皋月娟 董小小 王 菲 向 娟 劉 婭 陳曉琴 劉 政 高文宏

·實驗研究·

不同超聲輻照時間空化作用對降低兔肝血流灌注效應影響的實驗研究

皋月娟 董小小 王 菲 向 娟 劉 婭 陳曉琴 劉 政 高文宏

目的 探討不同聲空化輻照激勵時間高聲壓超聲空化作用對兔肝血流灌注降低的影響作用。方法選取健康新西蘭大白兔27只，依據不同聲空化輻照時間將其隨機分為1 min空化組（T1組）、5 min空化組（T5組）及10 min空化組（T10組），每組各9只。所有動物均采用高峰值負壓（P=2.0 MPa）超聲脈沖聯(lián)合經靜脈脂質微泡注射進行肝臟超聲空化輻照處理。于超聲輻照前、輻照后即刻、輻照后30 min、輻照后60 min及輻照后24 h對各組均進行肝臟超聲造影，比較輻照區(qū)域造影曲線下面積（AUC）及達峰時間（Tp）。輻照后24 h造影結束切取輻照區(qū)域肝臟組織，觀察其病理改變情況。結果T1、T5及T10組正常兔肝臟在高聲壓超聲空化輻照后均出現血流灌注量下降和達峰時間延長，AUC分別由（4868.24±1098.47）%s、（4395.27±1784.42）%s、（5522.43±1444.29）%s降低至（1642.71±914.15）%s、（1825.51±874.96）%s、（1097.38±370.24）%s，Tp由（21.62±7.07）s、（22.67±5.21）s、（24.17±5.50）s增加至（42.23±19.12）s、（50.04±11.33）s、（51.98± 12.06）s。隨著時間延長各組AUC逐漸回升，Tp逐漸回落。重復測量結果顯示，各造影參數組間效應及交互效應差異均無統(tǒng)計學意義（P組間=0.171、0.432、0.724，P時間*組間=0.905、0.472、0.230）；組內效應差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），其中T1組輻照后即刻及輻照后30 min AUC與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），T5組僅輻照后即刻AUC與輻照前比較差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而T10組輻照后所有時間點AUC與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；T1組輻照后即刻及輻照后60 min Tp與輻照前比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），T5組輻照后即刻、60 min、24 h Tp與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而T10組輻照后所有時間點Tp與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。病理結果顯示，三組肝臟組織均出現不同程度的肝臟細胞變性壞死，T10組目測壞死范圍大于T5組及T1組。結論高聲壓超聲空化作用可顯著降低正常兔肝組織血流灌注量及灌注速率，但不同聲空化輻照時間對其影響作用無顯著差異。隨著聲空化時間的延長，組織血流灌注恢復減緩。

超聲空化；微泡；肝臟；止血；兔

肝臟損傷是僅次于脾臟損傷的第二常見腹腔實質性臟器損傷，嚴重的肝臟損傷患者死亡率可達4．0%～11．7%［1-2］。由于肝臟質脆易碎且血管豐富，肝損傷后大出血引起的失血性休克成為其主要危險因素。有效控制損傷部位的出血不僅可以減輕患者失血癥狀，還可降低嚴重損傷患者手術治療的難度，為醫(yī)師和患者提供更好的治療條件。Zhao等［3］研究發(fā)現，在高聲壓低平均聲強超聲脈沖輻照的同時輔以血池內脂質微泡灌注，其劇烈瞬態(tài)空化效應的產生可引起肝細胞急性水腫，繼發(fā)的肝竇閉塞可顯著降低甚至暫時性阻斷肝臟局部的血流灌注，使出血量及出血速率顯著下降。本實驗在此基礎上，同樣采用高聲壓低聲強超聲脈沖進行不同時間的聲空化輻照，旨在評價不同聲空化輻照時間對兔肝血流灌注及組織損傷的影響，為聲空化作用的相關影響因素提供更全面的證據，為其臨床應用奠定基礎。

材料與方法

一、實驗動物及分組

健康新西蘭大白兔27只，雌性不限，體質量2～3kg，采用隨機數字表法分為3組：T1組、T5組、T10組，各組聲空化輻照時間分別為1min、5min、10min，余聲空化參數相同。

二、儀器與試劑

1．儀器：使用西門子S 2000彩色多普勒超聲診斷儀，線陣探頭，頻率為7～9 MHz；配有次諧波低機械指數超聲造影模式及時間－強度曲線定量分析軟件，用于肝臟超聲造影灌注的動態(tài)成像及造影相關參數的定量分析。使用深圳市威爾德醫(yī)療電子有限責任公司生產的脈沖式超聲空化治療儀，為定制型脈沖式超聲發(fā)射儀器，由主機及治療探頭組成，工作波形、超聲發(fā)射頻率、峰值聲壓、脈沖重復頻率、有效脈沖寬度、工作/間歇時間及治療時間等參數可調節(jié)，用于激勵脂質微泡產生空化效應。

2．試劑：“脂氟顯”脂質包膜微泡，由第三軍醫(yī)大學新橋醫(yī)院超聲科自行研制。核心氣體為全氟丙烷，包膜成分由1，2－棕櫚酰磷脂酰甘油（DPPG）和二硬脂?；字Ｒ掖及罚―SPE）經凍干法制成；微泡濃度約4～9×109/ml，平均粒徑2 μm，作為次諧波低機械指數成像的超聲造影劑及超聲空化效應的空化核，經靜脈注入血液循環(huán)。

三、實驗方法

1．輻照前準備：健康新西蘭大白兔，稱重后以復合麻醉方法麻醉。肌注鹽酸塞拉嗪注射液（陸眠寧Ⅱ，吉林省華牧動物保健品有限公司）0．3 ml/kg；待動物肌肉松弛后，經耳緣靜脈注入2%戊巴比妥鈉（Sigma，P3761）溶液約0．4 ml/kg；待動物角膜反射基本消失后，仰臥位固定于動物手術臺。腹部備皮，上至胸骨柄水平，下至劍突下10 cm處，兩側至腋前線處。局部皮膚以醫(yī)用碘伏溶液消毒，鋪一次性無菌手術巾。于劍突下沿腹中線逐層切開皮膚及腹壁肌肉約4 cm。將肝葉由腹壁切口輕輕拖出，置于腹壁上。

2．超聲造影及超聲空化輻照：選取肝葉長軸切面采集二維影像，隨后固定探頭，經靜脈團注“脂氟顯”脂質微泡造影劑0．1 ml/kg，同時于次諧波低機械指數造影成像模式下錄取造影動態(tài)影像90 s。造影結束后，將空化治療儀治療頭置于肝葉表面，保證充分耦合，按照設定參數及分組分別輻照肝臟1 min、5 min或10 min。脈沖超聲參數設置為：工作波形采用正弦波，探頭頻率為1．07MHz，脈沖重復頻率100 Hz，有效脈沖寬度50 μs，峰值負壓2000 kPa，采用“工作6 s－間歇6 s”模式進行輻照。治療頭輻照同時經靜脈緩慢推注稀釋的脂質微泡0．2 ml/kg（微泡以無菌生理鹽水稀釋至3 ml）。輻照后即刻采用同樣方法再次進行超聲造影并錄取動態(tài)影像。以輻照結束時間點為零點，于30 min及60 min時分別行超聲造影記錄肝葉同一部位造影影像。等待間期以濕潤的無菌紗布塊覆蓋于肝葉表面。60 min造影結束后，將肝葉輕緩置入腹腔，逐層縫合腹壁肌肉及皮膚，腹腔內及切口處局部以40萬單位青霉素鈉溶液（華北制藥股份有限公司）沖淋，同時肌注40萬單位青霉素，待動物蘇醒后繼續(xù)飼養(yǎng)。24 h后以同前方法麻醉動物并沿原腹部切口剪斷縫合線，拖出肝葉。再次于原部位行超聲造影檢查。

3.造影圖像分析：使用儀器自帶的造影分析軟件分析各組動物于各造影時間點的時間-強度曲線。勾選輻照區(qū)域為感興趣區(qū)，儀器自動生成時間-強度曲線，采用Gamma變量擬合方式生成擬合曲線，獲得曲線下面積（AUC）及達峰時間（Tp），見圖1。AUC為動態(tài)造影各時間點造影強度對造影時間的積分值，反映整個造影時間段內的累積灌注強度；因該儀器自帶算法所得造影強度單位為%，故以時間積分后AUC單位為%s；Tp為造影劑進入到達峰時刻所經歷時間，單位為s。

圖1 超聲造影軟件圖像分析界面

4.病理檢查：輻照后24 h造影結束后，切取輻照區(qū)域肝臟組織，固定于4%多聚甲醛溶液及2%戊二醛溶液中，常規(guī)制備HE染色石蠟切片及電鏡組織切片，觀察組織病理改變情況。

四、統(tǒng)計學處理

結果

一、各組超聲造影表現

圖2 各組不同時間點超聲造影圖

各組二維超聲造影圖像見圖2?？栈椪涨?，微泡造影劑推注后各組肝臟血流灌注呈現典型“快進慢出”表現，在動脈相肝臟實質快速均勻增強（圖2A、F、K），約15～25 s時造影強度達到峰值，隨后緩慢減弱?？栈椪蘸蠹纯?，各組輻照區(qū)域均出現不同程度血流灌注受阻現象（圖2B、G、L），表現為造影劑灌注緩慢及充盈缺損；輻照區(qū)域肝臟典型“快進”現象消失，代之以與呼吸相關的緩慢推進式灌注，無明顯達峰現象，至90 s仍可見輻照區(qū)域大血管分支內緩慢血流灌注；肝實質內可見大范圍、不規(guī)則充盈缺損區(qū)。至空化輻照后30 min，各組輻照區(qū)域仍表現為造影劑灌注緩慢及充盈缺損，但灌注速度較輻照后即刻明顯增快，充盈缺損區(qū)范圍較前減小（圖2C、H、M）?？栈椪蘸?0 min，各組超聲造影可見輻照區(qū)域肝實質不均勻增強，造影劑灌注速度仍較緩慢，輻照區(qū)域未見大范圍充盈缺損，但其增強不均質，可見肝實質內小片狀充盈缺損區(qū)域（圖2D、I、N）。24 h后再次行超聲造影，可見各組肝臟基本恢復正常血流灌注速度，但輻照區(qū)域峰值造影強度較周邊未輻照區(qū)域降低，部分仍可見肝實質內散在分布小片狀充盈缺損區(qū)域（圖2E、J、O）。

二、各組超聲造影定量比較

各組超聲造影定量參數AUC及Tp見表1。隨時間延長各組AUC逐漸回升，Tp逐漸回落。重復測量結果顯示，各造影參數組間效應及交互效應差異均無統(tǒng)計學意義（P組間=0.171、0.432、0.724，P時間*組間=0.905、0.472、0.230）；組內效應差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），其中：①T1、T5、T10組AUC較輻照前分別下降了約66.3%、58.5%、80.1%。各組輻照后30 min、60 min、24 h AUC均較輻照后即刻升高，T1組分別為輻照前的77.0%、88.7%及97.3%，T5組分別為輻照前的77.6%、89.7%及88.7%，T10組分別為輻照前的63.1%、71.0%及56.9%。T1組輻照后即刻及輻照后30 min AUC與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），T5組僅輻照后即刻與輻照前比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），而T10組輻照后所有時間點與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。②空化輻照后即刻T1、T5、T10組Tp分別延長至輻照前的2.12倍、2.27倍及2倍。至輻照后30 min、60 min及24 h，各組Tp均較輻照后即刻有所降低，但較輻照前仍高，與輻照前比較分別為：T1組1.43倍、1.56倍、0.98倍，T5組1.36倍、1.85倍、1.36倍，T10組1.68倍、1.64倍、1.42倍。T1組輻照后即刻及輻照后60 min Tp與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），T5組輻照后即刻、60 min、24 h與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而T10組輻照后所有時間點與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

三、病理檢查結果

輻照后24 h各組肝臟組織均出現局部肝細胞不可逆性病理損傷，包括散在片狀肝細胞氣球樣變（圖3A）及嗜酸性壞死（圖3B、C），壞死部位可見白細胞浸潤。電鏡檢測結果同樣顯示肝細胞早期壞死性改變，細胞及胞核輪廓尚存，但正常細胞器結構均消失，胞漿呈無結構疏松片狀均質，壞死區(qū)域可見較多白細胞浸潤（圖3D～F）。各組壞死區(qū)域病理改變情況相同，但T10組目測壞死區(qū)域較T5及T1組大。

表1 各組不同時間點AUC及Tp比較（±s）

表1 各組不同時間點AUC及Tp比較（±s）

AUC：曲線下面積；Tp：達峰時間。

組別 AUC（%s） Tp（s）T1組輻照前 4868.24±1098.47 24.17±5.50輻照后即刻 1642.71±914.15 51.98±12.06輻照后30 min 3747.72±1514.55 32.61±16.49輻照后60 min 4317.88±1442.86 37.63±11.17輻照后24 h 4738.03±1696.96 23.72±12.77 T5組輻照前 4395.27±1784.42 22.67±5.21輻照后即刻 1825.51±874.96 50.04±11.33輻照后30 min 3410.54±1756.43 30.92±13.88輻照后60 min 3944.87±1257.56 41.85±13.30輻照后24 h 3898.98±1710.82 30.80±7.34 T10組輻照前 5522.43±1444.29 21.62±7.07輻照后即刻 1097.38±370.24 42.23±19.12輻照后30 min 3486.44±1984.74 36.26±12.03輻照后60 min 3916.56±1560.56 43.71±13.73輻照后24 h 3140.48±2152.63 37.79±15.83 P時間（F時間） 0.000（20.195） 0.000（17.257）P組間（F組間） 0.432（0.870） 0.724（0.328）P時間*組間（F時間*組間） 0.472（0.960） 0.230（1.347）

討論

圖3 輻照后24 h各組肝臟組織病理圖（HE染色，×100）及電鏡圖（D示，×15 000；E、F示，×5000）

超聲輻照對活體組織生物學行為具有影響作用的觀點早已被業(yè)界公認。在診斷超聲成像領域，為了避免潛在副作用的產生，監(jiān)管部門嚴格規(guī)定超聲輻照能量必須限制在安全閾值之內［4-5］。而在治療超聲領域，超聲生物學效應潛在的治療用途則逐漸引起部分學者［6-7］的重視。隨著超聲造影技術在臨床應用的逐步推廣，超聲造影劑微泡的應用亦日漸廣泛。其結構特性使其不僅可作為聲散射微粒用于血池造影成像，同時可作為外源引入的微氣腔大大降低空化效應的閾值，使得同樣超聲輻照條件下血管內較血管外產生更強烈的空化效應，從而引起血管損傷［8］。超聲空化引起的血管損傷效應強弱與輻照能量密切相關，隨著超聲輻照能量的增強可引起不同類型的血管效應，包括血管通透性的增加，輕度血管損傷，甚至血管的損傷性閉塞［9-10］。Liu等［11］和Li等［12］采用峰值負壓2.6 MPa的超聲輻照聯(lián)合靜脈脂質微泡注射，有效破壞了大鼠及兔的腫瘤微血管，引起腫瘤溫度及造影灌注強度的降低。在此基礎上采用峰值負壓4.3 MPa的超聲聯(lián)合血池內微泡注射輻照兔肝臟后，實現了其血流的暫時性阻斷，并進一步增強了肝臟酒精消融的體積［13］。Zhao等［3］采用的輻照超聲峰值負壓雖然遠較診斷超聲高，但由于所使用的脈沖超聲占空比極低（＜1%），時間平均空間聲強遠低于高強度聚焦超聲，故其熱效應不顯著，血流阻斷效應主要依靠超聲激勵的微泡空化效應所產生。其研究證實，高聲壓低聲強超聲輻照聯(lián)合血管內脂質微泡注射的血流阻斷效應效果確切，在對肝臟進行輻照時可引起輻照區(qū)域肝細胞急性水腫及繼發(fā)性肝竇閉塞，該效應用于肝臟的急性止血效果佳。但是，上述研究對超聲空化肝臟損傷效應的持續(xù)時間及參數影響作用未進行深入研究探討。肝臟作為人體的“化學工廠”，承擔解毒及物質合成等重要任務，如何在實現有效止血效應的前提下盡可能降低損傷效應，對于肝損傷后功能的恢復具有重要意義。

本實驗超聲造影觀察及定量分析結果顯示，在血管內脂質微泡存在的條件下，高峰值聲壓（2 MPa）脈沖超聲輻照兔正常肝臟后即刻，輻照區(qū)域AUC顯著下降，下降率可達58.5%～80.1%，同時Tp顯著延長，可達輻照前2倍；至輻照后30 min、60 min及24 h，AUC呈現逐漸回升趨勢，Tp則逐漸回落，提示空化輻照后輻照區(qū)域組織血流灌注量下降、血流速度減緩，且該效應隨時間延長逐漸恢復。兩因素重復測量方差分析結果證實，各組內不同時間點AUC及Tp比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），且輻照后即刻肝臟AUC均顯著低于輻照前，Tp均顯著高于輻照前，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。本實驗結果再一次證實高聲壓脈沖超聲激勵微泡產生的空化效應可引起肝臟血流灌注量的有效下降及血流速度的有效減緩。而組間與時間交互效應比較差異均無統(tǒng)計學意義，提示時間點的作用不隨空化輻照時間變化而改變。以上結果證實，高聲壓低強度脈沖超聲的空化效應可造成局部肝臟血流灌注量和灌注速度隨時間的顯著改變，但聲輻照時間的長短對該阻斷效應無顯著影響。

盡管重復測量分析結果顯示各組間無顯著差異，但各組內分別進行比較顯示，T10組在輻照后各時間點AUC及Tp與輻照前比較差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而T1及T5組僅個別時間點與輻照前比較有差異，可見長時間輻照的影響作用主要體現在血流灌注的恢復過程上，而非即刻的灌注阻斷效果上。結合病理檢查結果可知，在相同參數的高聲壓低聲強超聲脈沖空化輻照下，短時間的空化效應即可導致輻照區(qū)域肝組織血流灌注量及灌注速度的顯著下降，輻照時間的延長并不會產生更顯著的即刻阻斷效應，但會減緩輻照后血流恢復的速度，同時會增加組織損傷的程度。其原因與空化損傷的作用機制有關。在體內大量微泡空化核存在的條件下，高達2 MPa峰值負壓的脈沖超聲可引起強烈的瞬態(tài)空化，僅若干脈沖產生的強烈空化效應即可對肝血竇甚至鄰近肝細胞造成損傷，而1 min的輻照時間足以引起部分肝細胞的急性水腫。隨著輻照時間的延長，肝細胞水腫范圍及程度亦逐步增加，此時由于肝竇閉塞所引起的血流灌注受阻同樣會導致微泡空化核的進入受阻，因此輻照后期空化效應的效率遠低于輻照早期，但長時間高聲壓脈沖刺激的累積可能引起細胞損傷的進一步加重，導致壞死范圍的擴大。本實驗結果也證實了盡管T1組及T5組在輻照后24 h血流灌注參數仍不及輻照前水平，但與輻照前比較差異無統(tǒng)計學意義，可以認為已基本恢復，而T10組在輻照后24 h的血流灌注水平與輻照前比較差異仍有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

綜上所述，本實驗再次證實了高聲壓低聲強脈沖超聲空化效應的血流阻斷效果，并通過對不同超聲輻照時間組的比較，得到了輻照時間的延長對即刻空化效應無顯著影響，但會減緩血流灌注恢復的結論，對于指導肝臟的空化止血應用具有重要意義。但是由于對24 h后的空化病理損傷未進行定量比較，因此尚不能明確超聲輻照時間的延長是否會增加組織病理損傷的程度，尚有待進一步探索。

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Effects of different acoustic irradiation time on cavitation-induced blood flow reduction of rabbit liver

GAO Yuejuan，DONG Xiaoxiao，WANG Fei，XIANG Juan，LIU Ya，CHEN Xiaoqin，LIU Zheng，GAO Wenhong Department of Ultrasound，302 Hospital of PLA，Beijing 100039，China

ObjectiveTo investigate the effects of different acoustical irradiation time on the reduction of rabbits hepatic blood perfusion under high-pressure ultrasonic cavitation.MethodsTwenty-seven healthy New Zealand rabbits were randomly divided into three groups according to the acoustic irradiation duration adopted-1 min（T1 group），5 min（T5 group），and 10 min（T10 group），withninemiceineachgroup.Ultrasoniccavitationprocedurewascarriedoutonallanimalsbyhighnegativepressure（P=2.0 MPa）pulsed ultrasonic irradiation combined with intravenous lipid microbubbles injection.Before，right after，30 min after，60 min after，and 24 h after the cavitation procedure，contrast-enhanced ultrasonography was performed to obtain timeintensity curve from which quantity parameters including area under curve and time to peak could be analyzed.After ultrasonography at 24 h，the treated liver tissues were harvested for pathological observation.ResultsAll three groups showeddecreased blood perfusion and prolonged time to peak right after high－pressure ultrasonic cavitation irradiation．Area under curve of T1，T5，and T10 groups decreased from（4868．24±1098．47）%s，（4395．27±1784．42）%s，（5522．43±1444．29）%s to（1642．71± 914．15）%s，（1825．51±874．96）%s，（1097．38±370．24）%s，respectively，while time to peak value prolonged from（21．62±7．07）s，（22．67±5．21）s，（24．17±5．50）s to（42．23±19．12）s，（50．04±11．33）s，（51．98±12．06）s，respectively．Both parameters showed gradual recovery over a long time．Statistical analysis showed no significant differences in cavitation duration effect（P＝0．171，0．432，0．724）and cavitation duration×time interaction effect（P＝0．905，0．472，0．230），but time effect showed statistical significant differences among three groups（all P＜0．01）．Pathological results showed that cell degeneration and necrosis were observed in all three groups，and the area T10 group was larger than that of T5 group and T1 group．Conclusion High negative pressure ultrasound induced microbubble cavitation can significantly reduce the perfusion volume and perfusion rate of liver tissue in normal rabbits，but the effect of different acoustic irradiation time has no significant difference．With the elongation of ultrasonic cavitation time，recovery of tissue blood perfusion slow down．

Cavitation；Microbubble；Liver；Hemostasis；Rabbit

R-332；R445.1

A

2016-11-21）

100039 北京市，解放軍第三○二醫(yī)院超聲科（皋月娟）；第三軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院超聲科（董小小、向娟、劉婭、陳曉琴、劉政、高文宏）；昆明醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院超聲科（王菲）

高文宏，Email：10471048gwh＠163.com