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        菲牛蛭的含量測定方法改進(jìn)及檢測中的注意事項(xiàng)

        2017-07-20 11:21:51張利
        云南中醫(yī)中藥雜志 2017年3期
        關(guān)鍵詞:含量測定

        張利

        摘要:改進(jìn)菲牛蛭的水蛭素含量測定方法及總結(jié)檢測中的注意事項(xiàng),提高方法的重復(fù)性及準(zhǔn)確度,更有效地控制菲牛蛭的質(zhì)量。

        關(guān)鍵詞:菲牛蛭;水蛭素;含量測定

        中圖分類號:R284 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A 文章編號:1007-2349(2017)03—0071-03

        菲牛蛭為醫(yī)蛭科動物(Poecilobdella manillensis),俗稱金邊螞蟥,別名馬尼擬醫(yī)蛭,是吸血類水蛭中個體較大的品種。其抗凝活性成分主要為水蛭素,其抗凝活性、抗血栓作用明顯高于非吸血類水蛭,在治療人類的心血管疾病,尤其是血栓性疾病具巨大的優(yōu)越性,中國藥典2015年版收載的藥用品種為水蛭科動物螞蟥Whitmania pigra,Whitman、水蛭Hi-nude nipponica,Whitman或柳葉螞蟥Whitmania acran ulata,Whitman的干燥體,與菲牛蛭動物品種來源不完全一致。云南省于2013年將菲牛蛭收錄到《云南省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》中。考慮到簡單易行,中國藥典2015版水蛭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及云南省的菲牛蛭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)對其水蛭素的含量測定均參照1970年Markwardt報道的凝血酶滴定法制定,其原理是根據(jù)水蛭素與凝血酶結(jié)合比例為1:1,而凝血酶已有國際單位NIH,水蛭素的活性以抗凝血酶活力單位ATU表示,一個ATU等于中和一個NIH凝血酶的水蛭素量,但此法受試劑及人為因素影響較大,重復(fù)性及準(zhǔn)確度不夠理想,有報道通過配制不同濃度梯度的凝血酶溶液,多次換試管重滴的濃度梯度法,重復(fù)性及準(zhǔn)確度較好,但操作繁瑣,耗時,不易掌握。筆者對菲牛蛭水蛭素含量方法進(jìn)行一定的改進(jìn)并提示檢測過程中應(yīng)注意的事項(xiàng),以提高檢測的重復(fù)性及準(zhǔn)確度。

        1儀器與試藥

        超級恒溫水浴槽(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司);DELTA320酸度計(jì)(梅特勒一托利多公司);菲牛蛭(批號150601、150607、150706),云南海瑞迪生物藥業(yè)有限公司;牛纖維蛋白原(批號140626-201310),牛凝血酶(批號140625-201009),中國食品藥品檢定研究院;水為純化水;其他試劑為分析純。

        2方法與結(jié)果

        2.1原方法測定水蛭素含量

        2.1.1供試液的制備 取本品粉末(過三號篩)約0.5 g,精密稱定,精密加入0.9%氯化鈉溶液15 mL,充分?jǐn)嚢?,浸?0 min,并時時振搖,過濾,取續(xù)濾液為供試品溶液。2.1.2緩沖液的配制取0.2 mol·L-1三羥甲基氨基甲烷溶液25 mL與0.1 mol·L-1鹽酸溶液約40 mL,加水至100 mL,調(diào)節(jié)pH值至7.4。

        2.1.3凝血酶滴定液的配制 取凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品適量,加生理鹽水制成每1 mL含凝血酶40個單位的溶液(臨用配制)。

        2.1.4含量測定 精密量取續(xù)濾液100μL,置試管(8 mm×38 mm)中,加入含0.5%(牛)纖維蛋白原(以凝固物計(jì))的三羥甲基氨基甲烷鹽酸緩沖液(臨用配制)200μL。搖勻,置水浴中(37±0.5)℃保溫5 min,滴加每1 mL中含40單位的凝血酶溶液(每1 min滴加1次,每次2μL,邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固,記錄消耗的體積,按下式計(jì)算。

        U=C1V1/C2V2

        式中u為每1 g含凝血酶活性單位(U·g-1);C2為凝血酶溶液的濃度(U·mL-1);C2為供試品溶液的濃度(g·mL-1);V1為消耗凝血酶溶液的體積(μL);V2為供試品溶液的加入量(μL)

        中和一個單位的凝血酶的量,為一個抗凝血酶活性單位,本品每1 g含抗凝血酶活性應(yīng)不低于60U。

        2.2含量測定方法改進(jìn)

        2.2.1滴定終點(diǎn)的確定 滴定過程中以觀察到試管內(nèi)出現(xiàn)凝固物為滴定終點(diǎn),故受外界及人為因素影響較大。而原方法固定為每分鐘滴加2μL凝血酶溶液,活性規(guī)定為不低于60 U·g-1,根據(jù)活性的計(jì)算公式1μL即可有約12 u·g-1的差異。在測定中發(fā)現(xiàn)有時臨近終點(diǎn)有時只需再滴加1μL就發(fā)生凝固。另外觀察到滴定過程時間過長、搖動過頻(超過15 min),不易觀察到凝固,10 min內(nèi)結(jié)束滴定方法的重復(fù)性較好。改進(jìn)滴定過程為:先滴加凝血酶溶液(每1 min滴加1次,每次5μL~2μL邊滴加邊輕輕搖勻)至凝固,記錄消耗的體積;新取試管1只,重新測定(根據(jù)初測時消耗的體積,調(diào)整每分鐘凝血酶的加入量,每次5μL-2μL),但在至近凝固時,改成每1 min滴加1次,每次1μL,滴定過程應(yīng)在10 min內(nèi)完成,記錄凝固時消耗凝血酶溶液的體積,以后一次消耗的凝血酶體積計(jì)算含量。

        2.2.2提取方式考察 同一批樣品分別采用超聲15 min、30 min,振搖30 min、60 min 4種提取方式,結(jié)果提取結(jié)果一致,為方便易行采用振搖30 min提取。采用0.9%生理鹽水為提取溶劑,分別在室溫(約20℃)、37℃、50℃、70℃下30 min振搖提取,結(jié)果顯示,50℃、70℃下溫度下水蛭素的活性明顯下降。其他條件活性結(jié)果一致。故可保留原標(biāo)準(zhǔn)提取方式。

        2.2.3滴定溫度 溫度對滴定過程影響大,同一批樣品分別在25℃、37℃、50℃、70℃滴定,在25℃、37℃溫度下滴定結(jié)果基本一致,后50℃、70℃溫度下活性下降了30%以上,故原標(biāo)準(zhǔn)滴定溫度可行。

        2.2.4供試液pH對含量測定結(jié)果的影響 配制同批供試液10份,并用1.0 mol·L-1NaOH或1.0 mol·L-1HCL分別調(diào)節(jié)pH值至3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5按

        2.2.1項(xiàng)的滴定方法進(jìn)行含量測定,結(jié)果表明供試液pH值4.5~7.0間,其抗凝活性基本穩(wěn)定(見表1),供試液pH值低于4.0時,溶液不澄清,無法觀察凝固現(xiàn)象,pH值太高則抗凝活性降低。用生理鹽水溶解后的供試品溶液pH值均在4.5-7.0之間。故供試液測定時無需調(diào)節(jié)pH值。

        2.3結(jié)果 取3批樣品,按菲牛蛭質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與改進(jìn)后方法分別進(jìn)行活性測定。3批結(jié)果見表2。

        3討論

        改進(jìn)每分鐘滴入固定量的凝血酶溶液的原活性測定方法,而根據(jù)初測預(yù)估消耗凝血酶溶液的體積,再換管重測,臨近終點(diǎn)時降低凝血酶溶液的滴入量,并限定滴定時間,可提高方法的重復(fù)性及準(zhǔn)確度。

        纖維蛋白原溶液與凝血酶溶液霉變會影響凝固物觀察,故都應(yīng)臨用新配。樣品溶液、纖維蛋白原及凝血酶溶液均應(yīng)澄清,否則會造成滴定終點(diǎn)提前。

        每次的應(yīng)輕微搖動,否則易造成原來凝固物分散。觀察是否出現(xiàn)凝固時不應(yīng)將試管拿出水面,整個滴定過程都應(yīng)在37℃水浴中進(jìn)行。

        水蛭素的活性單位是根據(jù)中和凝血酶單位的量來確定,凝血酶保存不當(dāng)效價會降低,故凝血酶標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)按要求妥善保存,必要時候應(yīng)重測其效價,以保證結(jié)果樣品含量測定的準(zhǔn)確性。

        (收稿日期:2016-11-01)

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