陳云政 青海省門源縣農(nóng)牧和科技局 810300

一株副豬嗜血桿菌的分離鑒定及藥敏試驗

陳云政 青海省門源縣農(nóng)牧和科技局 810300

副豬嗜血桿菌?。ㄓ址Q豬革拉澤氏病），是由巴斯德菌科嗜血桿菌屬的副豬嗜血桿菌感染引起的急性敗血癥，以多發(fā)性纖維素性漿膜炎、腦膜炎和關節(jié)炎為主要特征。豬感染副豬嗜血桿菌后出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、腹部膨大、跛行和共濟失調(diào)等癥狀，死亡率高。近年來，隨著養(yǎng)豬業(yè)集約化的發(fā)展，副豬嗜血桿菌病發(fā)病率呈上升趨勢，可單獨或混合感染，已成為嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的新發(fā)典型性疾病，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失。

2016年10月,青海省門源某豬場發(fā)生了一種以纖維性漿膜炎、腦膜炎和關節(jié)炎為主要特征的傳染病，該病發(fā)病急，發(fā)病豬出現(xiàn)體溫升高、咳嗽、呼吸困難、腹部膨大等癥狀，個別病豬跛行、共濟失調(diào)，死亡率高達20%以上。剖檢可見腹腔內(nèi)有黃色液體，心包積液，胸膜、腹膜有漿液性和膿性纖維蛋白滲出。腦部腦膜出血，有血性滲出，腦回展平。肺臟淤血水腫。脾臟及腸系膜淋巴結(jié)腫脹，有纖維蛋白滲出物。采集發(fā)病豬的心包液等病料經(jīng)實驗室進行細菌分離培養(yǎng)、生化鑒定、藥敏試驗及動物回歸試驗檢測，確定為副豬嗜血桿菌感染?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

（1）主要試驗材料。病料為從青海省門源幾個豬場采集的疑似副豬嗜血桿菌感染的病豬的心包積液及呼吸道分泌物。健康哺乳仔豬購自河南大學實驗動物中心。

（2）主要試劑。HPS培養(yǎng)基、NAD、金黃色葡萄球菌、雞血清等試劑購自北京索萊寶科技有限公司。藥敏紙片購自北京天壇生物公司。其他化學試劑如氯仿、異丙醇、乙醇等均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

（3）細菌的分離培養(yǎng)。無菌取發(fā)病豬的肺臟、腹膜、胸水和心血劃線接種TSA平板，放置于37℃ 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時，觀察生長情況及菌落特征。細菌涂片并進行革蘭氏染色，鏡檢。

（4）細菌的生化鑒定。將所分離細菌接種于血平板上，金黃色葡萄球菌垂直于水平線劃線，置于37℃ 的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)36小時，觀察是否有“衛(wèi)星現(xiàn)象”，并觀察是否有溶血現(xiàn)象。挑取具有衛(wèi)星生長現(xiàn)象的單菌落轉(zhuǎn)移接種于微量生化反應管，按照杭州天和微生物試劑有限公司說明書進行，觀察生化特性鑒定結(jié)果。

（5）藥敏試驗。無菌條件下對分離細菌培養(yǎng)物利用K-B紙片擴散法進行藥敏試驗，將分離的副豬嗜血桿菌菌落接種在TSA培養(yǎng)基中，培養(yǎng)后沾取單菌落均勻涂布于添加NAD的鮮血瓊脂平板上，用滅菌鑷子夾取各種藥敏紙片分別貼在適當?shù)奈恢?，將培養(yǎng)皿置于37℃下培養(yǎng)48小時，觀察測定抑菌圈的大小，判斷對不同藥物的敏感性。

（6）細菌致病性動物回歸試驗。將純化的分離菌增菌培養(yǎng)12～24小時制成細菌懸液，接種4只健康的哺乳仔豬，靜脈注射0.4mL/只，觀察實驗仔豬的發(fā)病情況，剖檢死亡仔豬觀察病理變化，并取呼吸道分泌物及心包液鏡檢。

2 結(jié)果與分析

（1）細菌的分離培養(yǎng)。取病變部位組織研磨后接種于培養(yǎng)基37℃，培養(yǎng)48小時后觀察菌落特征。表面光滑濕潤、邊緣整齊、針尖大小無色透明的小菌落，革蘭染色可見革蘭氏陰性細小桿菌，通?？梢娗v膜。

（2）細菌的生化鑒定。本實驗選擇分離的不具有溶血特性，但依賴NAD的菌株進行生化鑒定，生化試驗結(jié)果表明，該菌糖發(fā)酵特性活潑，能發(fā)酵葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、麥芽糖和蔗糖等，氧化酶試驗為陰性，尿素酶、過氧化氫酶試驗呈陽性，不產(chǎn)生吲哚。

病原菌的生化鑒定結(jié)果為葡萄糖+、乳糖-、甘露糖+、麥芽糖+、蔗糖 +、半乳糖 +、果糖 +、木糖 -、接觸酶+、過氧化氫酶+、吲哚-、尿素酶-、氧化酶-、硝酸鹽還原+。 “+”表示陽性/產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，“-”表示陰性/不發(fā)酵。

（3）藥敏試驗結(jié)果。該分離株嗜血桿菌對不同藥物的敏感程度有所差異，對環(huán)丙沙星、慶大霉素、氧氟沙星、諾氟沙星高敏，對氨芐青霉素中敏，而對林可霉素和鏈霉素不敏感，具有耐藥性，見表1。

表1 藥敏試驗結(jié)果

（4）細菌致病性動物回歸試驗。將分離純化的嗜血桿菌接種哺乳仔豬后，出現(xiàn)發(fā)熱、咳嗽、呼吸困難、腹部膨大、跛行、共濟失調(diào)等癥狀。剖檢可見呼吸道有大量的分泌物，心包積液，腹膜有漿液性纖維蛋白滲出。取其呼吸道分泌物和心包積液涂片染色鏡檢，可見革蘭氏陰性細小桿菌。

3 討論

副豬嗜血桿菌病在我國的發(fā)病報道越來越多，并呈流行趨勢。根據(jù)臨床癥狀、典型病理變化，以及病原菌的分離鑒定可以進行診斷。本試驗中分離的病原菌從培養(yǎng)特性、染色鏡檢、溶血特性及生化特性等方面都符合副豬嗜血桿菌的生物學特性。將分離菌的培養(yǎng)產(chǎn)物接種哺乳仔豬后，出現(xiàn)該病的典型癥狀，動物回歸試驗證實該菌具有較強的致病性。剖檢癥狀與副豬嗜血桿菌的癥狀一致，證實豬群被副豬嗜血桿菌感染。