萬 娟, 羅 睿, 陳劍成, 沈少炎, 何天友, 榮俊冬, 鄭郁善,

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院,福建 福州 350002)

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福建柏優(yōu)樹子代ISSR遺傳多樣性與指紋圖譜

萬 娟1, 羅 睿1, 陳劍成1, 沈少炎1, 何天友2, 榮俊冬1, 鄭郁善1,2

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院；2.福建農(nóng)林大學(xué)園林學(xué)院,福建 福州 350002)

采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)24個(gè)福建柏家系的遺傳多樣性進(jìn)行分析.結(jié)果表明：16條引物共擴(kuò)增出215個(gè)位點(diǎn)和190個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)百分率達(dá)86.74%，表現(xiàn)出較好的多態(tài)性，福建柏各家系間存在較大的遺傳變異，且ISSR標(biāo)記能有效揭示家系間的多態(tài)性；家系間遺傳相似系數(shù)為0.58～0.87，遺傳距離為0.13～0.50，表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性;以遺傳距離L1為界，將24個(gè)福建柏優(yōu)樹子代劃分為3類，不存在明顯的地域性規(guī)律;僅用UBC841就能完全鑒別出所有待測(cè)家系.表明建立的福建柏DNA指紋圖譜ISSR 分子標(biāo)記技術(shù)可有效地用于福建柏家系的資源評(píng)價(jià)和指紋圖譜構(gòu)建.

福建柏; ISSR分子標(biāo)記; 遺傳多樣性; 指紋圖譜; 聚類分析

福建柏(Fokieniahodginsii)又名建柏、滇柏等，屬柏科福建柏屬，是中國特有的單屬種植物，已被列為國家二級(jí)保護(hù)植物[1-3].福建柏不僅具有良好的生態(tài)效應(yīng)，更因其具有良好的木材物理力學(xué)性質(zhì)，在木材加工中得到廣泛應(yīng)用，是我國珍貴的用材樹種[4-8].同時(shí)福建柏在藥用[5]和園林觀賞[6]方面都存在一定的研究?jī)r(jià)值.國內(nèi)對(duì)福建柏的研究較多，但大多集中于福建柏的種實(shí)表型變異、苗期選擇和子代林測(cè)定等方面[7-8]，但植物表型以及生理生化性狀受環(huán)境條件影響顯著，難以真實(shí)反映植物的遺傳變異狀況.而采用分子標(biāo)記手段可以更加準(zhǔn)確地對(duì)植物遺傳多樣性進(jìn)行研究.

遺傳多樣性水平可以反映出植物在其生長環(huán)境中基因的豐富程度，也決定其對(duì)于環(huán)境變化的適應(yīng)能力，使用合適的分子標(biāo)記方法對(duì)研究植物種質(zhì)資源的遺傳多樣性及親緣關(guān)系具有重要意義[9].因ISSR分子標(biāo)記方法克服了RAPD、AFLP和SSR分子標(biāo)記技術(shù)的局限性，并表現(xiàn)出更高的多態(tài)性、重復(fù)性和可靠性，已被廣泛應(yīng)用于植物研究[10-13]，但在柏科植物中應(yīng)用研究報(bào)道不多.葉睿超等[14]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記了65個(gè)垂枝香柏的個(gè)體，并分析其遺傳多樣性；齊明[15]為了鑒定杉木與側(cè)柏遠(yuǎn)交雜種的真實(shí)性，采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)其雜交后代進(jìn)行鑒定，并檢測(cè)到了多條父系特征譜帶；李單琦等[16]對(duì)觀賞性福建柏的遺傳多樣性進(jìn)行ISSR分析；張金玉等[17]利用ISSR分子標(biāo)記研究了115個(gè)無性系福建柏之間的親緣關(guān)系.有關(guān)福建柏優(yōu)樹子代實(shí)生苗的分子標(biāo)記研究目前尚未見報(bào)道.本試驗(yàn)利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)24個(gè)福建柏家系的實(shí)生苗進(jìn)行遺傳多樣性分析，構(gòu)建DNA指紋圖譜，以期為福建柏資源的合理開發(fā)利用與福建柏種質(zhì)資源的良種選育工作提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

24個(gè)福建柏優(yōu)樹子代材料來源于廣西、福建等4個(gè)省11個(gè)地區(qū)(表1)，2013年10—11月從各地林場(chǎng)預(yù)選出的優(yōu)樹上采回球果，經(jīng)過發(fā)芽處理后，于2015年2月下旬在福建安溪白瀨國有林場(chǎng)苗圃地中育苗[18]；2015年12月下旬在每個(gè)福建柏家系中選取3～5株長勢(shì)適中的植株，低溫保存后速帶回實(shí)驗(yàn)室液氮冷凍，并于-80 ℃冰箱中保存，以便進(jìn)行DNA提取.

表1 地理氣象因子

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 參照文獻(xiàn)[19]中基因組DNA提取方法.取0.2 g福建柏葉片，加入適量PVP，于液氮中研磨成粉，轉(zhuǎn)入已于65 ℃水浴鍋中預(yù)熱過的650 μL的2×CTAB提取緩沖液(其中已添加β-巰基乙醇)；65 ℃水浴，每隔5～10 min振蕩搖勻1次，45 min后取出于室溫放置5 min；按1∶1比例加入氯仿、異戊醇(24∶1)混合液，關(guān)緊蓋子，翻轉(zhuǎn)混勻至混合液呈乳液狀，15 000g離心15 min；取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中并重復(fù)上一步驟；取上清液轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入0.8～1倍體積的異丙醇(-20 ℃)與1/10倍體積的NaAc，充分混勻后-20 ℃靜置1 h；去廢液，用75%(體積分?jǐn)?shù))乙醇漂洗沉淀2～3次；干燥，DNA沉淀；加入100～200 μL TE緩沖液充分溶解沉淀(4 ℃)；加入適量RNase A充分混勻后分裝保存(4 ℃)，并取3 μL樣品于1.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè).

1.2.2 ISSR-PCR反應(yīng)體系的建立 采用李單琦等[6,16]建立的PCR反應(yīng)體系與擴(kuò)增程序，對(duì)24個(gè)福建柏優(yōu)樹子代的DNA進(jìn)行擴(kuò)增，配制1.5 g·mL-1的瓊脂糖凝膠，并加入適量Gold View核酸染料檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，通過全自動(dòng)數(shù)碼凝膠成像分析儀觀察擴(kuò)增結(jié)果并拍照.

1.3 ISSR擴(kuò)增引物的篩選

從哥倫比亞大學(xué)公布的100條通用引物中篩選出條帶清晰、不模糊、不彌散、質(zhì)量好的條帶引物，對(duì)24個(gè)福建柏優(yōu)樹子代的DNA模板進(jìn)行擴(kuò)增，并檢驗(yàn)其有效性和反應(yīng)體系.

1.4 數(shù)據(jù)處理

對(duì)各家系的DNA模板進(jìn)行ISSR-PCR擴(kuò)增后，觀察電泳圖上是否有條帶.ISSR分子標(biāo)記擴(kuò)增譜帶多為顯性表現(xiàn)，用“1”和“0”分別表示“有”和“無”，記錄清晰、重復(fù)性好的ISSR擴(kuò)增條帶；對(duì)每一引物擴(kuò)增結(jié)果構(gòu)建二元數(shù)據(jù)矩陣，統(tǒng)計(jì)總位點(diǎn)數(shù)和多態(tài)位點(diǎn)數(shù).采用POPGENE 32和DPS 7.05軟件對(duì)此數(shù)據(jù)矩陣進(jìn)行分析，根據(jù)遺傳距離采用非加權(quán)配對(duì)算數(shù)平均法進(jìn)行聚類分析，繪制樹狀圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA檢測(cè)結(jié)果

DNA電泳檢測(cè)結(jié)果表明，基本無拖帶或拖帶不明顯(圖1).采用紫外分光光度計(jì)(德國賽默飛NANODROP 2000C)檢測(cè)到的所有DNA的光密度(D260 nm和D280 nm)均為1.8～2.0，說明提取的DNA純度較高，符合要求.

圖1 24份福建柏樣本DNA電泳圖

2.2 不同引物的ISSR標(biāo)記多態(tài)性

篩選出的16條擴(kuò)增效果較好的引物見表2.多態(tài)位點(diǎn)百分率(PPB)表示遺傳變異水平，反映被測(cè)植物的環(huán)境適應(yīng)能力，PPB值高表明該植物的環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，多態(tài)性豐富[20].從表2可看出：16條引物在所有供試樣品DNA中共擴(kuò)增出215個(gè)位點(diǎn)、190個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)，PPB為88.37% ；每個(gè)引物平均擴(kuò)增13.44個(gè)位點(diǎn)，多態(tài)位點(diǎn)有11.88個(gè)，各引物的PPB均為57%～100%.引物擴(kuò)增結(jié)果如圖2、3所示，擴(kuò)增的DNA片段分子質(zhì)量為250～2 000 bp.結(jié)果表明福建柏各家系間有較大的遺傳變異，且ISSR標(biāo)記能有效揭示材料間的多態(tài)性.

表2 福建柏ISSR分析引物

2.3 各福建柏優(yōu)樹子代遺傳相似系數(shù)

Nei相似系數(shù)是用來比較群體或個(gè)體間相似程度的度量參數(shù)，平均相似系數(shù)越高，說明相似程度越大，遺傳背景一致性越強(qiáng)[21].本試驗(yàn)利用POPGENE 32對(duì)24份福建柏優(yōu)樹子代的供試材料進(jìn)行遺傳相似系數(shù)分析(表3)，結(jié)果表明24個(gè)福建柏家系之間的相似系數(shù)為0.58～0.87，平均值為0.72.其中來自廣西大明山的GDY7與GDY8的相似度最高，相似系數(shù)為0.87，親緣關(guān)系最近；來自廣西大明山的GDY9與YTY2的相似度最低，相似系數(shù)為0.58，親緣關(guān)系最遠(yuǎn).表明24份福建柏優(yōu)樹子代的相似系數(shù)均在0.58以上，且不存在明顯的地域趨勢(shì).

圖2 引物UBC841的福建柏?cái)U(kuò)增圖譜

圖3 引物UBC855的福建柏?cái)U(kuò)增圖譜

ID2345678910111213141516171819202122232410.840.800.730.790.730.760.730.740.680.770.770.760.730.690.750.800.740.680.730.720.730.750.7820.870.710.750.760.780.730.790.650.810.720.800.780.690.730.800.750.690.750.750.790.790.8130.700.740.720.700.730.760.670.790.740.790.740.680.750.790.690.670.730.690.790.750.7740.670.690.650.650.710.710.710.710.710.630.580.660.710.620.690.640.660.680.700.6850.800.840.730.780.620.800.750.730.740.740.750.780.750.670.800.700.780.770.8060.820.730.810.640.790.740.740.740.730.760.740.690.680.760.750.790.800.7870.730.780.640.800.730.740.720.780.740.730.790.640.790.760.770.770.8080.800.660.770.730.690.740.760.750.770.750.630.770.720.750.750.8090.670.790.780.780.780.710.790.810.730.700.780.740.790.800.78100.650.650.690.610.630.660.680.660.700.650.680.700.660.66110.790.780.800.730.740.800.750.710.810.730.820.840.84120.810.780.690.820.830.690.730.750.740.810.780.78130.790.770.800.820.740.690.770.730.770.760.79140.740.790.810.720.680.760.700.780.790.79150.750.740.760.600.750.710.730.740.75160.840.720.700.790.730.760.770.79170.760.770.800.770.810.820.80180.640.770.750.730.760.80190.710.670.730.730.70200.770.800.850.81210.750.770.75220.840.82230.85

2.4 聚類分析

基于DPS 7.05和Nei遺傳距離采用UPGMA法對(duì)24個(gè)福建柏家系進(jìn)行聚類分析，繪制聚類分支樹狀圖(圖4).結(jié)果(圖4)表明，利用ISSR標(biāo)記能將24個(gè)福建柏家系完全區(qū)分開.以L1為界可將供試材料分為3類：第1類包含了21個(gè)家系；第2類包含來自廣西的GDY9和GJY1；來自湖南綏寧的HSY2單獨(dú)聚為一類.來自廣西金秀的子代材料與來自廣西大明山的GDY9同聚為一類；來自湖南綏寧的HSY2單獨(dú)聚為一類，而與之來自同一地區(qū)的HSY3卻與其余20個(gè)家系聚為一類.說明聚類受材料地理來源的影響較小.

圖4 24個(gè)福建柏優(yōu)樹子代UPGMA聚類圖

2.5 指紋圖譜的構(gòu)建

由表4可知16條引物對(duì)24個(gè)福建柏家系的鑒別情況，其中，僅引物UBC841就能將所有被測(cè)家系鑒別出來，表現(xiàn)出良好的鑒別能力；其他引物通過不同組合也可將所有被測(cè)家系鑒別出來，例如引物UBC840、UBC811分別與UBC836(UBC873)和UBC808(UBC855)組合.

表4 各引物的鑒別樣本

3 小結(jié)與討論

本研究結(jié)果表明福建柏優(yōu)樹子代存在較為豐富的遺傳多樣性，這與李單琦等[16,17]對(duì)福建柏種群的研究結(jié)果相似.福建柏屬于我國特有的瀕危單屬種植物，主要分布于我國長江以南地區(qū)，少量分布于越南北部地區(qū)，分布區(qū)較小.一般認(rèn)為物種遺傳多樣性與其地理分布區(qū)域呈顯著正相關(guān)，許多我國所特有的瀕危植物遺傳多樣性都較低[22].福建柏作為華夏植物區(qū)系的孑遺種，可能受第四紀(jì)冰川時(shí)期的影響較弱，在中國南部地區(qū)得以存留，幸存?zhèn)€體可能保留了其先祖豐富的遺傳基礎(chǔ)[23].

對(duì)福建柏聚類的分析結(jié)果表明其受地理因子影響較小，這可能是由于試驗(yàn)采用的是福建柏1年實(shí)生苗作為試驗(yàn)對(duì)象，幼齡實(shí)生苗遺傳不穩(wěn)定，或者受到某些試驗(yàn)尚未考慮到的因素的影響較大.

本研究所構(gòu)建的指紋圖譜中引物UBC841能將24個(gè)福建柏優(yōu)樹子代全部鑒定出來，鑒定能力最強(qiáng)；而其他引物如UBC840、UBC811需要分別與UBC836(UBC873)和UBC808(UBC855)組合，鑒別能力次之.李單琦等[16]所構(gòu)建的指紋圖譜需要2個(gè)或2個(gè)以上的引物組合才能將參試樣品全部鑒定.說明目前僅利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)就可以繪制福建柏的指紋圖譜，為福建柏種質(zhì)資源的識(shí)別與鑒定提供較為全面的分子生物學(xué)信息[24].

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(責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉)

Genetic diversity and fingerprint ofFokieniahodginsiiby ISSR

WAN Juan1, LUO Rui1, CHEN Jiancheng1, SHEN Shaoyan1, HE Tianyou2, RONG Jundong1, ZHENG Yushan1,2

(1.College of Forestry; 2.College of Landscape Architecture, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

The genetic diversity of 24Fokieniahodginsiiwas analyzed by ISSR markers. The results showed that 16 ISSR primers produced 215 loci among 24 families ofF.hodginsii, of which 190 were polymorphic. Polymorphism of primers is satisfactory, with percentage of polymorphic loci being 86.74%, indicating great genetic variation among the families. The genetic similarity coefficient among families ranged between 0.58 and 0.87, and genetic distance ranged between 0.13 and 0.50, confirming abundant genetic diversity among the families. The 24 families were divided into 3 groups at the genetic distance of L1, but without significant regional regularity. And DNA fingerprints can be identified by UBC841. In conclusion, ISSR molecular markers could be effectively used in genetic diversity and fingerprint analysis forF.hodginsii.

Fokieniahodginsii; ISSR mark; genetic diversity; fingerprint; cluster analysis

2017-01-03

2017-05-15

福建省林業(yè)廳資助項(xiàng)目(閩林科[2013]1號(hào)).

萬娟(1992-)，女，碩士研究生.研究方向：自然地理.Email:745065754@qq.com.通訊作者鄭郁善(1960-)，男，教授，博士生導(dǎo)師.研究方向：園林植物應(yīng)用、園林規(guī)劃設(shè)計(jì)及森林培育學(xué).Email:zys1960@ 163.com.

S791.43

A

1671-5470(2017)04-0404-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.04.008