葛雪筠，周德健，王 斌，陳 蔭*

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022）

響應(yīng)面法優(yōu)化中性蛋白酶提取苦竹花多糖及多糖性質(zhì)分析

葛雪筠，周德健，王 斌，陳 蔭*

（浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 舟山 316022）

目的：采用響應(yīng)面法優(yōu)化中性蛋白酶輔助提取苦竹花多糖的最優(yōu)條件，并對提取得到的粗多糖進行分離純化、理化性質(zhì)及體外抗氧化性測定。方法：在單因素試驗基礎(chǔ)上，考察提取時間、酶添加量、提取溫度對苦竹花粗多糖得率的影響。利用響應(yīng)面試驗建立數(shù)學(xué)模型，確定最佳提取條件?？嘀窕ù侄嗵墙?jīng)分離純化，獲取2 個組分，分別命名為SBH-1和SBH-2，其中以SBH-1為主要組分。通過高效凝膠滲透色譜和紅外光譜對SBH-1組分進行單糖組成、分子質(zhì)量及初步的結(jié)構(gòu)研究。通過與VC對比，研究苦竹花粗多糖SBH-1的體外抗氧化活性，即1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率、超氧陰離子自由基清除率及抗脂質(zhì)過氧化能力的測定。結(jié)果：在中性蛋白酶添加量0.83%，提取溫度46.68 ℃，提取時間115.95 min條件下，粗多糖得率為7.63%。經(jīng)檢測苦竹花粗多糖SBH-1組分分子質(zhì)量為18.3 kD，主要由甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）3 種單糖組成比例為1.3∶2.3∶1.2。SBH-1對DPPH自由基和超氧陰離子自由基清除EC50分別為2.03 mg/mL和1.038 mg/mL。結(jié)論：采用中性蛋白酶輔助提取得到的苦竹花粗多糖簡單易行，純化得到的中性雜多糖SBH-1具有很好的活性，為進一步研究和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

苦竹花；多糖；響應(yīng)面；體外抗氧化

苦竹花（Shiraia bambusicola Henn）為肉座菌科真菌竹黃的子座[1]，因被寄生的竹黃蜂叮咬洞后，于竹節(jié)之間貯積的傷流液，經(jīng)一段時間干涸凝結(jié)而成的塊狀物質(zhì)，具有祛風(fēng)除濕、活血舒經(jīng)、止咳的功效，常用于治療風(fēng)濕痹痛、四肢麻木、小兒百日咳、白帶過多等[2]功效。我國主要分布于長江流域及嶺南地區(qū)，在日本和斯里蘭卡也有相關(guān)報道[3-4]。本品宜于冬季采收，砍取竹稈，剖取竹黃，晾干，自然產(chǎn)出者甚少，目前各地大多采用火燒竹林的方法，使竹經(jīng)暴熱后，致使竹瀝溢在竹節(jié)之間而后凝固所得，然后剖取晾干。近年來，林海萍等[5]研究竹黃菌多糖有保護肝臟，治療慢性肝炎的功效。由此可見苦竹花作為真菌類中藥，其多糖類活性成分極具深入研究和開發(fā)價值。

在工藝提取方面，傳統(tǒng)熱水提取耗時長、能耗大、效率低，堿提法和酸提法易使多糖糖苷鍵發(fā)生斷裂，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和活性改變。近年來，酶工程技術(shù)成為一種新方法，相較傳統(tǒng)法具有高效、節(jié)能等特點，且已經(jīng)廣泛用于動植物有效成分的提取[6-8]。閆培生等[9]研究6 種不同生物酶對發(fā)酵菌絲體多糖的提取效果，結(jié)果表明性價比最高的是中性蛋白酶，其反應(yīng)條件溫和且能更好的保持多糖結(jié)構(gòu)和活性。故本實驗在工藝提取方面通過響應(yīng)面法優(yōu)化中性蛋白酶輔助提取苦竹花多糖，選取最佳提取工藝條件，并對苦竹花主要組分的抗氧化活性進行初步研究。對今后苦竹花多糖的功能性研究提供一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦竹花產(chǎn)自安徽黃山地區(qū)；葡聚糖系列標準品（分子質(zhì)量6.1、9.6、21、47.1、107、194 kD） 中國食品藥品檢定研究院；中性蛋白酶（酶活力≥60 000 U/g）、丙酮、甲醇、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、VC、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、濃鹽酸、鄰苯三酚、無水乙醇、鐵氰化鉀、三氯乙酸、氯化鐵、單糖標準品（甘露糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、氨基半乳糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、巖藻糖）均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒儀器有限公司；HH-1恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀日本Eyela公司；TGL-16M高速離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；UV-1800PC紫外-可見分光光度計上海美譜達儀器有限公司；FreeZone冷凍干燥機美國Labconco公司；KP-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm， 5 ?m） 中冉科技發(fā)展有限公司；1260型高效液相色譜儀 美國Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 粗多糖的提取

將苦竹花粉碎后，置于索氏提取器內(nèi)，經(jīng)石油醚（沸程30～60 ℃）反復(fù)脫脂12 h。將脫脂后的苦竹花放于電熱鼓風(fēng)干燥箱中烘干。取干燥后的苦竹花粉末按料液比1∶20（g/mL）加入蒸餾水，按照實驗設(shè)計酶解條件提取。經(jīng)升溫使酶失活后將水提物于8 000 r/min離心15 min，棄殘渣，留上清液。上清液濃縮后，經(jīng)Sevag法[10]除去游離蛋白后再加入5 倍體積無水乙醇，并于4 ℃冰箱醇沉過夜，抽濾得粗多糖。粗多糖復(fù)溶于蒸餾水后在透析袋中（截留分子質(zhì)量3 500 D）透析72 h，以脫去其中的鹽等小分子物質(zhì)。最后透析后的樣品經(jīng)冷凍干燥后即得苦竹花粗多糖。按公式（1）計算粗多糖得率：

1.3.2 單因素試驗設(shè)計

針對酶添加量、提取溫度和提取時間，3 個主要影響因素分別進行單因素試驗。固定料液比為1∶20（g/mL），每個單因素設(shè)定5 個變量，即酶添加質(zhì)量分數(shù)分別為0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%；提取溫度分別為25、30、35、40、45 ℃；提取時間分別為30、60、90、120、150 min。并利用Design Expert 8.0.6軟件對單因素試驗結(jié)果進行優(yōu)化。

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用三因素三水平利用Box-Behnken模型，以表現(xiàn)顯著的酶添加量、提取溫度和提取時間3 個因素為自變量，苦竹花粗多糖提取率（Y）為響應(yīng)值，如表1所示。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計因素與水平Table 1 Box-Behnken test factors and the level of design

1.3.4 苦竹花多糖的分離純化

將苦竹花粗多糖溶于純水中，配成約75 mg/mL溶液。溶液經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾后，選用Q Sepharose Fast Flow柱層析（5.5 cm×30 cm），分別經(jīng)0.1、0.25、0.5、0.75、1、2 mol/L NaCl溶液進行梯度洗脫。洗脫液經(jīng)硫酸-苯酚法反應(yīng)后于490 nm波長處測吸光度，繪制洗脫曲線。根據(jù)繪制的線性洗脫曲線可以得到多糖洗脫的主要濃度，然后根據(jù)該洗脫的NaCl溶液濃度再進行進一步分段洗脫分離。部分收集器收集洗脫液，用硫酸-苯酚法跟蹤檢測繪制洗脫曲線收集多糖主要組分，組分經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后透析脫鹽，最后凍干[11]。

1.3.5 單糖組成分析

多糖的完全酸水解：準確稱取5.0 mg純化后的多糖樣品并置于安瓿管中，加入1.0 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）溶液，經(jīng)酒精噴燈封管后置于110 ℃烘箱內(nèi)水解反應(yīng)8 h。水解反應(yīng)完全后將樣品用甲醇溶解并轉(zhuǎn)移到雞心瓶內(nèi)，用甲醇反復(fù)旋蒸以除去樣品中TFA，最后轉(zhuǎn)移至EP管中40 ℃烘干備用。

標準品溶液的配制：準確稱取等物質(zhì)的量干燥至恒質(zhì)量的10 種單糖標準品，加入純水充分溶解，將其配制成1.0 mg/mL的溶液。采用PMP柱前衍生高效液相色譜法[12]對等物質(zhì)的量配制的單糖標準品和多糖全水解后產(chǎn)物進行衍生，最后進行高效液相色譜分析。

色譜條件：KP-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm， 5m）；流動相：磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）（pH 6.7）-乙腈（82∶18，V/V）溶液；流速1 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量20 ?L；紫外檢測器波長254 nm。

1.3.6 苦竹花SBH-1多糖純度分析及分子質(zhì)量測定

采用高效凝膠滲透色譜法測定。色譜條件：Shodex Ohpak SB-804HQ凝膠色譜柱（300 mm×7.8 mm）；柱溫35 ℃；流動相為0.1 mol/L Na2SO4溶液；流速0.5 mL/min；檢測器為示差檢測器[13]。以標準葡聚糖分子質(zhì)量的對數(shù)（lg Mw）對色譜保留時間作圖，得標準曲線，計算樣品分子質(zhì)量。

1.3.7 紅外光譜分析

采用KBr壓片法。將少量苦竹花多糖樣品與經(jīng)干燥好的KBr粉末置于瑪瑙研缽中反復(fù)研磨至均勻，然后經(jīng)壓片機壓制成透明薄片，置于紅外光譜儀下測定。紅外光譜儀測定參數(shù)：背景掃描32 次；掃描范圍400～4 000 cm-1；分辨率4.0 cm-1；檢測器為（經(jīng)氘化處理）硫酸三甘肽晶體[14]。

1.3.8 體外抗氧化測定

1.3.8.1 DPPH自由基清除能力測定

準確稱取4 mg DPPH經(jīng)無水乙醇溶解后存放于棕色容量瓶中，溶液呈紫色。置于4 ℃冰箱內(nèi)保存。分別取不同質(zhì)量濃度梯度為0、0.5、1、2、3、4、5 mg/mL的樣品溶液1 mL于試管中，并加入4 mL 0.004% DPPH溶液，振蕩混勻后避光處理0.5 h。以無水乙醇為空白對照測定其在波長517 nm處吸光度A；以VC作為陽性對照；待測液中加入4.0 mL DPPH自由基溶液所測定吸光度為A1[15]。并按公式（2）計算DPPH自由基清除率，DPPH自由基清除率越大則表明苦竹花SBH-1的自由基清除能力越強。

試管中分別加入pH 8.2的50 mmol/L Tris-HCl緩沖液3 mL，分別取不同質(zhì)量濃度0、1、2、3、4、5 mg/mL的樣品1 mL。并將其置于25 ℃恒溫水浴鍋中反應(yīng)8 min，分別加入同樣預(yù)溫的30 mmol/L鄰苯三酚溶液200 μL，兩者混合均勻后精確反應(yīng)4 min，最后滴入0.5 mL濃鹽酸終止反應(yīng)[16]。在波長320 nm處測定吸光度，以等體積的Tris-HCl緩沖液作為空白，以VC作為陽性對照。O2-·清除率按公式（3）計算：

式中：A0為Tris-HCl緩沖液吸光度；A1為加樣品吸光度；A2為Tris-HCl緩沖液、鄰苯三酚溶液（未加樣品）吸光度。

1.3.8.3 抗脂質(zhì)過氧化能力

卵黃懸浮液的配制：0.1 mol/L PBS（pH 7.45）-卵黃（25∶1，V/V）溶液。吸取懸浮液0.8 mL加入到不同濃度1 mL的樣品溶液中，同時加入0.4 mL FeSO4溶液（24 mmol/L），置于37 ℃水浴鍋中60 min。完成后加入1 mL 20%三氯乙酸溶液和1 mL 0.8%硫代苯巴比妥酸溶液。沸水精確反應(yīng)15 min后離心[17]。于波長532 nm處測定吸光度，以VC作為陽性對照。樣品清除率按公式（4）計算：

式中：A為樣品吸光度；A0為不加樣品吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 酶添加量對粗多糖得率的影響

圖1 酶添加量對粗多糖得率的影響Fig. 1 Effect of enzyme concentration on the extraction efficiency of polysaccharide

由圖1可以看出，隨著酶添加量的增加，粗多糖得率提高。因為中性蛋白酶酶解了與多糖結(jié)合的蛋白質(zhì)，從而將多糖更多地釋放出來故提高了粗多糖得率。但當(dāng)酶添加量超過0.8%時，曲線趨于平緩，說明中性蛋白酶已達到飽和狀態(tài)。所以選擇酶最佳添加量為0.8%。

2.1.2 提取溫度對粗多糖得率的影響

圖2 提取溫度對粗多糖得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of polysaccharide

由圖2可以看出，提取溫度對粗多糖得率影響較大，提取溫度在45 ℃時，得率達到最大。但當(dāng)提取溫度超過45 ℃時得率下降明顯，由于高溫破壞了酶的活性，引起得率降低。因此選取最佳提取溫度為45 ℃。

2.1.3 提取時間對粗多糖得率的影響

圖3 提取時間對粗多糖得率的影響Fig. 3 Effect of extraction times on the extraction efficiency of polysaccharide

由圖3可以看出，隨著提取時間的延長，粗多糖得率呈現(xiàn)上升趨勢，但是當(dāng)提取時間超過120 min時，粗多糖得率下降，因為提取時間過長而引起多糖結(jié)構(gòu)變化使得粗多糖得率下降[18]。所以選擇最佳提取時間為120 min。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果及方差分析

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Experimental design with experimental and predicted results for response surface analysis

利用Design Expert 8.0.6通過表2中苦竹花粗多糖得率試驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，獲得苦竹花粗多糖得率對編碼自變量酶添加量、提取溫度和提取時間的二次多項回歸方程[19-20]：Y=7.32+0.19X1+1.69X2-

3 回歸模型方差分析Table 3 ANOVA for the response surface model

如表3所示，模型P值為0.002 3，說明模型顯著。R2為0.971 7，失擬項P值為0.168 6不顯著，表明試驗方法可靠，模型擬合程度良好，可以用此模型對中性蛋白酶輔助提取苦竹花多糖得率進行分析和預(yù)測[21-22]。各試驗因素對指標的重要性可由F值的大小體現(xiàn)出，F(xiàn)值越大表明對試驗指標越重要[23]。試驗因素的影響順序為X2＞X1＞X3。

2.2.2 各因素之間交互作用及優(yōu)化

圖4 響應(yīng)面交互作用對粗多糖得率的影響Fig. 4 Response surface plots showing the effects of extraction parameters on the yield of crude polysaccharide

根據(jù)二次模型所做的響應(yīng)面可評價試驗因素對苦竹花粗多糖得率的兩兩交互作用，以及確定各因素的最佳水平范圍。橢圓或圓形的等高線圖分別表示兩因素間交互作用的強或弱[24-25]，如圖4所示。通過Design-Expert V8.0.6分析得到最佳粗多糖提取條件為中性蛋白酶酶添加量0.83%、提取溫度46.68 ℃、提取時間115.95 min，粗多糖得率為7.63%。隨后進行3 次最佳條件的驗證實驗，在酶添加量0.83%、提取溫度46 ℃、提取時間115 min條件下，所得粗多糖得率平均值為7.4%與預(yù)測值相對誤差為2.88%，說明結(jié)果可靠。

2.3 苦竹花多糖的分離純化

圖5 苦竹花多糖Q Sepharose fast flow層析柱上的梯度洗脫圖Fig. 5 Gradient elution of the crude polysaccharides adsorbed onto Q Sepharose fast flow

采用0～2 mol/L不同梯度的NaCl溶液進行線性洗脫后進行梯度洗脫，繪制苦竹花多糖的梯度洗脫曲線，如圖5所示。主要有2 個多糖洗脫組分組成。根據(jù)各峰對應(yīng)的NaCl溶液濃度確定苦竹花粗多糖的洗脫條件，分別為0、0.1 mol/L NaCl溶液2 個梯度，分別將這2 個組分命名為SBH-1、SBH-2，尤以第1組分即蒸餾水洗脫下來的組分最多。所以本實驗主要針對組分SBH-1進行研究。收集組分SBH-1，旋蒸濃縮后，經(jīng)72 h透析后除去鹽分，最后濃縮凍干。

2.3.1 單糖組成分析

圖6 單糖標準品（A）和SBH-1（B）的PMP柱前衍生高效液相色譜圖Fig. 6 HPLC chromatograms of the PMP pre-column derivatives of monosaccharide standards and SBH-1

如圖6所示，苦竹花多糖由甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）、半乳糖（Gal）3 種單糖組成比例為1.3∶2.3∶1.2。葉淳渠等[26]研究的竹黃SB-Ⅰ和SB-Ⅱ單糖組成分別為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖。陳佳佳等[27]研究竹黃子實體中BPS-1單糖組成為葡萄糖和甘露糖。本實驗測得SBH-1的單糖組成鮮見國內(nèi)文獻報道。

2.3.2 多糖純度及分子質(zhì)量測定

圖7 SBH-1高效凝膠滲透色譜圖Fig. 7 HPGPC chromatogram of SBH-1

利用高效凝膠滲透色譜法，測定純度的同時根據(jù)已知分子質(zhì)量的葡聚糖出峰時間即可推算出多糖的分子質(zhì)量。如圖7所示，SBH-1的出峰時間為16.817 min且呈現(xiàn)單一對稱狹窄的峰，表明SBH-1純度較高，有助于進行下一步的分析。根據(jù)回歸方程y=-0.331 7x+9.840 4（R2=0.990 8）計算可得SBH-1分子質(zhì)量為18.3 kD。

2.3.3 紅外光譜分析

圖8 SBH-1紅外吸收光譜Fig. 8 IR spectrum of SBH-1

如圖8所示，在3 423 cm-1有很強的O—H伸縮振動特征吸收帶；在2 934 cm-1處是糖類C—H伸縮振動吸收峰；1 632 cm-1處可能為結(jié)合水的吸收峰；1 037cm-1處為C—O—C的吸收峰。840 cm-1可能為多糖的α構(gòu)型[28]。2.4 苦竹花多糖SBH-1的體外抗氧化活性分析

DPPH自由基清除模型，廣泛應(yīng)用于物質(zhì)清除自由基能力的定量分析[29]，在波長517 nm處測定吸光度越大則表明清除能力越強。雖然超氧陰離子自由基在有機體中相對為弱的氧化劑，但在體內(nèi)可由歧化反應(yīng)等產(chǎn)生過氧化物及羥自由基，對DNA及細胞膜造成一定損害引起一系列有害的生化反應(yīng)[30-31]。

2.4.1 DPPH自由基清除能力

圖9 SBH-1對DPPH自由基清除曲線Fig. 9 DPPH radical scavenging capacity of SBH-1

由圖9可知，DPPH自由基清除率隨苦竹花多糖SBH-1的質(zhì)量濃度的增大而增大，呈現(xiàn)量效關(guān)系。并且在質(zhì)量濃度為4 mg/mL時清除率就已經(jīng)達到88.1%。根據(jù)回歸方程y=21.763X+5.922 9計算得EC50為2.03 mg/mL。說明苦竹花多糖有很好的自由基清除能力。

2.4.2 苦竹花多糖SBH-1對O2-·的清除能力

由圖10可知，苦竹花多糖在質(zhì)量濃度為1 mg/mL時清除率已經(jīng)達到57.0%，且隨著質(zhì)量濃度的提高清除能力也呈上升趨勢。根據(jù)回歸方程y=0.179 01X+0.314 1可得苦竹花多糖EC50為1.038 mg/mL?？梢娍嘀窕ǘ嗵蔷哂休^好的O2-·清除能力。

圖10 SBH?的清除曲線Fig. 10 Superoxide anion radical scavenging capacity of SBH-1

2.4.3 苦竹花多糖SBH-1的抗脂質(zhì)過氧化能力

圖11 SBH-1的抗脂質(zhì)過氧化能力Fig. 11 Effect of SBH-1 against lipid peroxidation

如圖11所示，SBH-1的抗脂質(zhì)過氧化能力隨著SBH-1質(zhì)量濃度增加而增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為8 mg/mL時，清除率達到47.1%，且還呈上升趨勢?？梢奡BH-1有一定的抗脂質(zhì)過氧化能力。

3 結(jié) 論

本實驗在單因素試驗基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面對苦竹花進行酶法提取多糖條件優(yōu)化，當(dāng)中性蛋白酶添加量0.83%、提取溫度46.68 ℃、提取時間115.95 min條件下，粗多糖得率為7.63%。且實驗中經(jīng)過分離純化得到苦竹花多糖的主要組分SBH-1主要含甘露糖（Man）、葡萄糖（Glc）和半乳糖（Gal）3 種單糖組成，分子質(zhì)量為18.3 kD。SBH-1具有較強的自由基清除能力，可以作為潛在的多糖來源抗氧化劑。本實驗為進一步深入研究食藥兩用類真菌苦竹花多糖，提供了一定的理論依據(jù)。

[1] 梁曉輝, 蔡宇杰, 廖翔儒, 等. 藥用真菌竹黃的研究進展[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報, 2008, 27(5): 21-26. DOI:10.3321/ j.issn:1673-1689.2008.05.004.

[2] 鐘樹榮, 趙海, 李安明, 等. 一種尚待開發(fā)的中藥: 竹黃[J]. 中草藥, 2002, 33(4): 372-374. DOI:10.3321/j.issn:0253-2670.2002.04.041.

[3] 賈小明, 徐曉紅, 莊百川, 等. 藥用竹黃菌的生物學(xué)研究進展[J]. 微生物學(xué)通報, 2006, 33(3): 147-150. DOI:10.3969/ j.issn.0253-2654.2006.03.029.

[4] CHENG T F, JIA X M, MA X H, et al. Phylogenetic study on Shiraia bambusicola by rDNA sequence analyses[J]. Journal of Basic Microbiology, 2004, 44(5): 339-350. DOI:10.1002/jobm.200410434.

[5] 林海萍, 陳聲明, 陳超龍. 一種值得開發(fā)利用的藥用真菌: 竹黃[J]. 浙江林業(yè)科技, 2002, 22(1): 77-80. DOI:10.3321/j.issn:0253-2670.2002.04.041.

[6] 陳麗安, 張鳴鏑. 兩步酶法提取玉米胚芽蛋白的工藝研究[J]. 食品工業(yè)科技, 2014, 35(1): 219-226.

[7] 陳煉紅, 楊麗珠, 索化夷, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化松茸多糖酶法提取工藝及其體外抗氧化分析[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(16): 23-28. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201416005.

[8] 曾柏全, 周小芹, 解西玉. 纖維素酶-微波法提取臍橙皮橙皮苷工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2010, 31(4): 85-89.

[9] 閆培生, 馬麗雅, 朱國振, 等. 荷葉離褶傘液體發(fā)酵及生物酶法提取菌絲體多糖的研究[J]. 中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報, 2010, 12(4): 84-89. DOI:10.3969/j.issn.1008-0864.2010.04.16.

[10] 姜虹, 李新龍, 李海平, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化淫羊藿多糖超聲提取工藝研究[J]. 長春師范學(xué)院學(xué)報(自然科學(xué)版), 2013, 32(1): 59-64. DOI:10.3969/j.issn.1008-178X(z).2013.01.018.

[11] CHEN Y, MAO W, WANG B, et al. Preparation and characterization of an extracellular polysaccharide produced by the deep-sea fungus Penicillium griseofulvum[J]. Bioresource Technology, 2013, 132: 178-181. DOI:10.1016/j.biortech.2012.12.075.

[12] 戴軍, 朱松, 湯堅, 等. PMP柱前衍生高效液相色譜法分析杜氏鹽藻多糖的單糖組成[J]. 分析測試學(xué)報, 2007, 26(2): 206-210. DOI:10.3969/j.issn.1004-4957.2007.02.015.

[13] 殷秀紅, 趙峽, 張紫恒, 等. 紫貽貝多糖的提取、分離和基本理化性質(zhì)分析[J]. 中國海洋藥物雜志, 2011, 30(2): 12-17. DOI:10.13400/ j.cnki.cjmd.2011.02.007.

[14] 張惟杰. 糖復(fù)合物生化研究[M]. 2版. 杭州: 浙江大學(xué)出版社, 1999.

[15] SUN Y, ZHANG W, ZHENG T, et al. Hydrogen sulfide inhibits enzymatic browning of fresh-cut lotus root slices by regulating phenolic metabolism[J]. Food Chemistry, 2015, 169: 430-438. DOI:10.1016/j.foodchem.2015.01.065.

[16] CHANDRIKA L P, FEREIDOON S. Optimization of extraction of phenolic compounds from wheat using response surface methodology[J]. Food Chemistry, 2005, 93(1): 47-56. DOI:10.1016/ j.foodchem.2004.08.050.

[17] LIU Xin, SUN Zhengliang, ZHANG Miansong, et al. Antioxidant and antihyperlipidemic activities of polysaccharides from sea cucumber Apostichopus japonicus[J]. Carbohydrate Polymers, 2012, 90(4): 1664-1670. DOI:10.1016/j.carbpol.2012.07.047.

[18] 翟為, 張美雙, 張莉霞, 等. 復(fù)合酶法提取海帶多糖工藝優(yōu)化[J]. 食品科學(xué), 2012, 33(18): 6-9.

[19] 黃璞, 謝明勇, 聶少平, 等. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化微波輔助提取黑靈芝孢子多糖工藝研究[J]. 食品科學(xué), 2007, 28(10): 200-203. DOI:10.3321/ j.issn:1002-6630.2007.10.044.

[20] HOU X J, CHEN W. Optimization of extraction process of crude polysaccharides from wild edible Bachu mushroom by response surface methodology[J]. Carbohydrate Polymers, 2008, 72(1): 67-74. DOI:10.1016/j.carbpol.2007.07.034.

[21] VAZQUEZ G, FREIRE M S, SANTOS J, et al. Optimization of polyphenols extraction from chestnut shell by response surface methodology[J]. Waste and Biomass Valorization, 2010, 1(1): 219-255. DOI:10.1007/s12649-010-9012-z.

[22] LIU Qidi, QIN Kunming, SHEN Baojia, et al. Optimization of the processing technology of Fructus Arctii by response surface methodology[J]. Chinese Journal of Natural Medicines, 2015, 13(3): 222-231. DOI:10.1016/S1875-5364(15)30008-X.

[23] 馬偉, 尹莉芳, 周建平, 等. Box-Behnken中心組合設(shè)計優(yōu)化甘草酸二銨緩釋片的處方[J]. 中草藥, 2008(10): 1486-1490. DOI:10.3321/ j.issn:0253-2670.2008.10.015.

[24] XU H, SUN L, SHI Y, et al. Optimization of cultivation conditions for extracellular polysaccharide and mycelium biomass by Morchella esculenta As51620[J]. Biochemical Engineering Journal, 2008, 39(1): 66-67. DOI:10.1016/j.bej.2007.08.013.

[25] 萬俊, 蔣愛民, 曲直, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化Camembert干酪加工工藝[J]. 現(xiàn)代食品科技, 2012, 28(7): 840-844. DOI:10.13982/ j.mfst.1673-9078.2012.07.027.

[26] 葉淳渠, 方積年. 竹黃多糖SB-Ⅰ及SB-Ⅱ的組成研究: Ⅰ.竹黃多糖SB-Ⅰ及SB-Ⅱ的檢定及克分子比測定[J]. 藥學(xué)學(xué)報, 1981, 16(7): 524-528. DOI:10.16438/j.0513-4870.1981.07.007.

[27] 陳佳佳, 扶教龍, 顧華杰, 等. 竹黃多糖BSP-1的組成和抗氧化活性分析[J]. 食品研究與開發(fā), 2008, 29(8): 120-122. DOI:10.3969/ j.issn.1005-6521.2008.08.034.

[28] SHINGEL K I. Determination of structural peculiarities of dextran, pullulan and γ-irradiated pullulan by Fourier-transform IR spectroscopy[J]. Carbohydrate Research, 2002, 337: 1445-1451. DOI:10.1016/S0008-6215(02)00209-4.

[29] SCHERER R, GODOY H T. Antioxidant activity index (AAI) by the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl method[J]. Food Chemistry, 2009, 112(3): 654-658. DOI:10.1016/j.foodchem.2008.06.026.

[30] 陳洋. 酶催化的類FENTON反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基及其對DNA損傷作用的電化學(xué)研究[D]. 武漢: 湖北大學(xué), 2012.

[31] 張晨晨, 劉俊, 潘會君, 等. 過量ROS/RNS引發(fā)的線粒體功能障礙與代謝性心血管病及中藥介入[J]. 中國中藥雜志, 2011, 36(17): 30-36. DOI:10.4268/cjcmm20111725.

Optimization of Neutroproteinase-Assistant Extraction of Polysaccharide from the Stroma of Shiraia bambusicola Henn by Response Surface Analysis and Characterization of the Extracted Polysaccharide

GE Xuejun, ZHOU Dejian, WANG Bin, CHEN Yin*
(College of Food and Pharmacy, Zhejiang Ocean University, Zhoushan 316022, China)

Objective: This study aimed to optimize the neutroproteinase-assisted extraction of polysaccharides from the stroma of Shiraia bambusicola Henn using response surface methodology (RSM) and to investigate the separation, purification, characterization and antioxidant activity of the polysaccharides. Methods: The effects of extraction time, enzyme concentration and extraction temperature on the yield of polysaccharides were examined by using one-factor-ata-time experiments. These extraction conditions were optimized through mathematical modeling. The crude extract was fractionated into two fractions: SBH-1 and SBH-2, with SBH-1 being among them. The monosaccharide composition, molecular mass and structure of SBH-1 were detected by high performance gel permeation chromatography (HPGPC) and infrared spectroscopy, respectively. The in vitro antioxidant activity was measured in comparison with VC by superoxide anion scavenging, 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) scavenging, and lipid peroxidation inhibition assays. Results: The maximum yield of crude polysaccharides of 7.63% was obtained at 115.95 min of extraction at 46.68 ℃ with 0.83% neutral proteinase. The molecular mass of SBH-1 was determined to be 18.3 kD, and its monosaccharide composition consisted of glucose, mannose, and galactose with a ratio of 1.3:2.3:1.2. The EC50values for scavenging of DPPH and superoxide anion radials were 2.03 and 1.038 mg/mL respectively. Conclusions: The neutroproteinase-assistant extraction procedure was simple and easy to operate. SBH-1 was a neutral heteropolysaccharide with high activity. This study can provides a theoretical basis for further research and development of polysaccharides from S. bambusicola Henn.

Shiraia bambusicola Henn; polysaccharide; response surface methodology; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201714030

中圖分類號：Q946.3；TS201.2 文獻標志碼：A 文章編號：1002-6630（2017）14-0193-07

葛雪筠, 周德健, 王斌, 等. 響應(yīng)面法優(yōu)化中性蛋白酶提取苦竹花多糖及多糖性質(zhì)分析[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 193-199.

10.7506/spkx1002-6630-201714030. http://www.spkx.net.cn

GE Xuejun, ZHOU Dejian, WANG Bin, et al. Optimization of neutroproteinase-assistant extraction of polysaccharide from the stroma of Shiraia bambusicola Henn by response surface analysis and characterization of the extracted polysaccharide[J]. Food Science, 2017, 38(14): 193-199. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714030. http://www.spkx.net.cn

2016-10-10

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項目（41406142）；浙江省自然科學(xué)基金項目（21136000114）

葛雪筠（1990—），男，碩士研究生，研究方向為天然產(chǎn)物提取與應(yīng)用。E-mail：1184872992@qq.com

*通信作者：陳蔭（1984—），男，副教授，博士，研究方向為糖化學(xué)與糖工程學(xué)。E-mail：mojojo1984@163.com