王松，游玲，陳杰，鄧小婭，王濤

（1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644000；2.宜賓學院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓644000）

響應面法優(yōu)化甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌J2B-74代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件

王松1，2，游玲1，2，陳杰1，鄧小婭1，王濤1，2

（1.宜賓學院生命科學與食品工程學院，四川宜賓644000；2.宜賓學院固態(tài)發(fā)酵資源利用四川省重點實驗室，四川宜賓644000）

為提高一株分離自濃香型白酒糟培的菌株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）J2B-74發(fā)酵產(chǎn)細菌素能力，以金黃色葡萄球菌為指示菌，以抑菌圈直徑為考察指標，在單因素試驗的基礎上采用響應面法優(yōu)化發(fā)酵工藝。結果表明：最優(yōu)發(fā)酵條件為發(fā)酵起始pH 6.0、發(fā)酵時間33.5 h、發(fā)酵溫度36.5℃，接種量1%，吐溫-80添加量5‰。在此條件下平均抑菌圈直徑為14.07 mm，較優(yōu)化前提高了32.36%。最優(yōu)發(fā)酵條件下獲得的實驗結果與模型預測值吻合，說明所建立的模型是切實可行的。

甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌細菌素；發(fā)酵條件；響應面法；優(yōu)化

濃香型白酒生產(chǎn)是一種固態(tài)的半自然發(fā)酵過程，發(fā)酵依賴于生產(chǎn)環(huán)境、曲藥、窖泥內(nèi)眾多微生物的協(xié)同參與。宜賓是中國濃香型白酒的重要產(chǎn)區(qū)，近千年的釀酒歷史、適宜的生態(tài)因子、相對特殊的釀酒工藝使其整個釀酒微生物區(qū)系存在相當?shù)奶厥庑浴Ｑ芯繄F隊多年來一直開展宜賓濃香型白酒釀酒微生物資源的系統(tǒng)研究[1-3]，其中從濃香型白酒發(fā)酵糟培分離到1株細菌產(chǎn)抑菌物質(zhì)的能力較好，經(jīng)驗證后確定該抑菌物質(zhì)為細菌素，且熱、酸穩(wěn)定性好，抑菌譜范圍廣，尤其對革蘭氏陽性菌抑制能力強。

細菌素的合成和分泌是受到嚴格調(diào)控的，細菌素生產(chǎn)一般與菌體生長同步，且隨著細菌數(shù)量的增多而增加分泌，菌體生長后期細菌素活性和數(shù)量又有所下降[4]。培養(yǎng)條件是菌體生長和細菌素合成的重要因素，培養(yǎng)條件的優(yōu)化對于細菌素產(chǎn)量的提高有非常重要的影響[5]。本研究以宜賓濃香型白酒糟培中分離得到的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）J2B-74為研究對象，通過單因素試驗和響應面法優(yōu)化發(fā)酵條件，探討該菌代謝產(chǎn)生細菌素的最優(yōu)發(fā)酵參數(shù)，以期為進一步深入研究，擴大菌種資源的利用奠定基礎[6-10]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)細菌素菌株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）J2B-74：分離自宜賓濃香型白酒廠酒糟，由固態(tài)發(fā)酵資源與利用四川省重點實驗室提供；指示菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aurous）ATCC 6538：中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture Collection Center，CGMCC）。

改良營養(yǎng)瓊脂（nutrient agar，NA）液/固體培養(yǎng)基：取100g出窖酒糟，加500mL蒸餾水，室溫充分攪拌混勻，115℃滅菌30 min后無菌紗布過濾，配制培養(yǎng)基定容至1 000 mL。1.2儀器與設備

牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉（均為生化試劑）：西隴化工股份有限公司；MJ-Ⅱ微生物培養(yǎng)箱：上海齊欣科學儀器有限公司；Eppendorf AG 5810冷凍離心機；T6新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 細胞發(fā)酵上清液的制備

按1%的接種量將BacillusmethylotrophicusJ2B-74接種至裝有200mLNA液體培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，發(fā)酵起始pH6.5，發(fā)酵溫度37℃，搖床轉(zhuǎn)速120 r/min，發(fā)酵時間24 h，結束發(fā)酵。發(fā)酵液在6℃、8 000 r/min條件下離心15 min，收集上清液，用5 mol/LNaOH調(diào)pH 6.5以中和有機酸的干擾，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除去菌體及其他雜質(zhì)，現(xiàn)制現(xiàn)用[11]。同時以未接種的NA液體培養(yǎng)基，經(jīng)同樣處理后作為空白對照。

1.3.2 抑菌活性測定（濾紙片擴散法）

該試驗通過抑菌圈大小反應細菌素產(chǎn)量。在直徑90mm無菌培養(yǎng)皿中接入指示菌種子液100 μL涂布均勻，均勻放置直徑為6 mm無菌紙片3個，加入25 μL無細胞發(fā)酵上清液于紙片上；將培養(yǎng)皿放置在恒溫培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)24 h，觀察測量包括紙片在內(nèi)的透明圈直徑，3組平行測量后取平均值[12]。

1.3.3 單因素試驗

（1）接種量的影響

分別以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的接種量接種J2B-74，發(fā)酵起始pH為6.0、培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24 h，結束發(fā)酵，取樣并測定發(fā)酵上清液的抑菌活性。

（2）發(fā)酵溫度的影響

按1.0%的接種量接種菌株J2B-74，發(fā)酵起始pH 6.0，分別置于28℃、31℃、34℃、37℃、40℃培養(yǎng)溫度下，培養(yǎng)時間24 h，結束發(fā)酵，取樣并測定發(fā)酵上清液的抑菌活性。

（3）發(fā)酵起始pH值的影響

按1.0%的接種量接種菌株J2B-74，分別設置發(fā)酵起始pH值為4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24 h，結束發(fā)酵，取樣并測定發(fā)酵上清液的抑菌活性。

（4）吐溫-80的影響

按1.0%的接種量接種菌株J2B-74，分別添加0、1%、2%、3%、4%、5%、6%的吐溫-80，初始培養(yǎng)pH6.0，培養(yǎng)溫度37℃，培養(yǎng)時間24 h，結束發(fā)酵，取樣并測定發(fā)酵上清液的抑菌活性[13]。

（5）培養(yǎng)時間的影響

按1%的接種量接種菌株J2B-74，發(fā)酵起始pH值為6.0，培養(yǎng)溫度37℃，每隔3 h取樣，至42 h結束，測定發(fā)酵上清液的抑菌活性，并采用分光光度計在波長600 nm條件下測定不同培養(yǎng)時間菌株J2B-74菌懸液的濃度，繪制生長曲線。

1.3.4 響應面優(yōu)化

以單因素試驗優(yōu)化結果為基礎，選取發(fā)酵起始pH值（A）、發(fā)酵時間（B）、發(fā)酵溫度（C）3個影響較為顯著的因素為自變量，以抑菌圈直徑為響應值，進行中心組合試驗設計。每個試驗重復3次，每次做3個平行，取平均值，試驗因素及編碼水平見表1。將試驗后的數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，并對回歸方程進行方差分析及擬合度檢驗。

表1 中心組合試驗因素及編碼水平Table 1 Factors and levels of central composite design

1.3.5 模型的驗證

通過響應面法優(yōu)化Bacillus methylotrophicusJ2B-74代謝產(chǎn)抑菌物質(zhì)的發(fā)酵條件；在優(yōu)化條件下進行發(fā)酵試驗，通過比較預測值和試驗值驗證模型的有效性。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2010統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析和差異顯著性分析，采用Design Expert8.0.6軟件進行響應面分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 接種量的影響

接種量對菌株J2B-74產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響見圖1。由圖1可知，當接種量≥1.0%時，方差分析結果顯示不同接種量對該抑菌圈直徑影響并不顯著（P＞0.05），細菌素是由細菌通過核糖體合成的微生物初級產(chǎn)物，細菌素的產(chǎn)量與菌體生長情況密切相關[14]，雖然本試驗最開始采用了不同的接種量，但是在發(fā)酵24 h后，各處理菌體數(shù)量基本一致，說明細菌素的代謝合成量也應該差異不大。因此固定接種量條件為1.0%，并不作為后期響應面優(yōu)化試驗的考察因素。

圖1 接種量對菌株J2B-74抑菌效果的影響Fig.1 Effect of inoculum on bacteriocin production of strain J2B-74

2.1.2 發(fā)酵溫度的影響

發(fā)酵溫度對菌株J2B-74產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響見圖2。如圖2所示，28℃時菌體生長受到強烈抑制，生長緩慢，抑菌圈直徑很小，在28～34℃區(qū)間內(nèi)隨著溫度升高，菌體生長速度加快，抑菌圈直徑上升趨勢明顯；當發(fā)酵溫度為37℃時，抑菌圈直徑達到最大，為11.14 mm，同時在34～37℃溫度范圍內(nèi)，菌體生長良好，抑菌圈直徑較大；而當發(fā)酵溫度為40℃時，抑菌圈直徑顯著下降，菌體生長也受到明顯抑制。發(fā)酵溫度對細菌自身的生長和菌體的合成代謝及其產(chǎn)物都有很大的影響，不同細菌產(chǎn)細菌素的最適培養(yǎng)溫度差異較大，同時很多研究表明，菌株產(chǎn)細菌素的最適溫度與菌株生長最適溫度存在明顯偏差，通常在低于菌體最適生長溫度的條件下細菌素的產(chǎn)量更高[15]，但從結果看本實驗菌株產(chǎn)細菌素最適溫度與菌株最適生長溫度差異不顯著，推測可能是菌株長期處于窖池內(nèi)的復雜環(huán)境體系，壓力、氧氣、酸、醇等環(huán)境因素促使其生長時盡快產(chǎn)生細菌素，幫助菌株適應其競爭環(huán)境。選擇發(fā)酵溫度37℃作為響應面的中心點。

圖2 發(fā)酵溫度對菌株J2B-74抑菌效果的影響Fig.2 Effect of fermentation temperature on bacteriocin production of strain J2B-74

2.1.3 發(fā)酵起始pH的影響

圖3 培養(yǎng)基起始pH對菌株J2B-74抑菌效果的影響Fig.3 Effect of initial pH on bacteriocin production of strain J2B-74

發(fā)酵初始pH對菌株J2B-74產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響見圖3。由圖3可知，發(fā)酵起始pH對Bacillus methylotrophicusJ2B-74產(chǎn)細菌素影響較大，在初始pH為4.5～8.5范圍內(nèi)，隨著pH增大，細菌素產(chǎn)量呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，在初始pH為 6.0的時候抑菌圈直徑達到最大，直徑為11.29 mm。過酸或偏堿性條件抑制該菌的生長，也相應抑制細菌素的產(chǎn)生；同時本實驗菌種分離至濃香型白酒釀造糟培，在長期生產(chǎn)實踐過程中逐漸適應糟培偏酸性環(huán)境，能夠在中性偏酸的環(huán)境下較好的生長，從而有利于細菌素的產(chǎn)生，因此選擇起始pH為6.0作為響應面的中心點。

2.1.4 J2B-74生長曲線及發(fā)酵時間的影響

菌株J2B-74的生長曲線與不同時間條件下的產(chǎn)抑菌物質(zhì)見圖4。由圖4可知，0～6 h為適應期，菌體生長量和細菌素產(chǎn)量幾乎為0；6～21 h為對數(shù)生長期，在此期間抑菌圈直徑隨時間緩慢增大；發(fā)酵21 h后菌體數(shù)量達到最大值，細菌素開始快速積累，抑菌圈直徑隨發(fā)酵時間增長而快速增長，在33 h時達到最大值；之后菌體生長進入衰亡期，抑菌活性開始減弱，抑菌圈直徑快速降低。

圖4 菌株J2B-74生長曲線與其抑菌效果Fig.4 Growth curve of strain J2B-74 and bacteriocin production of strain J2B-74

細菌素是細菌用于調(diào)控菌群結構的一種有效方式，一般都是在菌體增殖到一定數(shù)量后才開始分泌并一直延續(xù)到平臺期[16]。菌株J2B-74進入對數(shù)生長期后，細胞數(shù)量急劇增加，當胞外信息素的濃度達到一個閾值時，細菌素的合成和分泌開始啟動[17]；當菌體數(shù)量達到最大值時（21 h），生存空間和營養(yǎng)素開始出現(xiàn)不足，這時菌體產(chǎn)生大量細菌素來適應環(huán)境，從而獲得更多的養(yǎng)料與生存空間來維持自身的生存。進入衰亡期后（33 h），隨著菌體大量死亡，細菌素產(chǎn)量下降；同時一部分菌體自溶，大量的蛋白酶類釋放出來，細菌素被大量降解，導致抑菌圈直徑急速減小。因此選擇33 h作為菌株產(chǎn)細菌素的最佳培養(yǎng)時間，并以此時間為響應面分析因素的中心點。

2.1.5 吐溫-80對抑菌活性的影響

吐溫-80對菌株J2B-74產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響見圖5。由圖5可知，吐溫80對產(chǎn)細菌素影響不顯著，即使吐溫添加量為0，細菌素產(chǎn)量仍然可達到一個較高的水平，但添加吐溫-80后抑菌圈直徑普遍增大，當添加量為5‰時達最大，直徑為11.61 mm，繼續(xù)添加抑菌圈直徑反而降低。細菌素合成后需要釋放到周圍環(huán)境中去才能實現(xiàn)菌群調(diào)控的作用，吐溫-80作為一種乳化劑，可以改善微生物細胞膜的通透性，促進營養(yǎng)物質(zhì)進入細胞及代謝產(chǎn)物排出體外，進而促進細菌素的產(chǎn)生和活力的增強。但過量的吐溫-80會影響細菌素的合成和純化，因此選擇5‰為吐溫-80的最適添加量[18]。

圖5 吐溫-80對菌株J2B-74產(chǎn)抑菌物質(zhì)的影響Fig.5 Effect of Tween-80 on bacteriocin production of strain J2B-74

2.2 響應面分析

2.2.1 回歸模型的建立

中心組合試驗方案及結果見表2。采用中心組合試驗設計，用Design Expert 8.06軟件對表中數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到回歸方程為：

表2 中心組合試驗方案及結果Table 2 Design and results of central composite tests

2.2.2 回歸模型方差分析

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，回歸模型的P＜0.000 1，失擬項的P=0.140 3，模型回歸極顯著（P＜0.01），失擬檢驗不顯著，說明未知因素對試驗結果干擾很小，模型適當。同時，該模型的決定系數(shù)為0.992 9，說明該方程與實際情況擬合很好，可用該模型對Bacillus methylotrophicusJ2B-74代謝產(chǎn)細菌素的培養(yǎng)條件進行分析和預測。模型中一次項X3極顯著（P＜0.01），X2顯著（P＜0.05），X1不顯著（P＞0.05）；二次項X12、X22、X32均為極顯著水平（P＜0.01）；交互項X1X2、X1X2、X1X2均不顯著（P＞0.05）。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

2.2.3 響應曲面圖及驗證試驗

根據(jù)回歸方程，采用Design Expert 8.06軟件對該模型繪制響應曲面圖，考察所擬合的響應曲面的形狀，不同因素交互作用對菌株抑菌圈直徑的影響見圖6。

圖6分別反映了發(fā)酵培養(yǎng)基的初始pH和發(fā)酵時間，起始pH和發(fā)酵溫度，發(fā)酵時間和溫度之間的影響和關系。通過多項回歸方程可知，二次項的系數(shù)均為負值，表明該曲面圖的開口向下，因此存在極大值點，即菌株J2B-74無菌發(fā)酵液相對抑菌圈最大時的最佳發(fā)酵條件。由軟件分析所得最佳發(fā)酵條件為起始pH5.99，發(fā)酵時間33.53 h，發(fā)酵溫度36.52℃。在此條件下抑菌圈直徑為14.13 mm。

考慮試驗結果的可操作性，調(diào)整培養(yǎng)條件為：起始pH6.0、發(fā)酵時間33.5 h、發(fā)酵溫度36.5℃。為驗證響應曲面法所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行3次平行試驗，實際測得的平均抑菌圈直徑為14.07 mm，與預測值擬合率達99.31%，證明應用響應曲面優(yōu)化菌株J2B-74產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件是可行的。優(yōu)化后的抑菌圈直徑比優(yōu)化前（10.63 mm）提升了32.36%，說明本試驗所確定的優(yōu)化方案的設計合理有效，所獲得的培養(yǎng)條件能夠明顯提高細菌素的產(chǎn)量。

圖6 起始pH、發(fā)酵溫度和發(fā)酵時間交互作用對抑菌圈直徑的影響Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between initial pH,fermentation temperature and time on inhibition zone diameters

3 結論

在單因素試驗的基礎上，利用響應面法對Bacillus methylotrophicusJ2B-74代謝產(chǎn)細菌素的發(fā)酵條件進行了優(yōu)化，建立了抑菌圈直徑與培養(yǎng)基起始pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間3個因素的二次多項式回歸模型，驗證試驗證明該模型合理可靠，并確定Bacillus methylotrophicusJ2B-74代謝產(chǎn)細菌素的最佳培養(yǎng)條件為發(fā)酵起始pH為6.0、發(fā)酵時間33.5 h、發(fā)酵溫度36.5℃。在此條件下抑菌圈直徑可達14.07 mm，較優(yōu)化前提高了32.36%。

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Optimization of fermentation conditions ofBacillus methylotrophicusJ2B-74 for bacteriocin production by response surface methodology

WANG Song1,2,YOU Ling1,2,CHEN Jie1,DENG Xiaoya1,WANG Tao1,2
(1.College of Life Science and Food Engineering,Yibin University,Yibin 644000,China; 2.Key Laboratory of Sichuan Province for the Utilization of Solid State Fermentation Resources,Yibin University,Yibin 644000,China)

The fermentation conditions ofBacillus methylotrophicusJ2B-74,isolated from Luzhou-flavorBaijiuZaopei,were optimized for bacteriocin production.Staphylococcus aureuswas used as indicator bacterium and inhibition zone diameter was used as evaluation index of antibacterial activity.Based on the single factor tests,the optimal fermentation conditions for antibacterial components production were explored by response surface methodology.Results indicated that the optimal fermentation conditions were initial pH 6.0,fermentation time 33.5 h,temperature 36.5℃,inoculum 1%,and Tween-80 5‰.Under the optimal conditions,the inhibition zone diameter was 14.07 mm,which was 32.36%higher than that before optimization.Therefore,it is feasible for the established model due to the consistent results between the prediction and experimental value.

Bacillus methylotrophicusbacteriocin;fermentation conditions;response surface methodology;optimization

TS262.3

0254-5071（2017）06-0042-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.009

2016-12-24

四川省科技廳支撐計劃項目(15ZC0141)；香源生物及產(chǎn)香生物技術四川高?？蒲袆?chuàng)新團隊建設計劃資助（14TD0031）

王松（1982-），男，講師，碩士，研究方向為食品生物技術及副產(chǎn)物利用。