei, CHEN Jing, AN Xiaoyu, ZHAO Qin, GUO Qingjun, CHE Xinxin, CUI Yun
(School of Food Engineering, Ludong University, Yantai 264025, China)

The enzymatic hydrolysis of oysters with Protamex was optimized using one-factor-at-a-time and orthogonal array design methods. The independent variables were hydrolysis time, enzyme dosage and temperature, and the response was degree of hydrolysis. The solubility characteristics of oyster hydrolysates were evaluated by nitrogen solubility index (NSI), trichloroacetic acid-nitrogen solubility index (TCA-NSI), and the amino acid score (AAS), chemical score (CS) and essential amino acid index (EAAI) were measured for nutritional quality evaluation. The optimal hydrolysis parameters were determined as follows: enzyme dosage, 30 AU/kg; temperature, 55 ℃; and time, 4 h, yielding a degree of hydrolysis of up to 27.28%. The obtained hydrolysate contained 18 amino acids, being high in umami amino acids, with Glu being the most abundant and essential amino acids accounting for 39.5% of the total amino acids, suggesting high nutritional value. At pH 4.0–7.0, the NSI of the hydrolsate was over 83%, and TCA-NSI was as high as 88.64% indicating good solubility.

oyster; Protamex; degree of hydrolysis; nitrogen solubility index; nutritional evaluation

10.7506/spkx1002-6630-201714037

TS254.4

A

1002-6630（2017）14-0240-05

劉海梅, 陳靜, 安孝宇, 等. 牡蠣酶解工藝參數(shù)優(yōu)化及其產(chǎn)物分析與評價[J]. 食品科學, 2017, 38(14): 240-244.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714037. http://www.spkx.net.cn

LIU Haimei, CHEN Jing, AN Xiaoyu, et al. Optimization of enzymatic hydrolysis of oysters and amino acid composition and nutritional quality of oyster hydrolysates[J]. Food Science, 2017, 38(14): 240-244. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714037. http://www.spkx.net.cn

2016-10-14

山東省自然科學基金項目（ZR2015PC002）；山東省科技發(fā)展計劃項目（2012YD07013）

劉海梅（1979—），女，教授，博士，研究方向為水產(chǎn)品加工與綜合利用。E-mail：hellen_79@aliyun.com