陳君，李蕾，陳國華，劉傳亮，李文通

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院 研究生院，山東 濰坊 261042；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 保健三科，

山東 濰坊 261041；3.山東省濰坊市人民醫(yī)院 健康管理中心，山東 濰坊 261041）

芪參益氣滴丸對大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機制研究

陳君1，李蕾2，陳國華3，劉傳亮2，李文通1

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院 研究生院，山東 濰坊 261042；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 保健三科，

山東 濰坊 261041；3.山東省濰坊市人民醫(yī)院 健康管理中心，山東 濰坊 261041）

目的 探討芪參益氣滴丸（QS）對大鼠心肌缺血再灌注時，心肌細胞尿路上皮癌胚抗原1（UCA1）長鏈非編碼RNA、凋亡及凋亡相關(guān)基因表達的影響。方法結(jié)扎SD大鼠冠狀動脈左前降支，造成心肌缺血40 min后剪斷結(jié)扎線，再灌注120 min，復(fù)制實驗性心肌缺血再灌注模型，將36只大鼠隨機分為假手術(shù)組（只穿刺不結(jié)扎，Control組）、缺血再灌注組（I/R組）、QS干預(yù)組（QS+I/R組），術(shù)后采用原位末端標記法檢測心肌細胞凋亡指數(shù)，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析并檢測3組大鼠心臟組織中UCA1的表達，Western blot檢測p27蛋白表達水平。結(jié)果QS+I/R組的細胞凋亡數(shù)與I/R組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與I/R組比較，QS+I/R組UCA1整體表達水平上升，而p27蛋白減少（P＜0.05）；并且UCA1與p27蛋白的表達呈負相關(guān)。結(jié)論QS能降低大鼠缺血再灌注心肌細胞凋亡率，其可能通過上調(diào)UCA1水平，減少p27蛋白表達，保護損傷的心肌細胞。

芪參益氣滴丸；心肌缺血再灌注；細胞凋亡；尿路上皮癌胚抗原1；p27蛋白

缺血性心臟病是冠狀動脈疾病死亡的最常見原因。對缺血心肌的血流再恢復(fù)雖然能降低整體死亡率，但是增加了再灌注損傷，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），這極易導(dǎo)致心力衰竭、心律失常，甚至猝死，嚴重影響患者心功能。目前，中藥制劑防治MIRI研究已取得長足進展[1-2]。大量研究表明，芪參益氣滴丸（qishenyiqi dripping pills，QS）對 MIRI具有一定保護作用[3]，但其作用機制卻少有研究。本實驗以SD大鼠復(fù)制MIRI模型，進一步探索研究芪參益氣滴丸對MIRI的保護作用。

1 材料與方法

1.1 復(fù)制心肌缺血再灌注模型

健康雄性SD大鼠36只，體重210～240g，由濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)實驗室提供。36只大鼠隨機分成3組，即假手術(shù)組（Control組）、缺血再灌注組（I/R組）及芪參益氣滴丸（天津天士力股份有限公司）干預(yù)組（QS+I/R組）。常規(guī)復(fù)制大鼠缺血再灌注模型[4]。Control組只穿線不結(jié)扎，用生理鹽水灌胃，3次/d，持續(xù)4周；I/R組：缺血40 min后再灌注120 min，復(fù)制心肌缺血再灌注模型前給予生理鹽水灌胃，3次/d灌服，連續(xù)4周；QS+I/R組：復(fù)制模型同I/R組，復(fù)制模型前給予芪參益氣滴丸1.5 g/（kg·次）灌胃，溶于2 ml生理鹽水中，3次/d灌胃，連續(xù)灌服4周。

1.2 觀察指標

1.2.1 心肌細胞凋亡測定 大鼠再灌注后2%戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg，腹腔注射），采取靜脈血2.5 ml，快速取出心臟，摘除血管、脂肪等多余組織，10%甲醛固定，30%蔗糖脫水，取心肌組織約5 mm厚，石蠟包埋，制成5 μm切片。每只大鼠隨機取5張切片，根據(jù)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標記法，嚴格照說明書步驟對進行操作。切片放置光鏡下觀察，高倍鏡下正常心肌細胞核呈深藍色，顯示棕色核者為凋亡細胞（見圖1）[5]。細胞凋亡測定設(shè)備購自德國寶靈曼公司。每張切片中各選取5個高倍鏡下視野，觀察并計算心肌細胞凋亡率（心肌細胞凋亡率=鏡下心肌細胞凋亡數(shù)/鏡下心肌細胞總數(shù)×100%）。

1.2.2 心肌組織中尿路上皮癌胚抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）的表達 提取新鮮心肌組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA后，采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析并檢測 3 組大鼠心臟組織中UCA1的表達，具體操作步驟參考文獻[6]。

1.2.3 Western blot檢測p27蛋白的表達 各組大鼠處死后取出心臟，取結(jié)扎線以下的左心室心肌組織，加入蛋白裂解液中研磨，取其變性后的上清液進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，10%脫脂奶粉、三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗滌，加入 p27一抗，4℃過夜，加入相應(yīng)二抗孵育30 min，用增強化學(xué)發(fā)光法試劑顯影，凝聚成像系統(tǒng)進行掃描處理。Quality one軟件對顯色后結(jié)果進行灰度分析，并計算出p27蛋白的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊則兩兩比較用SNK-q檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪參益氣滴丸對大鼠心肌細胞凋亡的影響

在熒光顯微鏡下，I/R組、QS+I/R組及Control組細胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。QS+I/R組大鼠的細胞凋亡率低于I/R組，但兩組均高于Control組。見附表和圖1、2。

附表 3組大鼠心肌細胞凋亡率、UCA1及p27蛋白表達的比較 （n=12，±s）

附表 3組大鼠心肌細胞凋亡率、UCA1及p27蛋白表達的比較 （n=12，±s）

組別p27蛋白Control組 2.34±0.25 1.03±0.13 0.58±0.08 I/R 組 10.03±0.97 0.39±0.04 1.23±0.12 QS+I/R 組 4.18±0.59 0.72±0.11 0.75±0.10 F值 8.330 26.590 10.350P值 0.002 0.007 0.015細胞凋亡率/%UCA1

2.2 芪參益氣滴丸對大鼠心肌細胞UCA1表達水平的影響

I/R組、QS+I/R組及Control組長鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）UCA1表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。QS+I/R組和I/R組大鼠UCA1表達較Control組下降，但QS+I/R組大鼠UCA1表達下降程度低于I/R組。見附表和圖3。

圖1 3組大鼠心肌細胞凋亡情況 （熒光顯微鏡×200）

圖2 3組大鼠心肌細胞凋亡率比較 （n=12，±s）

圖3 3組大鼠心肌細胞UCA1相對表達量 （n=12，±s）

圖4 3組大鼠心肌細胞p27蛋白相對表達量（n=12，±s）

2.3 芪參益氣滴丸對大鼠心肌細胞p27蛋白表達的影響

I/R組、QS+I/R組及Control組p27蛋白表達水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。QS+I/R組和I/R組大鼠p27蛋白表達較Control組升高，但QS+I/R組大鼠p27蛋白表達水平低于I/R組。見附表和圖4、5。

圖5 p27蛋白的表達

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是臨床上冠狀動脈內(nèi)溶栓、冠狀動脈搭橋及心血管介入治療中常見的嚴重并發(fā)癥，其發(fā)生機制復(fù)雜[7]。研究發(fā)現(xiàn)，細胞凋亡參與MIRI過程，并在缺血再灌注誘導(dǎo)的病理過程中發(fā)揮重要作用[8]。抑制心肌細胞凋亡可顯著縮減I/R后心肌梗死體積，減輕心肌損傷，改善心功能[9-10]。因此，減少或抑制MIRI中心肌細胞凋亡，對臨床治療和預(yù)防MIRI，改善心肌梗死患者預(yù)后具有重要意義。最新研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA UCA1可通過下調(diào)腫瘤抑制基因p27，對心肌細胞凋亡產(chǎn)生影響[11]。這對研究MIRI中有關(guān)參與調(diào)節(jié)細胞凋亡程序的分子成分提供新的視角。

LncRNA UCA1是最近幾年發(fā)現(xiàn)的一種長鏈非編碼RNA，其最早在人膀胱移行細胞癌中發(fā)現(xiàn)，并在膀胱癌患者的尿液中檢出[12]。在正常成人中，UCA1基因僅在心臟、脾臟表達，并且心臟表達水平較高，表明其可能是潛在的心血管疾病的標志物[13-14]。有研究表明，在膀胱惡性腫瘤細胞中，膀胱癌細胞中UCA1下調(diào)能夠降低膀胱癌細胞的增殖，促進細胞凋亡，提示心肌組織中UCA1表達下調(diào)可能起抑制心肌細胞增殖，促進心肌細胞凋亡的作用，表明UCA1可能在心臟保護方面發(fā)揮重要作用[15]。

p27蛋白作為一種腫瘤抑癌基因，可參與多種基因和蛋白的調(diào)控，主要是通過抑制細胞周期或者其他不確定機制來實現(xiàn)[16]，TAMAMORI-ADACHI等[17]報道，p27蛋白表達的下調(diào)能夠促進大鼠新生心肌細胞的增殖。本研究結(jié)果表明，I/R組大鼠不僅細胞凋亡數(shù)增加，而且心肌細胞p27蛋白表達也上升，提示p27上調(diào)與細胞凋亡緊密相關(guān)。有研究證實，p27蛋白的過度表達抑制心肌活性，促進細胞凋亡[18]。

本實驗中筆者發(fā)現(xiàn)，UCA1水平在大鼠缺血性心肌再灌注后降低，而p27蛋白的表達卻增加，p27蛋白的過度表達抑制心肌活性，促進細胞凋亡。研究表明，p27引發(fā)細胞凋亡機制與Caspase-3的激活有一定關(guān)聯(lián)[19]。心肌細胞凋亡潛在的確切分子機制可能包括依賴于UCA1下調(diào)的p27過度表達[11]。

參益氣滴丸是純中藥制劑，是中醫(yī)理論基礎(chǔ)上取自黃芪、丹參、降香及三七4味中藥精制而成的益氣活血處方。方中重用黃芪為君，取其補氣血、促血行和培元固本之效；丹參活血調(diào)血，兼養(yǎng)心血，安神定志，用之為臣；三七活血散瘀，助丹參祛瘀止痛，為佐藥；最后輔以降香行氣解郁，溫通行滯。諸藥合用，發(fā)揮良好協(xié)同作用，起到通絡(luò)止痛、益氣活血之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪能夠增強心肌收縮，擴張冠狀動脈，并能夠使患者的血漿內(nèi)皮素、腫瘤壞死因子、心鈉素、血管緊張素下降，有效修復(fù)心肌供血，調(diào)理患者血壓，對缺血心肌有保護作用[20]。丹參具有抗氧化、清除自由基和抑制細胞內(nèi)鈣超載、維持心肌能量代謝、減少血小板聚集、降低血液黏度、降低細胞凋亡因子的表達等作用，有效緩解冠狀動脈痙攣，改善心肌血供和代謝，臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[21]。三七中的三七總皂成分具有擴張冠狀動脈、增加冠狀動脈血流量的作用，還能夠降低血壓，改善心肌供血，提高心功能；降香能夠降低炎癥反應(yīng)，抑制細胞壞死，抑制血栓形成，改善局部微循環(huán)[22-23]。綜上所述，芪參益氣滴丸通過多層面、多體系的參與，對心肌缺血再灌注損傷起到一定保護作用。

本研究重點觀察芪參益氣滴丸對缺血再灌注模型大鼠心肌UCA1和p27蛋白表達的影響，結(jié)果顯示，芪參益氣滴丸治療組的細胞凋亡數(shù)少于I/R組。與I/R組比較，QS+I/R組UCA1表達水平上升，同時p27蛋白降低。并且發(fā)現(xiàn)UCA1與p27蛋白的表達呈負相關(guān)，提示芪參益氣滴丸可能通過上調(diào)UCA1水平，減少p27蛋白表達，減少心肌細胞凋亡。已有研究證實，UCA1可通過下調(diào)腫瘤抑制基因p27，對心肌細胞凋亡產(chǎn)生影響[11]。

綜上所述，芪參益氣滴丸可減少心肌細胞凋亡，對缺血再灌注心肌損傷有一定保護作用，其作用機制可能與上調(diào)UCA1水平、減少p27蛋白表達相關(guān)。

[1]GINISTY H,SICARD H,ROGER B,et al.Structure and functions of nucleolin[J].J Cell Sci,1999,112(Pt 6):761-772.

[2]李偉,沈明勤,陸曉暉.中藥防治心肌缺血再灌注損傷作用機制的研究進展[M].中華中醫(yī)藥雜志,2011,26(3):549-553.

[3]林色奇,韓晶巖,劉紅寧.芪參益氣滴丸及其組成中藥抗缺血再灌注損傷的研究進展[J].江西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報,2011,23(6):96-100.

[4]馬瑞松,江洪,李元紅,等.青蒿素對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響及其作用機制探討[J].海南醫(yī)學(xué),2016,27(11):1734-1736.

[5]GAVRIELI Y,SHERMAN Y,SHMUEL A,et al.Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation[J].J Cell Biol,1992,119:493-501.

[6]李芳,李旭,王帆,等.熒光定量PCR檢測UCA1 mRNA方法學(xué)建立及臨床評估[J].分子診斷與治療雜志,2012,4(3):171-176.

[7]TURER AT,HILL JA.Pathogenesis of myocardial ischemia-reperfusion injury and rationale for therapy[J].Am J Cardiol,2010,106(3):360-368.

[8]SMITH C C,DAVIDSON S M,LIM S Y,et al.Necrostatin:a potentially novelcardioprotective agent[J].Cardiovasc Drugs Ther,2007,21:227-233.

[9]LEE P,SATA M,LEFER D J,et al.Fas pathway is a critical mediator ofcardiac myocyte death and MI during ischemia-reperfusion in vivo[J].Am J Physiol Heart Cric Physiol,2003,284(2):H456-H463.

[10]BROCHERIOU V,HAGEGE A A,OUBENAISSA A,et al.Cardiac functional improvement by a human Bcl-2 transgene in a mouse model of ischemia/reperfusion injury[J].J Gene Med,2000,2(5):326-333.

[11]LIU Y,ZHOU D,LI G,et al.Long non coding RNA-UCA1 contributes to cardiomyocyte apoptosis by suppression of p27 expression[J].Cell Physiol Biochem,2015,35(5):1986-1998.

[12]WANG X S,ZHANG Z,WANG H C,et al.Rapid identificationof UCA1 as a very sensitive and specific unique marker forhuman bladder carcinoma[J].Clinical Cancer Research,2006,12(16):4851-4858.

[13]GAZZAR M,CHURCH A,LIU T,et al.Microrna-146 aregulatesboth transcription silencing and translationdisruption of TNF-α during TLR4-induced gene reprogramming[J].J Leukoc Biol,2011,90:509-519.

[14]WANG X S,ZHANG Z,WANG H C,et al.Rapid identificationof UCA1 as a very sensitive and specific unique marker forhuman bladder carcinoma[J].Clinical Cancer Research,2006,12(16):4851-4858.

[15]EL GAZZAR M,CHURCH A,LIU T,et al.Microrna-146 aregulates both transcription silencing and translationdisruption ofTNF-α duringTLR4-induced genereprogramming[J].J Leukoc Biol,2011,90:509-519.

[16]張欣,張志剛.p27基因和蛋白表達的調(diào)控及其在腫瘤發(fā)生機制中的作用[J].國際病理科學(xué)與臨床雜志,2009,29(2):170-174.

[17]TAMAMORI-ADACHI M,HAYASHIDA K,NOBORI K,et al.Down-regulation of p27Kip1 promotes cell proliferation of rat neonatal cardiomyocytes induced by nuclear ex-pression of cyclin D1 and CDK4.Evidence forimpairedSkp2-dependent degradation of p27 in terminal differentiation[J].J Biol Chem,2004,279(48):50429-50436.

[18]SUN Y,WANG Y,YIN Y,et al.GSTM3 reverses the resistance of hepatoma cells to radiation by regulating the expression of cell cycle/apoptosis-related molecules[J].OncologyLetters,2014,8:1435-1440.

[19]HUANG J,ZHOU N,WATABE K,et al.Long non-coding RNA UCA1 promotes breast tumorgrowth by suppression of p27(Kip1)[J].Cell Death Dis,2014,5:DOI:10.1038/cddis.2013.541.

[20]李玉萍,顧兵,劉建濤.丹參酮IIA的研究進展[J].時珍國醫(yī)國藥,2010,21(7):1770-1772.

[21]蒙定水,趙清雨.活血化瘀法在冠心病心絞痛治療中的重要作用[J].吉林中醫(yī)藥,2005,10(8):16-18.

[22]李曉紅,吳小剛.芪參益氣滴丸治療慢性充血性心力衰竭療效觀察[J].臨床合理用藥,2010,3(15):41-42.

[23]賈海蓮.芪參益氣滴丸對缺血性心肌病心力衰竭患者心功能及NT-proBNP的影響[J].中國實驗方劑學(xué)雜志,2012,18(2):228-230.

（童穎丹 編輯）

Protective effect of Qishenyiqi Dripping Pills on rats with myocardial ischemia-reperfusion injury

Jun Chen1,Lei Li2,Guo-hua Chen3,Chuan-liang Liu2,Wen-tong Li1
(1.Graduate School,Weifang Medical University,Weifang,Shandong 261042,China;2.The Third Department of Health,3.Health Management Center,Weifang People's Hospital of Shandong,Weifang,Shandong 261041,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Qishenyiqi Dripping Pills on urothelial carcinoma antigen 1 (UCA1)LncRNA,apoptosis and apoptosis related gene expression of myocardial cells in rats with myocardial ischemia reperfusion.MethodsIschemia reperfusion injury model of SD rats was established by ligating left anterior descending branch of coronary artery for 40 min followed by reperfusion for 120 min.Thirty-six rats were randomly divided into sham operation group(only puncture wihout ligation),ischemia-reperfusion group(IR group)and Qishenyiqi intervention group (QS+IR group).After operation,the apoptosis index was detected by TUNEL method;fluorescence quantitative PCR technique and Western blot were used to detect the expression levels of UCA1 and p27 protein respectively.ResultsThe number of apoptosis in the QS+IR group was significantly smaller than that in the IR group(P＜0.05).The overall level of UCA1 expression significantly increased and p27 protein markedly decreased in the QS+IR group compared with the IR group(P＜0.05);and the expression of UCA1 was negatively correlated with the expression of p27 protein.ConclusionsQishenyiqi Dripping Pills can reduce myocardial apoptosis rate in rats with myocardial ischemia and reperfusion,which may protect the injured myocardial cells by increasing the level of UCA1 and reducing the expression of p27protein.

Qishenyiqi Dropping Pill;myocardial ischemia reperfusion;apoptosis;urothelial carcinoma antigen 1;p27 protein

R285

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.006

1005-8982（2017）12-0030-05

2016-11-23

陳國華，E-mail：13022783557@163.com