周紅麗，李 莎，張 靈，蔣立文，譚興和,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

變溫發(fā)酵模式下豆瓣醬自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌多樣性研究

周紅麗1,2，李 莎1，張 靈1，蔣立文1,2，譚興和1,2,*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.食品科學(xué)與生物技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

通過(guò)DNA提取，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增以及高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同溫度發(fā)酵模式下的豆瓣醬中的細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析。結(jié)果表明：先低溫后高溫發(fā)酵模式下樣品得到了2 081 個(gè)操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU），而在先高溫后低溫模式中為1 870 個(gè)OTU。在門(mén)類(lèi)水平上，2 種發(fā)酵模式中的相對(duì)豐度值最高的均為厚壁菌門(mén)，分別為72.24%（先低溫后高溫）和43.84%（先高溫后低溫）；屬類(lèi)水平上為葡萄球菌屬，其相對(duì)豐度值分別為44.13%和32.52%。先低溫后高溫發(fā)酵模式下細(xì)菌物種的豐富度和多樣性普遍高于先高溫后低溫的發(fā)酵模式。

溫度模式；豆瓣醬；細(xì)菌；多樣性

傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬在我國(guó)具有悠久的歷史，因?yàn)槠洫?dú)特的生產(chǎn)工藝，以及發(fā)酵過(guò)程中包含的多種微生物種類(lèi)，賦予了傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬特有的風(fēng)味與功能。近年來(lái)，隨著傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品生產(chǎn)的現(xiàn)代化和產(chǎn)業(yè)化以及消費(fèi)者對(duì)食品安全的要求提高，傳統(tǒng)發(fā)酵豆瓣醬中的微生物多樣性逐漸成為研究熱點(diǎn)。

隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)，如高通量測(cè)序技術(shù)在食品微生物多樣性研究中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。利用分子生物學(xué)方法在分子水平上研究微生物的多樣性，可以將不同微生物在食品發(fā)酵過(guò)程中的消長(zhǎng)規(guī)律以及微生物的種群結(jié)構(gòu)展示出來(lái)，同時(shí)真實(shí)客觀地反映出傳統(tǒng)食品中微生物群落的組成結(jié)構(gòu)和功能[1-4]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、酵母菌和霉菌是豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中的主要菌種，其所占比例分別為細(xì)菌占38.46%、酵母菌占12.09%、霉菌占49.45%[5-10]，可見(jiàn)細(xì)菌在豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中擔(dān)當(dāng)重要角色。但有些細(xì)菌的存在會(huì)影響豆瓣醬成品品質(zhì)，具有潛在安全隱患，如枯草芽孢桿菌、糞鏈球菌以及微球菌等[11-16]。

通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵溫度模式下不同發(fā)酵時(shí)期的豆瓣醬進(jìn)行DNA提取，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增及高通量測(cè)序，研究不同發(fā)酵溫度模式下豆瓣醬細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)多樣性，從而為自然發(fā)酵條件下豆瓣醬的質(zhì)量安全提供有效保證和改進(jìn)措施。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶豆曲 湖南十三村食品有限公司。

Phusion High-Fidelity PCR Master Mix、DNA Library Prep Kit for Illumina（均為分析純） 紐英倫生物技術(shù)（北京）有限公司；產(chǎn)物回收試劑盒、100 bp DNA Ladder 天根生化科技（北京）有限公司；三氯甲烷、Tris-飽和酚、異丙醇、異戊醇（均為分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；Trans 15K Marker 北京全式金生物公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HC-1016高速離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；DZKW-D-2電熱恒溫水浴鍋 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司；Qubit DNA定量?jī)x 北京照生行儀器設(shè)備有限公司；7100梯度PCR儀 美國(guó)Bio-Rad公司；Hiseq2500高通量測(cè)序儀 美國(guó)Illumina基因測(cè)序儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 豆瓣醬的制作

采用不同的發(fā)酵模式，即傳統(tǒng)先高溫后低溫發(fā)酵溫度模式[16-18]和先低溫后高溫發(fā)酵溫度模式。按照湖南特色豆瓣成熟瓣子制作工藝制作成熟瓣子：成曲→加鹽水→拌曲→發(fā)酵→養(yǎng)護(hù)→成熟瓣子。2 組發(fā)酵所加鹽水量、拌曲方式和養(yǎng)護(hù)措施都一致，唯一不同的是發(fā)酵溫度模式不一樣。將湖南十三村食品有限公司所提供的蠶豆曲6 kg，分成A、B兩組，每組2 個(gè)平行，每個(gè)平行1 kg，將蠶豆曲與8%鹽和30%水按比例混合，放入密閉的玻璃容器中進(jìn)行發(fā)酵，用鹽將容器口密封，每2 d將蠶豆曲混勻一次，整個(gè)發(fā)酵階段為30 d。A組采取傳統(tǒng)的先高溫后低溫發(fā)酵溫度模式發(fā)酵：50 ℃ 10 d→40 ℃ 10 d→30 ℃ 10 d。B組采用先低溫后高溫模式發(fā)酵：30 ℃ 10 d→40 ℃ 10 d→50 ℃ 10 d。本實(shí)驗(yàn)取發(fā)酵第0、10、20、30天的4 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的樣品，并對(duì)其進(jìn)行編號(hào)（表1）。

表1 樣品編號(hào)Table 1 Numbers of samples used in this study

1.3.2 不同發(fā)酵模式下不同發(fā)酵時(shí)期豆瓣醬微生物DNA的提取

吸取1 000 μL十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）裂解液至2.0 mL EP管里加入溶菌酶，將適量的豆瓣醬樣品加入裂解液中，65 ℃水浴，倒置搖晃使其混合均勻，保證樣品可以完全裂解。離心取上清液，加酚（pH 8.0）∶氯仿∶異戊醇（25∶24∶1，V/V），顛倒使其混合均勻，12 000 r/min離心10 min。將氯仿-異戊醇（24∶1，V/V）加入上清液中，顛倒使其混合均勻，12 000 r/min離心10 mim。吸取上清液1.5 mL加入離心管里，加入異丙醇，上下?lián)u晃，-20 ℃條件下沉淀。12 000 r/min離心10 min，將液體倒出，盡量避免倒出沉淀。用1 mL 75%乙醇溶液洗滌2 次。加入ddH2O溶解DNA樣品，必要時(shí)可于55～60 ℃孵育10 min助溶。加RNaseA 1 μL消化RNA，在37 ℃放置15 min[19-21]。將適量的樣品用無(wú)菌水稀釋到1 ng/μL后放置于離心管中，用于檢測(cè)樣品DNA的濃度和純度。

1.3.3 PCR擴(kuò)增[22-23]

將稀釋后的DNA上清液作為模版，使用帶Barcode的特異引物對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16S V4區(qū)引物為515F-806R；ITS1區(qū)引物為ITS5-1737F、ITS2-2043R。其PCR體系（30 μL）為：15 μL 2×Phusion Master Mix、 3 μL 6 μmol/L Primer、10 μL 1 ng/μL DNA、2 μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性1 min；98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。

1.3.4 PCR產(chǎn)物的處理

對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的濃度進(jìn)行等濃度混樣，在充分混合均勻后，使用2%的瓊脂糖膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，選擇主帶大小在400～450 bp之間的序列，割膠回收目標(biāo)條帶。

1.3.5 豆瓣醬樣品測(cè)序

由天津諾禾致源生物信息科技有限公司測(cè)定。利用試劑盒構(gòu)建文庫(kù)，使用HiSeq對(duì)經(jīng)過(guò)Qubit定量和文庫(kù)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

1.3.6 豆瓣醬細(xì)菌測(cè)序數(shù)據(jù)分析

通過(guò)Uparse等相關(guān)軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析[10-14]，當(dāng)豆瓣醬樣品序列間的相似性大于97%時(shí)就可以判定為同樣的操作分類(lèi)單元（operational taxonomic unit，OTU）。根據(jù)OTUs聚類(lèi)結(jié)果，一方面對(duì)每個(gè)OTU的代表序列做物種注釋?zhuān)瑥亩玫较鄬?duì)應(yīng)的細(xì)菌菌落物種信息，以及菌落物種的豐度分布情況。同時(shí)，通過(guò)計(jì)算分析OTUs豐度以及Alpha多樣性，從而得到豆瓣醬樣品內(nèi)菌落物種的豐富度信息、不同樣品之間或分組之間共有和特有OTUs信息等。另一方面，可以對(duì)OTUs進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，并進(jìn)一步得到豆瓣醬不同樣品和分組的群落結(jié)構(gòu)差異，通過(guò)主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，PCoA）和主成分分析（principal compoments analysis，PCA）、非度量多維尺度分析（non-metric multi-dimensional scaling，NMDS）等降維圖和樣品聚類(lèi)樹(shù)進(jìn)行展示。

2 結(jié)果與分析

2.1 豆瓣醬微生物DNA提取及PCR擴(kuò)增

圖1 豆瓣醬微生物總DNA提取電泳圖Fig. 1 Electrophoretogram of total bacterial DNA extracted from soybean paste

圖2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig. 2 Electrophoretogram of PCR amplified products

圖1 為不同發(fā)酵溫度模式下不同發(fā)酵時(shí)間14 個(gè)豆瓣醬樣品總DNA提取的電泳圖，可以看出所提取DNA的純度符合下一步PCR擴(kuò)增模板的要求，可以進(jìn)行下一步的擴(kuò)增操作。以樣品總DNA作為模板，使用16S rDNA引物進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果如圖2所示，PCR產(chǎn)物目的條帶大小正確，條帶明顯，無(wú)拖尾片段，總量滿(mǎn)足2 次或者2 次以上建庫(kù)需要，可進(jìn)行后續(xù)建庫(kù)。

2.2 不同溫度發(fā)酵模式下豆瓣醬細(xì)菌序列分析

圖3 各樣品的OTUs聚類(lèi)和注釋情況統(tǒng)計(jì)Fig. 3 Statistics of OTUs clustering and taxonomic annotation for all samples

通過(guò)對(duì)V3～V4區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，所得到的14 個(gè)樣品的拼接序列總數(shù)是688 937 條，有效Tags數(shù)目達(dá)到98.94%，總檢測(cè)到OTUs數(shù)為3 645。每個(gè)樣品的有效序列數(shù)量和OTU數(shù)量如圖3所示。由圖3可以看出，不管是在先高溫后低溫發(fā)酵模式下，還是先低溫后高溫發(fā)酵模式下，自然發(fā)酵的豆瓣醬中微生物種類(lèi)較多，物種豐富，這給豆瓣醬風(fēng)味的形成奠定了基礎(chǔ)，但同時(shí)也可能存在安全隱患。

圖4 細(xì)菌群稀釋曲線Fig. 4 Rarefaction curves of bacterial colonies

從圖4可知，當(dāng)測(cè)序量低于10 000時(shí)，每個(gè)樣品的OTU數(shù)目呈顯著上升的趨勢(shì)，說(shuō)明在此測(cè)序量上樣品物種的多樣性較高，也就是說(shuō)還有較多的物種沒(méi)有被檢測(cè)到。但測(cè)序數(shù)量逐漸增加時(shí)，各豆瓣醬樣品中細(xì)菌的OTU數(shù)目呈緩慢增加，最后在測(cè)序量達(dá)到40 000時(shí)達(dá)到一個(gè)較為飽和的狀態(tài)，說(shuō)明在此測(cè)序量上細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相對(duì)可信度比較高，可以較為真實(shí)地反映出豆瓣醬發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌群落。

2.3 不同發(fā)酵溫度模式下樣品細(xì)菌類(lèi)群分析

在不同的發(fā)酵溫度模式下，不同發(fā)酵時(shí)期的樣品之間的群落差異相對(duì)較大，通過(guò)在目、科、屬水平上對(duì)細(xì)菌群落進(jìn)行分析，從而了解不同時(shí)期豆瓣醬細(xì)菌群落之間的差異。

圖5 目水平上物種的相對(duì)豐度柱形圖Fig. 5 Relative abundance of bacterial species at the order level

由圖5可知，在先低溫后高溫發(fā)酵模式下，芽孢桿菌目（Bacillales）的相對(duì)豐度在發(fā)酵第10天達(dá)到了85.47%。隨著溫度的上升，芽孢桿菌目的相對(duì)豐度呈平緩的下降趨勢(shì)，與此同時(shí)，乳桿菌目（Lactobacillales）的相對(duì)豐度逐漸升高，達(dá)到了32.18%。而在先高溫后低溫發(fā)酵模式下，乳桿菌目的相對(duì)豐度隨著溫度的降低而呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，同時(shí)，腸桿菌目的相對(duì)豐度隨著溫度的變化逐漸升高至56.28%。假單胞菌目（Pseudomonadales）、放線菌目（Actinomycetales）、梭菌目（Clostridiales）、根瘤菌目（Rhizobiales）、立克次體目（Rickettsiales）也在樣品中存在。

圖6 科水平上物種的相對(duì)豐度柱形圖Fig. 6 Relative abundance of bacterial species at the family level

從圖6可知，隨著發(fā)酵溫度的逐漸上升，葡萄球菌科（Staphylococcaceae）在各樣品中的相對(duì)豐度逐漸降低。而腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的相對(duì)豐度逐漸上升至17.71%。當(dāng)溫度逐漸下降時(shí)，腸桿菌科的相對(duì)豐度上升至56.29%。每個(gè)樣品中還包括了腸球菌科（Enterococcus）、莫拉氏菌科（Moraxellaceae）、芽孢桿菌科（Bacillaceae）、明串珠菌科（Leuconostocaceae）、棒狀桿菌科（Corynebacteriaceae）、乳酸桿菌科（Lactobacillaceae）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）、生絲微菌科（Hyphomicrobiaceae）。

由圖7可知，在2 種發(fā)酵模式中，隨著溫度的上升，葡萄球菌屬（Staphylococcus）的相對(duì)豐度呈下降趨勢(shì)，但在先低溫后高溫的發(fā)酵模式下葡萄球菌屬下降趨勢(shì)更明顯。而腸球菌屬（Enterococcus）的相對(duì)豐度逐漸上升至28.54%。當(dāng)溫度逐漸下降時(shí)，歐文氏菌屬（Erwinia）的相對(duì)豐度逐漸上升。腸球菌屬、歐文氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、腸桿菌屬（Enterobacter）、棒桿菌屬（Corynebacterium）均在各樣品中存在相應(yīng)的豐度。

圖7 屬水平上物種的相對(duì)豐度柱形圖Fig. 7 Relative abundance of bacterial species at the genus level

圖8 多樣品中特定物種分類(lèi)樹(shù)Fig. 8 Classification tree of bacterial species in multiple samples

通過(guò)圖8可知，在不同發(fā)酵溫度模式下，不同發(fā)酵時(shí)期的豆瓣醬中細(xì)菌的菌種在門(mén)水平上主要分為3 種，即厚壁菌門(mén)（Phylum Firmicutes）、放線菌門(mén)（Actinobacteria）和變形菌門(mén)（Proteobacteria），其相對(duì)豐度分別占細(xì)菌的62.61%、3.86%和33.53%。厚壁菌門(mén)又包括了芽孢桿菌綱和梭菌綱2 類(lèi)，相對(duì)豐度分別為62.12%和0.49%。一類(lèi)是梭菌綱、梭菌目、毛螺菌科、糞球菌屬。而另一類(lèi)是芽孢桿菌綱包括了芽孢桿菌目和乳桿菌目，其相對(duì)豐度分別為50.85%和11.28%。乳桿菌目又包括了腸球菌科、腸球菌和乳桿菌科、乳桿菌屬、瑞特乳酸菌（Lactobacillus reuteri）。同時(shí)，在芽孢桿菌目中葡萄球菌科、葡萄球菌屬、松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciuri）也占有一定的比例，而另一類(lèi)則為芽孢桿菌科、芽孢桿菌屬、克勞氏芽孢桿菌（Bacillus clausii）、黏瓊脂芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）。在放線菌門(mén)中的菌種為放線菌綱、放線菌目、棒狀桿菌科、棒狀桿菌屬。而在變形菌門(mén)、γ-變形菌綱中，包括了2 類(lèi)菌種，分別為腸桿菌目、腸桿菌科、克雷白氏桿菌屬（Klebsiella）、歐文桿菌屬、腸桿菌屬和假單胞菌目、莫拉菌科、不動(dòng)桿菌屬、約氏不動(dòng)桿菌（Acinetobacter johnsonii）。

從圖8可以看出，在先低溫后高溫的發(fā)酵模式中，不同發(fā)酵時(shí)期豆瓣醬中放線菌的比例要小于先高溫后低溫的發(fā)酵模式的，而在發(fā)酵后期，豆瓣醬中腸球菌、糞球菌屬以及不動(dòng)桿菌屬的相對(duì)豐度的比例要大于先高溫后低溫的發(fā)酵模式的菌種的比例。在發(fā)酵中期，發(fā)酵溫度達(dá)到了腸球菌、糞球菌屬以及不動(dòng)桿菌屬的適宜溫度，其相對(duì)豐度比例也就達(dá)到了最高，同時(shí)，腸桿菌的比例在先高溫后低溫模式發(fā)酵后期達(dá)到最多，這是由于此時(shí)的發(fā)酵溫度最適宜腸桿菌的生長(zhǎng)。

2.4 2 種發(fā)酵模式下發(fā)酵豆瓣醬細(xì)菌菌落的特征分析

PCoA是用來(lái)研究數(shù)據(jù)之間的差異性或相似性的一種可視化方法，通過(guò)分析PCoA可以觀察出豆瓣醬中菌落個(gè)體或群體之間的差異。每一個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)豆瓣醬樣本，同一個(gè)分組的樣本用相同的顏色來(lái)表示，2 個(gè)樣本的群落構(gòu)成差異越小在圖上反映出來(lái)就是兩點(diǎn)之間的距離越近。

圖9 基于Weighted Unifrac距離PCoAFig. 9 PCoA based on Weighted Unifrac distance

從圖9可知，在先高溫后低溫發(fā)酵模式下樣品XJ3和XJ5距離最近，說(shuō)明這2 個(gè)樣品的群落構(gòu)成差異較小，其微生物種類(lèi)的相似性較高。同時(shí)，每組之內(nèi)的2 個(gè)重復(fù)能夠聚在一起，說(shuō)明這幾組樣品內(nèi)重復(fù)性好，群落結(jié)構(gòu)存在一致性。在先低溫后高溫發(fā)酵模式下，XJ2與其他樣品的距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明這組樣品與其他樣品的群落構(gòu)成具有較大的差異。樣品XJ4和XJ6均在一個(gè)象限內(nèi)，所以其細(xì)菌菌落具有一定的相似性。

Alpha多樣性用于分析樣品內(nèi)的微生物群落多樣性，通過(guò)對(duì)單個(gè)樣品的多樣性進(jìn)行分析可以反映出樣品內(nèi)的微生物群落的多樣性和豐富度[24-30]。一般來(lái)說(shuō)，在97%以上的序列一致性下聚類(lèi)成為一個(gè)OTU的序列被認(rèn)為可能是源自于同一個(gè)種的序列。因此，對(duì)不同樣品在97%一致性閾值下的Alpha多樣性分析指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)如下（均一化時(shí)選取的數(shù)據(jù)量：臨界值為39 950）。

表2 Alpha指數(shù)統(tǒng)計(jì)Table 2 Alpha index statistics

從表2可知，在先低溫后高溫發(fā)酵模式中，樣品物種總數(shù)是呈上升趨勢(shì)，在發(fā)酵至第30天時(shí)，其物種總數(shù)達(dá)到最高，Chao1值為311.656。同時(shí)，其群落多樣性也升高，Shannon-Wiener值由發(fā)酵10d的2.621升至4.153，由此可見(jiàn)在發(fā)酵末期豆瓣醬樣品細(xì)菌的物種豐富度和群落多樣性均高于發(fā)酵前期及發(fā)酵中期。

在先高溫后低溫發(fā)酵模式中，樣品物種總數(shù)在發(fā)酵初期（0～10 d）呈上升趨勢(shì)，Chao1值由287.824上升至325.398。但是，樣品群落多樣性逐漸降低，Shannon-Wiener值由最初的3.713降至3.379。當(dāng)樣品發(fā)酵至中期（10～20 d）時(shí)，樣品物種總數(shù)逐漸降低，但其群落多樣性逐漸升高至3.571。隨后發(fā)酵至末期（20～30 d），樣品物種總數(shù)逐漸下降至212.150，群落多樣性也逐漸下降至2.816。

2.5 發(fā)酵豆瓣醬細(xì)菌菌落聚類(lèi)分析

通過(guò)對(duì)不同發(fā)酵溫度模式下不同發(fā)酵時(shí)期的豆瓣醬樣品進(jìn)行聚類(lèi)分析，并將聚類(lèi)結(jié)果與各樣品在門(mén)水平上的物種相對(duì)豐度整合展示，從而了解不同發(fā)酵時(shí)期豆瓣醬樣品間的相似性。

圖10 基于Weighted Unifrac距離的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)（先高溫后低溫）Fig. 10 UPGMA clustering tree based on Weighted Unifrac distance

由圖10可知，XJ3和XJ5處于同一個(gè)分支下，表明豆瓣醬中的細(xì)菌在這2 個(gè)時(shí)期間的相似度較高，同時(shí)，XJ7與XJ3、XJ5又處于同一分支下，即在先高溫后低溫發(fā)酵模式中，不同發(fā)酵時(shí)間所發(fā)酵的豆瓣醬中的細(xì)菌均具有一定的相似性。從圖10可以看出，在這3 個(gè)發(fā)酵時(shí)期豆瓣醬細(xì)菌中的優(yōu)勢(shì)菌落均為厚壁菌門(mén)和變形菌門(mén)，其次為藍(lán)藻細(xì)菌。但在發(fā)酵后期，即XJ7中，藍(lán)藻細(xì)菌的相對(duì)豐度有所減少。在先低溫后高溫發(fā)酵模式中，XJ4和XJ6處于同一個(gè)分支下，其中的優(yōu)勢(shì)菌落均為厚壁菌門(mén)，XJ1與XJ4和XJ6處于同一個(gè)分支下，但又與XJ2具有一定的距離，優(yōu)勢(shì)菌種為厚壁菌門(mén)，但其相對(duì)豐度與XJ4和XJ6相比有所減少，而變形菌門(mén)的相對(duì)豐度有所增加。XJ2與XJ4和XJ6具有一定得距離，說(shuō)明在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，發(fā)酵初期與發(fā)酵中、后期的菌落種群的相似性略低，其優(yōu)勢(shì)菌種是厚壁菌門(mén)，但其相對(duì)豐度要高于其他發(fā)酵時(shí)期。

圖11 基于Unweighted Unifrac距離的UPGMA聚類(lèi)樹(shù)（先低溫后高溫）Fig. 11 UPGMA clustering tree based on Unweighted Unifrac distance

由圖11可知，XJ2和XJ5處于同一分支下，說(shuō)明在先低溫后高溫發(fā)酵模式下發(fā)酵初期的菌落種群和在先低溫后高溫發(fā)酵發(fā)酵模式下發(fā)酵中期的菌落種群具有一定的相似性。其中的優(yōu)勢(shì)菌種均為厚壁菌門(mén)。XJ3和XJ6處于同一分支下，說(shuō)明這2 個(gè)階段的菌落種群具有一定的相似性，其優(yōu)勢(shì)菌種為厚壁菌門(mén)，其次是變形菌門(mén)、擬桿菌門(mén)和放線菌。在先高溫后低溫發(fā)酵模式中，XJ1和XJ7處于同一分支下，說(shuō)明這2 個(gè)階段的菌落種群具有一定的相似性，而與MJ3、MJ5在聚類(lèi)樹(shù)上有一定得距離，說(shuō)明在此發(fā)酵階段，發(fā)酵后期與發(fā)酵初、中期的細(xì)菌菌落種群具有一定的差異性。而在先低溫后高溫發(fā)酵模式下，各發(fā)酵階段的細(xì)菌菌落種群均具有一定的差異性。

3 結(jié) 論

通對(duì)不同發(fā)酵溫度模式下不同發(fā)酵時(shí)期的豆瓣醬樣品進(jìn)行DNA提取、PCR擴(kuò)增，運(yùn)用通高通量測(cè)序技術(shù)過(guò)對(duì)不同發(fā)酵模式下不同發(fā)酵時(shí)期的豆瓣醬細(xì)菌進(jìn)行了微生物多樣性分析。研究了2 種發(fā)酵模式下豆瓣醬物種的豐富度及其類(lèi)群分析，發(fā)現(xiàn)在先低溫后高溫發(fā)酵模式中，豆瓣醬細(xì)菌的物種豐富度相對(duì)高于傳統(tǒng)發(fā)酵模式下的菌種的豐富度。

通過(guò)DNA提取，PCR擴(kuò)增以及高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)不同溫度發(fā)酵模式下的豆瓣醬中的細(xì)菌進(jìn)行多樣性分析，得出了其中門(mén)綱目科屬中最大豐度排名前10的物種在各樣品中的分布情況。了解了主要物種在各樣品中的分布情況，發(fā)現(xiàn)樣品間的優(yōu)勢(shì)物種和各樣品中優(yōu)勢(shì)物種間的差異。結(jié)果表明：先低溫后高溫發(fā)酵模式下樣品得到了2 081 個(gè)OTU，而在先高溫后低溫模式中為1 870 個(gè)OTU。2 種發(fā)酵模式中的優(yōu)勢(shì)門(mén)均為厚壁菌門(mén)，其相對(duì)豐度值分別為72.24%（先低溫后高溫）和43.84%（先高溫后低溫）；此外，在各樣品中還發(fā)現(xiàn)了放線菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、泉古菌門(mén)、酸桿菌門(mén)、綠彎菌門(mén)、芽單胞菌門(mén)等。優(yōu)勢(shì)屬為葡萄球菌屬，其相對(duì)豐度值分別為44.13%和32.52%。同時(shí)，腸球菌屬、歐文氏菌屬、不動(dòng)桿菌屬、芽孢桿菌屬、腸桿菌屬、棒桿菌屬均在各樣品中存在相應(yīng)的豐度。先低溫后高溫發(fā)酵模式下細(xì)菌物種的豐富度和多樣性普遍高于先高溫后低溫發(fā)酵模式的。但是，在樣品物種分析中發(fā)現(xiàn)較為優(yōu)勢(shì)的物種包括了葡萄球菌屬、腸桿菌屬、變形菌屬，這可能會(huì)對(duì)本研究中的發(fā)酵豆瓣醬安全性產(chǎn)生一定的影響。

[1] 高秀芝, 王小芬, 李獻(xiàn)梅, 等. 傳統(tǒng)發(fā)酵豆醬發(fā)酵過(guò)程中養(yǎng)分動(dòng)態(tài)及細(xì)菌多樣性[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2008, 35(5): 748-753. DOI:10.3969/ j.issn.0253-2654.2008.05.018.

[2] 高秀芝, 王小芬, 劉慧, 等. PCR-DGGE分析天源醬園豆醬發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性[J]. 食品科學(xué), 2011, 32(1): 112-114.

[3] 羅惠波, 黃治國(guó), 李浩, 等. 濃香型大曲真核微生物群落的PCRSSCP解析[J]. 中國(guó)釀造, 2009, 28(8): 42-44.

[4] 李曉然, 李潔, 劉曉峰, 等. 利用高通量測(cè)序分析云南豆豉中細(xì)菌群落多樣性[J]. 食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào), 2014, 33(2): 137-142.

[5] CHIU C M, LIN F M, CHANG T H, et al. Clinical detection of human probiotics and human pathogenic bacteria by using a novel highthroughput platform based on next generation sequencing[J]. Journal of Clinical Bioinformatics, 2014, 4(1): 1. DOI:10.1186/2043-9113-4-1.

[6] 王紹祥, 楊洲祥, 孫真, 等. 高通量測(cè)序技術(shù)在水環(huán)境微生物群落多樣性中的應(yīng)用[J]. 化學(xué)通報(bào), 2014, 77(3): 196-201.

[7] KEMP M, JENSEN K H, DARGIS R, et al. Routine ribosomal PCR and DNA sequencing for detection and identification of bacteria[J]. Future Microbiology, 2010, 5(7): 1101-1107. DOI:10.2217/fmb.10.59.

[8] 杜連起. 風(fēng)味醬類(lèi)生產(chǎn)技術(shù)[M]. 北京: 化學(xué)工業(yè)出版社, 2006: 1-6; 66-67.

[9] 丁祖志. 原料預(yù)處理工藝對(duì)蠶豆醬品質(zhì)的影響[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2011.

[10] 趙建新. 傳統(tǒng)豆醬發(fā)酵過(guò)程分析與控制發(fā)酵研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2011.

[11] 張琦, 汪先丁, 楊虎, 等. 郫縣豆瓣自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的變化[J]. 食品與發(fā)酵科技, 2010, 46(6): 16-18. DOI:10.3969/ j.issn.1674-506X.2010.06.005.

[12] 燕平梅, 馬雁飛, 倪玲. 發(fā)酵食品中微生物多樣性研究方法進(jìn)展[J]. 中國(guó)釀造, 2011, 30(2): 12-14. DOI:10.3969/ j.issn.0254-5071.2011.02.004.

[13] 王洪媛, 管華詩(shī), 江曉路. 微生物生態(tài)學(xué)中分子生物學(xué)方法及T-RFLP技術(shù)研究[J]. 中國(guó)生物工程雜志, 2004, 24(8): 42-47. DOI:10.3969/j.issn.1671-8135.2004.08.010.

[14] ZHAO J X, DAI X J, LIU X M, et al. Changes in microbial community during Chinese traditional soybean paste fermentation[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2009, 44(12): 2526-2530. DOI:10.1111/j.1365-2621.2009.02079.x.

[15] SULTAN M, SCHULZ M H, RICHARD H, et al. A global view of geneactivity and alternative splicing by deep sequencing of the human transcriptome[J]. Science, 2008, 321: 956-960. DOI:10.1126/ science.1160342.

[16] SCHUSTER S C. Next-generation sequencing transforms today’s biology[J]. Nature Methods, 2008, 5(1): 16-18. DOI:10.1038/ nmeth1156.

[17] PALLEN M J, LOMAN N J, PENN C W. High-throughput sequencing and clinical micro biology: progress, opportunities and challenges[J]. Current Opinion in Microbiology, 2010, 13(5): 625-631. DOI:10.1016/ j.mib.2010.08.003.

[18] OROS-SICHLER M, SMALLA K. Semi-nested PCR approach to amplify large 18S rRNA gene fragments for PCR-DGGE analysis of soil fungal communities[M]//STANNARD E. Fungal Biology. New York: Springer, 2013: 289-298. DOI:10.1007/978-1-4614-2356-0_23.

[19] STOECK T, BEHNKE A, CHRISTEN R, et al. Massively parallel tag sequencing reveals the complexity of anaerobic marine protistan communities[J]. BMC Biology, 2009, 7: 72. DOI:10.1186/1741-7007-7-72.

[20] 布仁其其格, 高雅罕, 任秀娟, 等. 不同發(fā)酵時(shí)期酸馬奶細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)[J]. 食品科學(xué), 2016, 37(11): 108-113. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201611019.

[21] 陳浩. 傳統(tǒng)發(fā)酵豆制品中微生物多樣性的研究[D]. 無(wú)錫: 江南大學(xué), 2011.

[22] 陳延濤. 發(fā)酵乳和豆豉中微生物菌群DGGE分析及益生作用研究[D].南昌: 南昌大學(xué), 2013.

[23] 裴樂(lè)樂(lè), 羅青春, 孟霞, 等. 不同原料四川發(fā)酵泡菜的細(xì)菌多樣性分析[J]. 中國(guó)調(diào)味品, 2016, 41(2): 39-43. DOI:10.3969/ j.issn.1000-9973.2016.02.008.

[24] 徐鈜繡, 姜麗晶, 李少能, 等. 南大西洋深海熱液區(qū)可培養(yǎng)硫氧化微生物多樣性及其硫氧化特性[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2016, 56(1): 100-106. DOI:10.13343/j.cnki.wsxb.20150160.

[25] 卡依爾·玉素甫, 謝仁娜依·甫拉提, 瑪麗帕·吐拉洪, 等. Ugan古河道胡楊可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌的多樣性[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(2): 65-70.

[26] 冀錦華, 王小兵, 孟建宇, 等. 大興安嶺森林表層土壤真菌多樣性的分析[J]. 北方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2016, 44(3): 5-10. DOI:10.3969/ j.issn.2096-1197.2016.03.02.

[27] 秦楠, 栗東芳, 楊瑞馥. 高通量測(cè)序技術(shù)及其在微生物學(xué)研究中的應(yīng)用[J]. 微生物學(xué)報(bào), 2011, 51(4): 445-457.

[28] 蔣厚陽(yáng), 陳芝蘭, 趙國(guó)華, 等. PCR-DGGE法分析西藏傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中乳酸菌的多樣性[J]. 食品科學(xué), 2014, 35(1): 167-174. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201401033.

[29] 李燕. 黃山臭鱖魚(yú)發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性的研究[D]. 杭州: 浙江工商大學(xué), 2014.

[30] 李宗軍, 江漢湖. 中國(guó)傳統(tǒng)酸肉發(fā)酵過(guò)程中微生物的消長(zhǎng)變化[J]. 微生物學(xué)通報(bào), 2004, 31(4): 9-13. DOI:10.3969/ j.issn.0253-2654.2004.04.003.

Bacterial Diversity during Natural Fermentation of Soybean Paste under Variable Temperature Conditions

ZHOU Hongli1,2, LI Sha1, ZHANG Ling1, JIANG Liwen1,2, TAN Xinghe1,2,*
(1. College of Food Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China; 2. Hunan Provincial Key Laboratory of Food Science and Biotechnology, Changsha 410128, China)

The diversity of the bacterial community in soybean paste fermented under variable temperatures was analyzed by DNA extraction, PCR amplification and high-throughput sequencing technology. The results showed a total of 2081 and 1 870 operational taxonomic units (OTU) were obtained from the samples fermented at low temperature first and then high temperature (mode 1) or at high temperature first and then low temperature (mode 2), respectively. Firmicutes was the most dominant phylum for both fermentation modes with an abundance value of 72.24% and 43.84%, respectively. Staphylococcus was the most dominant genus with an abundance value of 44.13% and 32.52% for modes 1 and 2, respectively. The bacterial diversity and abundance of mode 1 were generally higher than those of mode 2.

fermentation mode; soybean paste; bacteria; diversity

10.7506/spkx1002-6630-201714018

TS201.3

A

1002-6630（2017）14-0120-07

周紅麗, 李莎, 張靈, 等. 變溫發(fā)酵模式下豆瓣醬自然發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌多樣性研究[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(14): 120-126.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714018. http://www.spkx.net.cn

ZHOU Hongli, LI Sha, ZHANG Ling, et al. Bacterial diversity during natural fermentation of soybean paste under variable temperature conditions[J]. Food Science, 2017, 38(14): 120-126. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201714018. http://www.spkx.net.cn

2016-09-14

湖南省教育廳重點(diǎn)項(xiàng)目（14A072）；湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)1515團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目

周紅麗（1972—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)副產(chǎn)品綜合利用研究、發(fā)酵食品研究與開(kāi)發(fā)。

E-mail：xuanxuan310@126.com

*通信作者：譚興和（1959—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品加工與貯藏工程、食品安全。E-mail：xinghetan@163.com