鄒平，李傳寬， 徐志強(qiáng)，陳心儀， 孫珮石，畢曉伊，吳志浩

(云南大學(xué) 生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650091)

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一株反硝化真菌的分離鑒定及其對生物塔脫氮效率的影響*

鄒平?，李傳寬， 徐志強(qiáng)，陳心儀， 孫珮石，畢曉伊，吳志浩

(云南大學(xué) 生態(tài)學(xué)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650091)

國內(nèi)外對細(xì)菌的作用及作用機(jī)制研究較多，而對真菌的作用及機(jī)制研究較少.為了提高NO，NOx的脫除效率，本文對脫氮塔生物膜中的反硝化真菌進(jìn)行了分離、純化及鑒定，通過搖瓶實(shí)驗(yàn)研究了反硝化真菌對NO3-的作用特征，最后在脫氮塔中投加了分離的反硝化真菌純菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液，研究了其對NOx脫除效率的影響，還對脫氮塔內(nèi)真菌的群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了高通量測序分析.實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：經(jīng)過真菌形態(tài)特征和脫氮(NO3-)特性研究及ITS序列測定分析，將3LNB菌株鑒定為鐮刀菌的腐皮鐮刀菌Fusariumsolani.高通量測序分析結(jié)果證明了脫氮塔內(nèi)確實(shí)存在鐮刀菌屬的腐皮鐮刀菌Fusariumsolani.在NO3-—N濃度高達(dá)10.01 g/L的條件下，實(shí)驗(yàn)共10 d，細(xì)菌反硝化組反硝化率為5.6%，其脫除效率為0.56 g/L；真菌3LNB菌株的反硝化率能達(dá)到15.1%，其脫除效率為1.51 g/L.實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)證明3LNB菌株對NO3-具有較強(qiáng)的反硝化能力.將3LNB純菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液400 mL(4%)投加到脫氮塔中，NO，NOx的平均脫除率分別提高了5.12%，5.36%.脫氮塔凈化實(shí)驗(yàn)證明3LNB培養(yǎng)液能強(qiáng)化微生物對NO，NOx的脫除效能，這可能主要與腐皮鐮刀菌等真菌細(xì)胞存在細(xì)胞色素P450nor有關(guān).

脫氮塔；燃煤煙氣；真菌；腐皮鐮刀菌；反硝化作用

工業(yè)煙氣排放的SO2和NOx是環(huán)境中污染十分嚴(yán)重的氣體，是形成酸雨、霧霾的主要原因[1-3].微生物凈化燃煤煙氣較物理化學(xué)法顯示出獨(dú)有的優(yōu)勢，效率高、工藝設(shè)備簡單、能耗和運(yùn)行費(fèi)用低、二次污染少[4].從已有的研究成果可知，生物法對燃煤煙氣中NOx的凈化處理主要是基于硝化菌的硝化作用和反硝化菌的反硝化作用來實(shí)現(xiàn)的[5].

反硝化作用定義為在有機(jī)物(電子供體和營養(yǎng)物)存在條件下，通過微生物反應(yīng)將NO3-(接受電子)或NO2-(接受電子)還原為N2O或N2的過程.即NO3-→NO2-→NO→N2O→N2，是大氣氮循環(huán)中的一部分.

反硝化細(xì)菌的種類很多，研究也較早[6].反硝化作用一度被認(rèn)為只存在于細(xì)菌中，但1992年Shoun等發(fā)現(xiàn)真菌中也存在反硝化作用[7].據(jù)研究發(fā)現(xiàn)真菌與細(xì)菌的反硝化作用各有其特點(diǎn).細(xì)菌反硝化的特點(diǎn)是對溶解氧控制要求嚴(yán)格.而真菌反硝化的特點(diǎn)則是(1)可在微厭氧或有氧條件下進(jìn)行[8].(2)真菌反硝化系統(tǒng)缺乏氧化亞氮還原酶(Nos)，不能將N2O還原為N2，最終產(chǎn)物為N2O，而細(xì)菌具有N2O還原酶(Nos).真菌可通過與細(xì)菌的協(xié)同反硝化作用產(chǎn)生N2，即N2或N2O是由胺和亞胺氮源中的氮元素與亞硝態(tài)氮中的氮素結(jié)合產(chǎn)生的[9].(3)雖有部分真菌(如尖孢鐮刀菌和赤霉菌等)可將NO3-或NO2-還原為N2O，但大部分反硝化真菌只能將NO2-還原，這表明NO2-可作為更有效的底物而被反硝化真菌利用[7].(4)真菌含有一類特殊的細(xì)胞色素P450，細(xì)胞色素P450具有一氧化氮還原酶的功能，能還原NO生成N2O是真菌最獨(dú)特的一步，也是較經(jīng)濟(jì)的一步，真菌細(xì)胞色素P450nor催化NO還原的速度約為細(xì)菌NO還原酶的5倍，在真菌的反硝化作用中起著非常重要的作用[10].

目前生物法對煙氣的NOx尤其是NO的脫除效率還較低[11-12]，國內(nèi)外也沒有生物法煙氣同時(shí)脫硫脫氮工藝的真菌群落結(jié)構(gòu)及其功能作用的研究報(bào)道.為了提高生物法對NOx尤其是NO的脫除效率，本文對脫氮塔生物膜中的真菌群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了高通量分析，對具有反硝化作用的真菌進(jìn)行了分離純化及鑒定，隨后研究了真菌對NO3-的反硝化作用特征，最后在脫氮塔中添加所分離真菌純菌株的擴(kuò)大培養(yǎng)液研究了其對NO,NOx脫除效率的影響.

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

真菌菌種來源：從脫氮塔中無菌操作取出長有豐富生物膜的陶粒若干,在滅菌燒杯中加適量無菌營養(yǎng)液振蕩使生物膜脫落并搖勻,制成懸液待分離真菌使用.

反硝化真菌分離純化培養(yǎng)基為查氏固體培養(yǎng)基，其組分：蔗糖30 g,NaNO33.0 g,MgSO4·7H2O 0.5 g,KCl 0.5 g,K2HPO41.0 g,FeSO4·7H2O 0.01 g,H2O 溶解、定容到1000 mL,瓊脂20 g.利用傳統(tǒng)平板法進(jìn)行真菌的分離純化；利用搖床進(jìn)行真菌的液體好氧擴(kuò)大培養(yǎng).蔗糖既為真菌營養(yǎng)物，也是反硝化電子供體.

1.2 煙氣處理裝置

實(shí)驗(yàn)室動態(tài)法配制混合氣體的溫度控制在28～30 ℃，與部分實(shí)際工業(yè)產(chǎn)生的煙氣基本一樣.生物凈化裝置由玻璃管加工制作而成.生物膜填料層用內(nèi)徑Φ95 mm的玻璃管制成，填料層總高1.0 m，分為兩層，層間距約為0.1 m.生物膜填料塔采用氣液逆流操作，SO2和NOx煙氣采用動態(tài)法配制，即通過Na2SO3溶液與H2SO4溶液及NaNO2溶液與H2SO4和FeSO4的混合溶液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)制取SO2和NOx，之后與空氣混合.填料側(cè)壁設(shè)置有三個氣體取樣口，采用型號KM950煙氣分析儀對煙氣進(jìn)行測定.進(jìn)氣口初始濃度NO控制在1500×10-6左右，NO2初始濃度控制在500×10-6左右，SO2初始濃度為1 000×10-6左右.填料采用類球形直徑為1.0～2.5 cm的輕質(zhì)陶粒，氣體流量計(jì)每小時(shí)進(jìn)氣0.4 m3/h，循環(huán)液總體積10 L，流速大小為6～8 L/h，每隔10 d更換循環(huán)液2 L，脫氮塔pH控制在7.5～8.5(飽和NaHCO3溶液調(diào)節(jié))，實(shí)驗(yàn)裝置流程見圖1.

圖1 生物法煙氣同時(shí)脫硫脫氮實(shí)驗(yàn)裝置圖Fig.1 Double towers system of simultaneous biological removal of SO2 and NOx

1.3 分析方法

麝香草酚分光光度法[13]測定培養(yǎng)基中的硝酸鹽含量.格里斯(Griess)試劑比色法[14]測定培養(yǎng)基中的亞硝酸鹽含量.

為避免細(xì)菌和真菌對培養(yǎng)液N分析結(jié)果的影響，在紫外分光光度法比色前，對分析培養(yǎng)液樣品高速離心(13 000 r/min)10 min后，取上清液進(jìn)行分析測定.因抗生素分子含N，故每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了加入相應(yīng)抗生素但沒加入對應(yīng)微生物的空白對照組，其它成分均與對應(yīng)實(shí)驗(yàn)組相同，在比色時(shí)作為空白對照.

1.4 真菌的研究方法

1.4.1 真菌的形態(tài)學(xué)研究方法

平板法分離純化真菌，觀察平板中菌落形態(tài)，使用生物顯微鏡、電鏡觀察真菌個體及局部形態(tài).

1.4.2 反硝化脫氮特征實(shí)驗(yàn)

研究反硝化作用的培養(yǎng)基組分：蔗糖3.0 g,MgSO4·7H2O 0.05 g,KCl 0.05 g,K2HPO40.1 g,FeSO4·7H2O 0.001 g,H2O溶解、定容到100 mL.前期通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，培養(yǎng)基硝酸鈉加入量為6.07 g，相當(dāng)于NO3-—N 10.01 g/L.實(shí)驗(yàn)時(shí)使用細(xì)菌抗生素6 g/L可溶性的頭孢菌素[15]，以抑制細(xì)菌的生長.真菌抗生素使用2 g/L的氟康唑氯化鈉溶液[16]，以抑制真菌的生長.抗生素根據(jù)實(shí)驗(yàn)時(shí)間的長短實(shí)時(shí)補(bǔ)充.反硝化脫氮特征實(shí)驗(yàn)已經(jīng)多次重復(fù)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有重現(xiàn)性.

選取4支250 mL錐形瓶，每瓶培養(yǎng)基總體積為100 mL，按下列順序編號實(shí)驗(yàn).

1#真菌反硝化組：研究分離培養(yǎng)的真菌是否具有反硝化作用.滅菌培養(yǎng)基中加入1 mL真菌培養(yǎng)懸液，6 g/L的頭孢菌素1 mL；

2#真菌與細(xì)菌反硝化組：研究分離培養(yǎng)真菌與生物膜懸液對NO3-是否具有反硝化協(xié)同作用.滅菌培養(yǎng)基中加入1 mL的真菌培養(yǎng)懸液，并加1 mL脫氮塔的生物膜懸液；

3#細(xì)菌反硝化組：滅菌培養(yǎng)基中加入1mL脫氮塔中的生物膜懸液，并加2 g/L真菌抗生素氟康唑氯化鈉溶液1 mL，作為細(xì)菌反硝化組；

4#空白對照組：滅菌培養(yǎng)基中加入6 g/L的頭孢菌素1 mL，加入真菌抗生素氟康唑氯化鈉溶液1 mL.實(shí)驗(yàn)分組編號情況如表1所示.

表1 實(shí)驗(yàn)分組編號Tab.1 Group numbering in the experiments

注：√表示添加，無√則不添加.

實(shí)驗(yàn)共10 d，各實(shí)驗(yàn)組每天取一次共10次樣品測定NO3-—N量，最后一天測定培養(yǎng)基中NO2-—N量.分析各實(shí)驗(yàn)組氮素的分布情況.

1.5 真菌菌株的分子生物學(xué)鑒定

將密封好的純菌株平板寄往上海生工生物工程股份公司進(jìn)行鑒定.真菌組的DNA提取采用Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒SK8259(上海生工生物工程股份公司).以純化后的真菌總DNA為模板，用真菌通用引物TCCGTAGGTGAACCTGCGG進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片段為ITS1，其長度在600 bp左右.PCR 擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后于72 ℃延伸修復(fù)10 min，4 ℃保存.反應(yīng)完成后，經(jīng)1%瓊脂糖電泳，檢測擴(kuò)增片段的大小和特異性.將菌株測得的ITS1序列在NCBI上blast進(jìn)行對比，采用鄰接法進(jìn)行進(jìn)化關(guān)系分析和系統(tǒng)樹的構(gòu)建.

1.6 高通量分析脫氮塔中真菌群落結(jié)構(gòu)

將脫氮塔內(nèi)的陶粒取出，通過一系列的無菌操作，得到大量的微生物，然后將冷藏有微生物的離心管寄往上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行高通量測序分析真菌的群落結(jié)構(gòu).

序列數(shù)據(jù)處理：將多條序列按其序列間的距離對它們進(jìn)行聚類，后根據(jù)序列之間的相似性作為域值分成操作分類單元(OTU)，通常域值的序列相似性定為0.97，操作分類單元被認(rèn)為可能屬于屬；域值的序列相似性定為0.99被認(rèn)為可能屬于種.

OTU聚類采用的軟件為uclust.

對處理后序列進(jìn)行物種分類，采用的軟件為RDP classifier，RDP classifier是基于Bergey's taxonomy.Bergey's taxonomy分為6層，它們依次為域(domain)、門(phylum)、綱(class)、目(order)、科(family)、屬(genus).同時(shí)，基于OTU聚類的結(jié)果，獲取每一個OTU聚類的代表性序列，分別是長度最長序列(length)、豐度最大的序列(abundance)和所有的序列(ALL)形成三份結(jié)果，并進(jìn)行各類RDP分析.

1.7 真菌對脫氮塔脫氮效率的影響研究

實(shí)驗(yàn)室溫度28～30 ℃，每天測定脫氮塔NO,NO2的脫除率3次(早中晚各一次)，取平均值，共7 d.作為真菌添加前的實(shí)驗(yàn)對照.同時(shí)將分離純化的3LNB菌株用查氏液體培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)液體積共400 mL，培養(yǎng)3 d左右真菌生長旺盛時(shí)，向脫氮塔內(nèi)添加此真菌培養(yǎng)液，控制與對照組相同的環(huán)境條件(溫度、pH,空氣流量、循環(huán)液流速等)，然后再次每天測定脫氮塔NO,NO2的脫除率，測定方法與對照組一致，共7 d.同時(shí)觀察真菌3LNB在脫氮塔內(nèi)的生長情況，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并與添加前數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

真菌3LNB在查氏培養(yǎng)基平板上生長迅速.在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中，48 h后長出菌落，菌落平展，白色，無氣味，呈細(xì)長絨毛狀.用顯微鏡觀察可以看到菌絲透明，有隔，分支；小分生孢子有1～2個分隔，呈紡錘形至卵圓形；大分生孢子，有3～5個分隔，呈梭形至月牙形，末端較鈍；厚垣孢子長于菌絲尖端，呈圓形.菌株的顯微鏡圖片和電鏡圖片如圖2～3所示.

圖2 真菌3LNB顯微鏡圖片(放大400倍)Fig.2 Microscope image of 3LNB (Magnified 400 times)

圖3 真菌3LNB電鏡圖片F(xiàn)ig.3 SEM image of 3LNB strain

2.2 反硝化脫氮特性研究結(jié)果

從圖4可知：在NO3-—N濃度高達(dá)10.01 g/L的條件下，實(shí)驗(yàn)共10 d，細(xì)菌反硝化組反硝化率為5.6%，其脫除效率為0.56 g/L；真菌3LNB菌株的反硝化率為15.1%，其脫除效率1.51 g/L；真菌與細(xì)菌反硝化組9.4%，其脫除效率0.94 g/L.

圖4 各實(shí)驗(yàn)組反硝化率變化曲線Fig.4 The nitrification rate in experimental groups

本實(shí)驗(yàn)對各實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液第10 d的亞硝酸根NO2-進(jìn)行了定量測定，其結(jié)果如圖5所示.

圖5 第10天各實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液中亞硝酸鹽氮的質(zhì)量Fig.5 Quality of the denitrate nitrogen in experimental groups reaction liquid on 10th day

從圖5可知：NO2-離子既是反硝化的目標(biāo)物同時(shí)也是中間產(chǎn)物，各實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液中均有很少量的亞硝酸根NO2-離子存在，但其中真菌反硝化組與真菌與細(xì)菌反硝化組有更低含量的NO2-離子，這可能與大部分反硝化真菌只能將NO2-還原，這表明NO2-可作為更有效的底物而被反硝化真菌利用[7].空白對照組有極少量的NO2-離子，這與其被微生物污染有關(guān).

表2為各實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液第10 d氮素分布情況.從表2和圖5可知，反應(yīng)液中初始投加NO3-—N的濃度為10.01 g/L，濃度較高，目的是結(jié)合燃煤工廠實(shí)際需要.燃煤煙氣中含有大量的NOx,SO2,重金屬、碳?xì)浠衔锏?NOx,SO2等在細(xì)菌作用下會轉(zhuǎn)變成NO2-,NO3-,SO42-.這些離子與重金屬離子會逐漸在循環(huán)液中積累從而達(dá)到較高的濃度，脫氮塔在運(yùn)轉(zhuǎn)中雖然有開路工序(即定期從脫氮塔中放出定量循環(huán)液，以減少循環(huán)液中含鹽量及微生物代謝產(chǎn)物)，但由于燃煤煙氣量太大，循環(huán)液中始終存在較高離子濃度.經(jīng)檢測，循環(huán)液中離子濃度常常在4.0%～9.0%左右.所以本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的離子濃度為6.0%左右.

經(jīng)另外純菌株分離實(shí)驗(yàn)可知，在實(shí)驗(yàn)室脫氮塔中還分離純化出了高嗜鹽細(xì)菌：如鹽單胞菌等.這提示脫氮塔在長期運(yùn)行中循環(huán)液的較高鹽濃度對細(xì)菌等微生物形成了選擇性壓力.

空白對照組沒有接種真菌與細(xì)菌，空白實(shí)驗(yàn)組的氮素質(zhì)量守恒.

細(xì)菌反硝化組反硝化反應(yīng)程度較真菌3LNB小得多.細(xì)菌反硝化組的菌種雖然取自生物膜懸液，但反應(yīng)初在其反應(yīng)液中添加了適量的真菌抑制劑，真菌不能生長，其內(nèi)主要是細(xì)菌在發(fā)揮作用.細(xì)菌反硝化組存在大量能發(fā)揮反硝化作用的細(xì)菌，但其反硝化作用強(qiáng)度不如真菌3LNB.

表2 各實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)液第10 d氮素分布情況Tab.2 Nitrogen existsing in the experimental groups reaction liquid on 10th day

真菌反硝化組的真菌3LNB反硝化反應(yīng)程度最高，10 d較細(xì)菌反硝化組的反硝化率高9.5%，脫除效率高0.95 g/L，其反硝化能力較細(xì)菌強(qiáng)2.7倍.

真菌與細(xì)菌反硝化組中的微生物既有真菌3LNB，也有生物膜懸液，實(shí)驗(yàn)測得其反硝化率10 d為9.4%，反硝化脫除效率為0.94 g/L，其反硝化脫氮效率較細(xì)菌反硝化組高1.68倍，但卻是單獨(dú)真菌3LNB菌株反硝化脫氮效率的0.62倍，較低.

在李平[17]的反硝化真菌-細(xì)菌優(yōu)化組合及其脫氮能力研究論文中，總NO3-—N為10 mmol(0.14 g/L)環(huán)境下，鐮刀菌屬在30 h內(nèi)能脫除少量的NO3-，培養(yǎng)一周后能脫除約70%(0.098 g/L)，并且?guī)缀鯖]有NO2-的積累.在幾乎沒有NO2-的積累這一點(diǎn)上，與本論文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致.真菌反硝化組與李平實(shí)驗(yàn)NO3-—N脫除效率對比分析如表3所示.

表3 NO3-—N 7 d脫除效率對比分析Tab.3 Removal rate of nitrate nitrogen comparison on 7th day

從表3可知，在7 d實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi)，真菌反硝化組對NO3-—N脫除效率為0.139 g/L，較李平實(shí)驗(yàn)0.098 g/L高1.42倍.通過比較說明3LNB菌株對NO3-具有較強(qiáng)的反硝化作用.

真菌與細(xì)菌反硝化組僅從NO3-—N含量減少的分析數(shù)據(jù)看，其反硝化作用程度似乎較真菌3LNB株弱，但該組微生物還含有硝化細(xì)菌，其復(fù)雜的微生物系統(tǒng)對NO2-—N的含量分析可能具有一定的增加作用，此增加作用會導(dǎo)致對真菌與細(xì)菌反硝化組脫氮作用的低估.由于上述實(shí)驗(yàn)是以NO3-作為反硝化對象，其與脫氮塔中的硝化對象NOx有差異，所以本論文下一步實(shí)驗(yàn)即將真菌3LNB菌株擴(kuò)大培養(yǎng)后投加到脫氮塔中，研究真菌3LNB對脫氮塔的脫氮效率影響情況.

2.3 分子生物學(xué)鑒定

3LNB菌株P(guān)CR擴(kuò)增的ITS1序列長度為518bp.

Blast結(jié)果如圖6所示：菌株3LNB的ITS1序列在系統(tǒng)發(fā)育樹上與FusariumsolaniKR708647.1腐皮鐮刀菌聚為一簇，通過NCBI序列比對，ITS1序列相似度為100%.結(jié)合生理生化研究，菌落特征，個體形態(tài)的生物顯微鏡和電鏡觀察，將菌株3LNB鑒定為腐皮鐮刀菌Fusariumsolani，隸屬鐮刀菌屬，瘤座孢科，從梗孢目，絲孢菌綱，半知菌亞門，真菌界.

圖6 基于ITS1序列的真菌3LNB菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.6 Phylogenetic analysis and related species based on 3LNB ITS1 sequence

2.4 脫氮塔中真菌群落結(jié)構(gòu)高通量測序分析

通過高通量測序分析，在門(phylum)水平上樣本主要rank reads數(shù)目以及真菌種群相對豐度，由高到低排序：擔(dān)子菌門(Basidiomycota)reads25916，59.35%>子囊菌門(Ascomycota)reads10795，24.72%>未分類真菌(Unclassified fungi) reads4316，9.88%>接合菌門(Zygomycota)reads1666，3.82%>壺菌門(Chytridiomycota)reads303，0.69%.門水平熱圖如圖7所示.

圖7 門水平熱圖Fig.7 Heat map of phylum

從圖7高通量分析結(jié)果可知脫氮塔中擔(dān)子菌門、子囊菌門真菌相對豐度較高.1992年Shoun等[7]就發(fā)現(xiàn)，子囊菌門和擔(dān)子菌門的真菌存在反硝化活性.但兩門的真菌在本研究的培養(yǎng)條件下未能分離到純菌株.盡管如此，它們的反硝化作用在脫氮塔應(yīng)是客觀存在的.

半知菌亞門在高通量測序分析門水平上未檢測出，其相對豐度未知.但屬(genus)水平上卻檢測出真菌3LNB菌株所隸鐮刀菌屬(Fusarium)的相對豐度：reads317，占0.73%.其它曲霉屬(Aspergillus)reads149，占0.34%，青霉屬(Penicillium)reads125，占0.29%；赤霉菌屬(Gibberella)reads58，占0.13%.屬水平熱圖如圖8所示.

圖8 屬水平熱圖Fig.8 Heat map of genus

在種(species)水平上，腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)reads17，占0.04%.種水平熱圖如圖9所示.

圖9 種水平熱圖Fig.9 Heat map of species

1972年Bollag和Tung[18]在含氧低的培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)土壤真菌尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)和腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)還原NO2-并釋放N2O.Shoun等[7]也發(fā)現(xiàn)嚴(yán)格好氧的尖孢鐮刀菌等多種真菌能進(jìn)行反硝化作用.許多真核微生物也能在低氧或厭氧條件下利用復(fù)雜的ATP產(chǎn)能系統(tǒng)進(jìn)行反硝化作用,如鐮刀菌屬(Fusarium)、木霉屬(Trichoderma)、柱孢屬(Cylindrocarpon)、毛殼屬(Chaetonium)、水稻惡苗病屬(Giberella)、青霉屬(Penicillium)、曲霉屬(Aspergillus)及其他半知菌類、絲狀真菌、酵母菌等.真菌反硝化需要少量的O2供應(yīng)，有氧呼吸產(chǎn)生ATP和反硝化過程同時(shí)在線粒體中進(jìn)行[19].

本論文通過免培養(yǎng)的高通量測序，發(fā)現(xiàn)屬水平、種水平分析結(jié)果均證明了脫氮塔中鐮刀菌屬腐皮鐮刀菌Fusariumsolani的存在.脫氮塔真菌群落結(jié)構(gòu)中還有曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)等種群.利用傳統(tǒng)微生物平板分離技術(shù)又從脫氮塔生物膜中分離出鐮刀菌屬的腐皮鐮刀菌，通過實(shí)驗(yàn)又證明了該腐皮鐮刀菌能發(fā)揮較強(qiáng)的反硝化作用.因此本論文的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Bollag和Tung,Shoun的發(fā)現(xiàn)實(shí)現(xiàn)了相互印證.但利用鐮刀菌屬真菌影響煙氣凈化中氮氧化物脫除效率的研究卻未見報(bào)道.

2.5 對脫氮塔脫氮效率的影響研究

通過前述實(shí)驗(yàn)室研究發(fā)現(xiàn)真菌3LNB菌株對NO3-具有較強(qiáng)的反硝化能力.為了研究其對脫氮塔NOx尤其是NO脫除效率的影響，本論文擴(kuò)大培養(yǎng)了真菌3LNB，將擴(kuò)大培養(yǎng)液添加至脫氮塔中，并對添加前后的脫氮效率進(jìn)行了監(jiān)測比較.擴(kuò)大培養(yǎng)液導(dǎo)入48 h后即可看見脫氮塔內(nèi)的大量白色的腐皮鐮刀菌，如圖10所示.

圖10 脫氮塔中的腐皮鐮刀菌(白色部分)Fig.10 Fusarium solani in denitrifying tower (white part)

3LNB菌株擴(kuò)大培養(yǎng)液加入脫氮塔前后NO,NOx的脫除效率曲線如圖11～圖12所示.從圖11～圖12可知，腐皮鐮刀菌3LNB菌株培養(yǎng)液加入后，NO,NOx的脫除效率分別平均提高了5.12%,5.36%.

圖11 3LNB培養(yǎng)液添加前后NO脫除率曲線Fig.11 Removal rate of NO before and after 3LNB culture adding

利用t檢驗(yàn)法[20]，檢驗(yàn)添加前后兩組NO,NOx脫除率平均數(shù)的差異是否顯著：

tNO=11.907>t0.01=3.055，PNO<0.01，差異顯著；

tNOx=10.939>t0.01=3.055，PNOx<0.01，差異顯著.

t檢驗(yàn)結(jié)果表明，腐皮鐮刀菌真菌擴(kuò)大培養(yǎng)液加入脫氮塔后，NO,NOx的平均脫除效率得到了顯著提高.說明腐皮鐮刀菌在與生物膜共同存在的條件下能顯著提高NO,NOx的脫氮效率.

這可能主要與腐皮鐮刀菌等真菌細(xì)胞存在細(xì)胞色素P450nor有關(guān).1993年，Nakahara等[10]發(fā)現(xiàn)在真菌的反硝化作用中，一種細(xì)胞色素P-450起著一氧化氮還原酶(NOR)的作用，被稱為細(xì)胞色素P450nor(nitric oxide reductase).它能以NADH為直接的電子供體，將NO還原成N2O.可能的催化機(jī)制：細(xì)胞色素P450nor首先與NO形成復(fù)合物，隨后細(xì)胞色素P450nor中的Fe3+被NADH還原成Fe2+，并將電子轉(zhuǎn)移給NO生成NO-，最后兩分子NO-生成N2O和H2O[10].真菌細(xì)胞色素P450nor催化NO還原的速度約為300 umol/(min·kg)，是細(xì)菌NO還原酶的5倍[21-24].其次與真菌發(fā)揮反硝化作用時(shí)對氧氣的適應(yīng)能力比細(xì)菌強(qiáng)等有關(guān)[7].

而在實(shí)驗(yàn)室中腐皮鐮刀菌與生物膜懸液協(xié)同作用時(shí)，其對NO3-的反硝化效率卻低于腐皮鐮刀菌純菌株，這可能提示微生物對NO,NOx的脫除機(jī)制與其對NO3-的脫除機(jī)制存在差異.

目前，關(guān)于腐皮鐮刀菌本身就有反硝化作用，其擴(kuò)大培養(yǎng)后與生物膜共同作用能顯著提高煙氣脫氮(NO,NOx)效率的研究很少.作為微生物的重要成員，真菌對于微生物凈化煙氣中NO,NOx的異養(yǎng)反硝化作用應(yīng)得到充分重視，應(yīng)研究發(fā)掘更多具有反硝化脫除NO,NOx的真菌菌種.真菌細(xì)胞色素P450nor可直接將部分NO還原為N2O，對這個更加經(jīng)濟(jì)的反硝化脫除NO途徑應(yīng)進(jìn)行全面系統(tǒng)的深入研究，這對于提高NO,NOx的脫除效率，推動微生物凈化煙氣NO,NOx技術(shù)的工業(yè)化進(jìn)程具有非常重要的意義.

3 結(jié) 論

1)從脫氮塔中分離純化的真菌3LNB菌株，經(jīng)形態(tài)觀察、脫氮特性研究、ITS序列分析，通過NCBI序列比對，鑒定真菌3LNB菌株為鐮刀菌屬的腐皮鐮刀菌Fusariumsolani.

2)高通量測序分析脫氮塔真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在屬水平上鐮刀菌屬(Fusarium)的相對豐度為0.73%；在種水平上腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)的相對豐度為0.04%，充分證明了脫氮塔中鐮刀菌屬的腐皮鐮刀菌(Fusariumsolani)的存在.

3)腐皮鐮刀菌3LNB具有較強(qiáng)的反硝化脫氮(NO3-)作用，是一株異養(yǎng)反硝化真菌.

4)擴(kuò)大培養(yǎng)后的腐皮鐮刀菌3LNB擴(kuò)大培養(yǎng)液與生物膜微生物共同作用，能顯著提高脫氮塔對煙氣中NO,NOx的脫除效率，NO,NOx脫除效率分別提高5.12%,5.36%.這可能主要與真菌細(xì)胞存在細(xì)胞色素P450nor有關(guān)，它具有較強(qiáng)的一氧化氮還原酶的性質(zhì).

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Isolation and Identification of a Fungi with Denitrification andIts Influence on Nitrogen Removal Efficiency of Biological Tower

ZOU Ping?，LI Chuankuan，XU Zhiqiang，CHEN Xinyi，SUN Peishi，BI Xiaoyi，WU Zhihao

(College of Ecology and Environment，Yunnan University，Kunming 650091，China)

At home and abroad,many studies of bacterial technology to remove NO and NOxhave been performed. However,the effect and mechanism of fungal were poorly studied. To improve the removal efficiency of NO and NOx,the fungi isolated and identified from the biofilm of denitrifying tower through shaking flasks experiment was studied on its nitrogen removal characteristics to nitrate (NO3-). Expanding culture was put into the denitrify tower to study its effect on the NO and NOxremoval efficiency. The fungal community structure through high-throughput sequencing analysis was monitored. The results showed that the strain 3LNB through morphological,nitrogen (NO3-) removal characteristics research,and ITS sequence analysis was identified asFusariumsolani. For up to 10.01 g/L of NO3-_N,the denitrifying rate of bacteria control group was 5.6% with nitrogen removal efficiency of 0.56 g/L,but the denitrifying rate of strain 3LNB was 15.1% with nitrogen removal efficiency of
1.51 g/L for 10 days,which proved that the strain 3LNB had strong denitrification function. The nitrogen removal rate of NO and NOxwas increased by 5.12% and 5.36% on average,respectively,after the expanding culture 400 mL (4%) of pure strain 3LNB was put into denitrifying tower,which proved that the strain 3LNB culture can improve removal rate of NO and NOxin denitrifying tower. This may be mainly related to the presence of cytochrome P450nor in fungi such asFusariumsolani.

denitrification tower；coal-fired flue gas；fungi；fusarium solani；denitrification

1674-2974(2017)06-0141-09

10.16339/j.cnki.hdxbzkb.2017.06.023

2016-10-24

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(51168046,51278447)，National Natural Science Foundation of China (51168046,51278447)；云南省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015FB111)，Natural Science Foundation of Yunnan Province(2015FB111)

鄒 平(1964—)，女，重慶人，云南大學(xué)副研究員，博士?通訊聯(lián)系人，E-mail：851517048@qq.com

X511

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