劉雅琳， 周 艷， 耿盼盼， 解裕萍， 喬洪圖， 孫茂盛， 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室， 昆明 650118)

恒河猴miR-125a-3p慢病毒載體的構(gòu)建、鑒定以及功能研究

劉雅琳， 周 艷， 耿盼盼， 解裕萍， 喬洪圖， 孫茂盛， 李鴻鈞

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室， 昆明 650118)

構(gòu)建攜帶miR-125a-3p過表達與抑制表達shRNA的慢病毒，研究miR-125a-3p對輪狀病毒感染乳鼠導(dǎo)致的腹瀉的影響，為進一步研究miR-125a-3p對輪狀病毒增殖過程中的影響及探究其機制提供前期研究基礎(chǔ)。設(shè)計miR-125a-3p前體序列及其反向互補序列，與慢病毒骨架質(zhì)pLVshRNA-EGFP(2A)Puro載體進行酶切連接，構(gòu)建過表達與抑制表達miR-125a-3p的慢病毒表達載體。利用HEK293Ta細(xì)胞包裝慢病毒顆粒，測定病毒滴度后，將獲得的miR-125a-3p過表達慢病毒顆粒感染MA104細(xì)胞和灌胃感染乳鼠，檢測miR-125a-3p的表達。同時對乳鼠進行輪狀病毒攻毒試驗，觀察腹瀉情況。研究成功構(gòu)建了過表達及抑制miR-125a-3p表達的慢病毒載體,獲得高效的過表達及抑制miR-125a-3p的慢病毒顆粒，成功感染MA104細(xì)胞，以及在乳鼠小腸組織有表達。同時發(fā)現(xiàn)miR-125a-3p過表達慢病毒感染乳鼠后對輪狀病毒引起的腹瀉有明顯的抑制作用。

miR-125a-3p；慢病毒；過表達載體；抑制表達載體；乳鼠

MicroRNA(miRNAs)是一類長度約為22個堿基的非編碼小RNA，它們通過抑制翻譯和導(dǎo)致mRNA降解兩種方式在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控真核生物三分之一以上基因的表達，參與了細(xì)胞的分化發(fā)育、增殖、凋亡和代謝等幾乎所有生物過程[1-2]。目前有眾多的研究表明，miRNA在個體發(fā)育、免疫應(yīng)答、腫瘤等多種生命過程中均具有重要的功能。最近研究發(fā)現(xiàn)，宿主miRNA的表達模式可能通過病毒的感染而被改變，如HCV[3-4]、HIV-1[5]、EBV[6]等。這些變化反映了宿主miRNA有可能在宿主與病毒之間的相互作用中發(fā)揮一些重要的功能[7-8]。

miR-125a家族在多種病毒感染中均有發(fā)揮功能。其中，宿主可通過提高miR-125a表達水平，從而抑制HBV的增殖[9]。近期，課題組前期研究表明[10]宿主細(xì)胞MA104中的miR-125a-3p在輪狀病毒感染后表達下調(diào)，可能與宿主與病毒間的相互作用相關(guān)。人輪狀病毒[11](Human Rotavirus，HRV)是導(dǎo)致五歲以下嬰幼兒嚴(yán)重腹瀉的最重要病原體之一。到目前為止，對于輪狀病毒與宿主細(xì)胞之間的相互作用研究較少，相關(guān)機制仍然不是十分清楚。

因此，本研究旨在通過構(gòu)建過表達與抑制miR-125a-3p表達的慢病毒載體并轉(zhuǎn)染 MA104 細(xì)胞，篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞株，為將來研究miR-125a-3p對輪狀病毒增殖中的影響打下前期研究基礎(chǔ)。同時，針對miR-125a-3p在輪狀病毒感染后表達下調(diào)這一現(xiàn)象，將miR-125a-3p過表達慢病毒感染乳鼠后，感染輪狀病毒，觀察乳鼠的腹瀉情況，從而反映過表達miR-125a-3p對輪狀病毒的感染是有一定抑制作用的。

1 材料和方法

1.1 材料

MA104細(xì)胞、HEK293Ta細(xì)胞均為本實驗室保存，DMEM 高糖培養(yǎng)基(CORNING)，Opti-MEM(Gibco)，胎牛血清(Biological Industries)，EndoFectin-Lenti轉(zhuǎn)染試劑(廣州復(fù)能基因有限公司)， 限制性內(nèi)切酶BamH I與EcoR I(TaKaRa公司)，pLVshRNA-EGFP(2A)Puro載體(北京英茂盛業(yè)生物技術(shù)有限公司)，RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(QIAGEN)，Real-time PCR 試劑(QIAGEN)，ICR乳鼠(購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所)。

1.2 方法

1.2.1 miR-125a-3p過表達與抑制表達慢病毒載體的構(gòu)建

根據(jù)小RNA深度測序結(jié)果，從miRBase數(shù)據(jù)庫查找miR-125a-3p的成熟序列，設(shè)計并合成針對恒河猴miR-125a-3p的成熟序列、反相互補序列以及空白對照序列(negative control NC)。

分別為miR-125a-3p(ACAGGTGAGGTTCTTGGGAGCC)、shRNAmiR-125a-3p(GGCTCCCAAGAACCTCACCTGT)和shRNAcontrol(CATCGACTAGCCACTTAGAC)。

通過BamH I和EcoR I酶將載體pLVshRNA-EGFP(2A)Puro以及3種DNA oligo進行雙酶切，T4連接酶16℃過夜連接。利用感受態(tài)大腸桿菌DH5α進行連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，涂布于含氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上，挑選其中的陽性單克隆菌落，經(jīng)過測序和比對分析PCR鑒定陽性的克隆。分別將鑒定正確的重組過表達慢病毒質(zhì)粒命名為pLV-miR-125a-3p，抑制表達慢病毒質(zhì)粒命名為pLV-shRNAmiR-125a-3p，空白對照命名為pLV-shControl-EGFP。

1.2.2 慢病毒包裝

將生長狀態(tài)良好的HEK293Ta細(xì)胞經(jīng)消化傳至10 cm圓碟中，37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細(xì)胞融合度達70%～80%時，將生長液換成含10% 熱滅活FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，簡稱包裝2溶液；在轉(zhuǎn)染試劑EndoFectin-Lenti的作用下，分別將構(gòu)建好的重組慢病毒質(zhì)粒pLV-miR-125a-3p、pLV-shRNAmiR-125a-3p、pLV-shControl-EGFP與慢病毒包裝的輔助質(zhì)粒PH1和PH2共轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育過夜。

第2天將培養(yǎng)基由包裝2溶液更換為含1%雙抗和5%熱滅活FBS的DMEM高糖培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基稱包裝3溶液；培養(yǎng)48 h后，收集含病毒顆粒的細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)1000 r/min離心2 min去除細(xì)胞碎片，將獲得的上清分裝保存至-80℃；在細(xì)胞培養(yǎng)碟中補充包裝3溶液后繼續(xù)培養(yǎng)至72 h，與48 h病毒液相同處理，并在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞中綠色熒光的表達情況。

1.2.3 慢病毒滴度測定以及濃縮純化

采用Real-time PCR法檢測慢病毒的滴度。HEK293Ta細(xì)胞傳至24孔板中，于10倍梯度稀釋病毒液，在細(xì)胞孔中加入100 μL稀釋好的病毒液，放置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，4 d后抽提細(xì)胞總RNA，利用Thermo逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，PCR擴增程序為25℃ 5 min，42℃ 60 min，70℃ 5 min。隨后以稀釋10倍的cDNA為模板Real time PCR檢測EGFP表達情況，上游引物：5′-TGCTTCAGCCGCTACCC-3′，下游引物：5′-AGTTCACCTTGATGCCGTTC-3′。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性 3 min；95℃變性20 s，56℃退火20 s，72℃延伸20 s；82℃再延伸5 s，共45個循環(huán)。溶解曲線65℃～95℃，每一步增加0.5℃，保持5 s。

采用高速離心的方法進行慢病毒的濃縮純化。將收集的慢病毒液在4℃條件下融化后，用0.44 μm濾器過濾。濾過的病毒液利用Beckman SW41轉(zhuǎn)頭于4℃條件下，26 000 r/min超速離心120 min后保留沉淀，每40 mL病毒加400 μL PBS溶解沉淀即為濃縮的病毒，將病毒液分裝凍存于-80℃。

1.2.4 MA104細(xì)胞的感染與穩(wěn)定轉(zhuǎn)染株的篩選

胰酶消化MA104細(xì)胞，接種于6孔板中，37℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng), 待細(xì)胞融合率達40%～50%時, 更換成含5 μg/mL ploybrene的MEM培養(yǎng)基，用重組過表達慢病毒和抑制表達慢病毒上清液和空白對照病毒上清液分別感染MA104細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜; 將培養(yǎng)液更換為含 5% FBS，1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，于熒光顯微鏡下隨機選取6個視野，來觀察綠色熒光蛋白的表達。根據(jù)嘌呤霉素對MA104細(xì)胞最小致死濃度實驗, 加入最適濃度為8 μg/mL嘌呤霉素的培養(yǎng)基進行篩選，將形成miR-125a-3p過表達和抑制表達的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系。

1.2.5 實時熒光定量PCR檢測miR-125a-3p在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株MA104中的表達

將篩選到的miR-125a-3p過表達和抑制表達的細(xì)胞傳代培養(yǎng)，Trizol裂解細(xì)胞提取總RNA。經(jīng)純度和濃度測定后，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行實時熒光定量PCR檢測。再以稀釋10倍的cDNA為模板,對miR-125a-3p和U6進行實時定量PCR檢測。每個樣品設(shè)置2個復(fù)孔, 以U6作為內(nèi)參, 重復(fù)3次, 計算Ct平均值, 采用相對定量法進行定量分析。

1.2.6 慢病毒感染動物實驗

濃縮純化后病毒滴度約為2 × 108TU/mL，對5 d齡的ICR乳鼠進行慢病毒灌胃(150 μL/只)，分成3組進行感染：實驗組分別是濃縮的pLV-miR-125a-3p慢病毒液，對照組灌同等體積的PBS溶液，空白組不予任何干預(yù)。灌胃72 h后取小腸進行冷凍切片，在熒光顯微鏡下觀察小腸組織中慢病毒的綠色熒光。然后分別對試驗組和對照組乳鼠進行輪狀病毒灌胃攻毒試驗，輪狀病毒滴度為107PFU，每只灌胃200 μL，觀察并記錄乳鼠的腹瀉情況。

2 結(jié)果

2.1 過表達與抑制表達miR-125a-3p慢病毒載體的構(gòu)建

以pLV-miR-125a-3p、pLV-shRNAmiR-125a-3p、pLV-shControl-EGFP以及空慢病毒載體為模板進行PCR，并經(jīng)過瓊脂糖電泳檢測PCR產(chǎn)物的大小(圖1)。

2.2 過表達與抑制表達miR-125a-3p慢病毒載體的鑒定

將篩選出來的陽性克隆菌落進行PCR鑒定，后進行測序分析，并與miR-125a-3p的成熟序列以及反相互補序列進行比對，未出現(xiàn)突變或缺失等異常，可見完全相匹配(圖2)。測序結(jié)果也證明了miR-125a-3p過表達與抑制表達慢病毒載體構(gòu)建成功。

圖 1 構(gòu)建相關(guān)載體PCR鑒定結(jié)果

1、2、3為以重組慢病毒載體為模版(1：pLV-miR-125a-3p，2:pLV-shRNAmiR-125a-3p，3: pLV-shControl-EGFP)；4為以慢病毒空載體為模版；M為DL500 DNA Marker

圖 2 shRNA序列測定結(jié)果

2.3 過表達與抑制表達miR-125a-3p重組慢病毒的包裝及滴度測定

重組慢病毒質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡下觀察，pLV-miR-125a-3p組和pLV-shRNAmiR-125a-3p組的HEK293Ta細(xì)胞均可觀察到綠色熒光的表達(圖3)，表明重組慢病毒質(zhì)粒已成功轉(zhuǎn)入HEK293Ta細(xì)胞中。將包裝后收獲的病毒進行滴度測定。結(jié)果顯示，pLV-miR-125a-3p滴度為2×106TU/mL，pLVshRNAmiR-125a-3p滴度為3×106TU/mL，pLV-shControl-EGFP滴度為2× 106TU/mL(表1)。

表 1 實時定量PCR檢測慢病毒滴度

2.4 篩選建立穩(wěn)定過表達和抑制表達miR-125a-3p的MA104細(xì)胞系

重組慢病毒感染MA104細(xì)胞48 h后，熒光顯微鏡觀察，pLV-miR-125a-3p組、pLV-shRNAmiR-125a-3p組及pLV-shControl-EGFP組，MA104細(xì)胞均可見綠色熒光表達(圖4)，且隨時間的延長熒光數(shù)增多，未被慢病毒感染的細(xì)胞不表達綠色熒光蛋白，表明成功包裝出具有感染活性的慢病毒粒。

A、B為pLV-miR-125a-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后綠色熒光蛋白表達情況(A：明視野，B：暗視野)；C、D為pLV-shRNAmiR-125a-3p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后綠色熒光蛋白表達情況(C：明視野，D：暗視野)；E、F為pLV-shControl-EGFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293Ta細(xì)胞48 h后綠色熒光蛋白表達情況(E：明視野；F：暗視野)本研究選取嘌呤霉素濃度為8 μg/mL作為篩選濃度,于細(xì)胞加入病毒液共培養(yǎng)后48 h，將培養(yǎng)基更換為含嘌呤霉素為8 μg/mL的5% FBS和1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基。加入篩選培養(yǎng)基4 d后，待細(xì)胞基本不再死亡，對細(xì)胞進行傳代，同時使用含嘌呤霉素的培養(yǎng)基加壓篩選。因此認(rèn)為，在本研究中,病毒轉(zhuǎn)染和篩選效率均>80%。

圖4 熒光顯微鏡觀察包裝后的重組慢病毒顆粒感染MA104細(xì)胞后的表達情況

A、B為pLV-miR-125a-3p慢病毒感染MA104細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達情況(A：暗視野，B：明視野)；C、D為pLV-shRNAmiR-125a-3p慢病毒感染MA104細(xì)胞后綠色熒光蛋白表達情況(C：暗視野，D：明視野)

2.5 實時熒光定量PCR檢測慢病毒轉(zhuǎn)染后細(xì)胞內(nèi)miR-125a-3p的表達量

實時熒光定量PCR結(jié)果顯示(圖5)，與空白對照組相比, pLV-miR-125a-3p的MA104細(xì)胞系中miR-125a-3p的表達水平上調(diào)70倍左右，表達量顯著增加。pLV-shRNAmiR-125a-3p的MA104細(xì)胞系中miR-125a-3p的表達水平下調(diào)了10倍左右，表達量明顯降低，組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖5 miRNA-125-3p過表達(A)和抑制表達(B)慢病毒載體轉(zhuǎn)染MA104細(xì)胞后細(xì)胞內(nèi)miRNA-125-3p的表達水平

2.6 慢病毒感染動物實驗

灌胃72 h后，在乳鼠小腸組織中可見綠色熒光的表達(圖6)，說明包裝pLV-miR-125a-3p慢病毒可以正常感染乳鼠。確定慢病毒感染成功后，分別對實驗組，對照組以及空白組乳鼠感染輪狀病毒，觀察乳鼠腹瀉情況。發(fā)現(xiàn)感染pLV-miR-125a-3p慢病毒的小鼠腹瀉情況有明顯的降低(圖7)。

圖6 熒光顯微鏡觀察乳鼠小腸組織切片結(jié)果

A為感染pLV-miR-125a-3p慢病毒乳鼠小腸切片；B為PBS對照組乳鼠小腸切片

3 討論

研究microRNA在生物學(xué)過程中的調(diào)控機制，通常需要通過在細(xì)胞中上調(diào)和下調(diào)其表達水平，來檢測相應(yīng)基因的mRNA或蛋白表達變化，從而觀察miRNA對細(xì)胞生物學(xué)行為的影響。目前常用上調(diào)和下調(diào)microRNAs的方法主要有電穿孔法、陽離子聚合物法、慢病毒介導(dǎo)法等。其中，慢病毒介導(dǎo)法優(yōu)點在于能夠感染細(xì)胞范圍廣、可將外源基因整合到宿主染色體，實現(xiàn)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的特點，因此被作為研究基因功能及基因下調(diào)的有效工具[12-14]。MA104細(xì)胞屬于比較難轉(zhuǎn)染的非洲綠猴腎細(xì)胞，通過慢病毒介導(dǎo)的傳遞方法，可以將其攜帶的過表達和抑制miR-125a-3p的shRNA序列整合到宿主細(xì)胞的基因組中，隨著宿主細(xì)胞的增殖不斷擴增，使外源基因在宿主細(xì)胞中實現(xiàn)穩(wěn)定持久的表達，篩選得到穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株[15]。

圖7 觀察感染輪狀病毒后乳鼠的腹瀉情況

A為PBS組感染輪狀病毒乳鼠腹瀉情況；B為感染pLV-miR-125a-3p慢病毒后感染輪狀病毒乳鼠腹瀉情況

本實驗首先成功構(gòu)建 pLV-miR-125a-3p、pLV-shRNAmiR-125a-3p慢病毒載體，并且利用 HEK293Ta 細(xì)胞包裝產(chǎn)生具有一定感染活性的慢病毒顆粒。通過熒光顯微鏡來觀察EGF綠色熒光蛋白表達情況來確定慢病毒的感染情況并大致判斷感染效率，并且通過抗生素嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的MA104細(xì)胞系。RT-qPCR的結(jié)果顯示，與對照組相比pLV-miR-125a-3p的miR-125a-3p的mRNA水平明顯上調(diào)，pLV-shRNAmiR-125a-3p與對照組相比，miR-125a-3p的mRNA水平明顯下調(diào)。

本研究中成功完成了pLV-miR-125a-3p、pLV-shRNAmiR-125a-3p慢病毒載體的包裝和滴度測定以及純化濃縮。同時，本試驗進一步探索研究了miR-125a-3p與輪狀病毒感染情況，預(yù)先對乳鼠感染攜帶過表達miR-125a-3p慢病毒pLV-miR-125a-3p后，再感染輪狀病毒，觀察乳鼠的腹瀉情況。試驗發(fā)現(xiàn)，感染pLV-miR-125a-3p慢病毒的乳鼠再感染輪狀病毒后，腹瀉情況明顯減輕。由此我們推測miR-125a-3p可能對于輪狀病毒的復(fù)制有一定的抑制作用。但是，由于靶基因調(diào)控的不確定性，一個靶基因可能受到多個miRNA的調(diào)控, 而miRNA也可能調(diào)節(jié)下游多個靶基因，要明確miR-125a-3p對輪狀病毒增殖過程中具體機制及靶向信號通路還需要進一步深入研究。

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Construction,identification and function of recombinant lentivirus vector for rhesus miR-125a-3p

LIU Ya-lin, ZHOU Yan, GENG Pan-pan, XIE Yu-ping, QIAO Hong-tu, SUN Mao-sheng, LI Hong-jun

(Institute of Medical Biology, Chinese Academy of Medical Sciences, Peking Union Medical College, Yunnan Key Laboratory of Vaccine Research & Development on Severe Infectious Disease, Kunming 650118， China)

To construct miR-125a-3p overexpression and suppression lentivirus shRNA vectors for studying its effect to diarrhea of miR-125a-3p in mice,which laid a foundation of study miR-125a-3p to provide preliminary preparation for the impact of rotavirus proliferation process and to explore the molecular mechanism, the miR-125a-3p precursor sequence and miR-125a-3p reverse complement sequence were designed, and pLVshRNA-EGFP(2A)Puro vector was used to construct recombination lentivirus plasmid. The recombinant plasmid can generate the miR-125a-3p overexpression and suppression lentivirus vectors. Packaged lentivirus particle contained miR-125a-3p overexpression and suppression lentivirus by HEK293Ta. Virus titer was detected after infection of HEK293Ta. Finally we evaluated miR-125a-3p expression after that the virus infected MA104 cell and injected mice, and diarrhea of mice that was infected by rotavirus.It is successfully to construct the miRNA-125-3p overexpression and suppression lentivirus vectors. The recombinant virus successfully infected MA104 cells and mice small intestine. miR-125a-3p overexpression and suppression lentivirus vector were constructed successfully，which provide a stable cell transfection vector for further study of the impact and mechanism of miR-125a-3p to rotavirus and its host.We also found that the miR-125a-3p overexpression lentivirus vector can inhibitor the diarrhea,which was infected by rotavirus.

miR-125a-3p； lentivirus vector； overexpression vector； suppression vector; suckling mice

2016-09-29；

2016-10-26

十二五重大新藥創(chuàng)制(2014ZX09102041004)；中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)與健康科技創(chuàng)新工程項目(2016-I2M)；云南省應(yīng)用基礎(chǔ)研究計劃項目(2016FB034)；云南省科技計劃項目 (2014BC008)

劉雅琳，碩士，研究方向為生物化學(xué)與分子生物學(xué)相關(guān)研究，E-mail： 104421990@qq.com

李鴻鈞，研究員，從事病毒疫苗研發(fā)、病毒與宿主相互關(guān)系及分子生物學(xué)相關(guān)研究，E-mail: lihj6912@163.com

Q78

A

2095-1736(2017)03-0001-05

doi∶10.3969/j.issn.2095-1736.2017.03.001