興桂華 柏青楊 弓 箭 叢 歡 董海影

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

·基礎(chǔ)研究·

NAPP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠行為學(xué)表現(xiàn)及遠(yuǎn)志皂苷對(duì)其調(diào)控作用

興桂華 柏青楊 弓 箭 叢 歡 董海影

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院臨床病理診斷中心，黑龍江 齊齊哈爾 161006)

目的 觀察APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠記憶功能障礙的行為學(xué)表現(xiàn)和遠(yuǎn)志皂苷對(duì)其學(xué)習(xí)記憶能力的保護(hù)作用。方法 將3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠隨機(jī)分為模型組、鹽酸多奈哌齊組、TEN低、中、高劑量組(18.5、37、74 mg·kg-1·d-1)，選同月齡C57BL/6小鼠為對(duì)照組。采用Morris水迷宮法和新物體識(shí)別試驗(yàn)檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，采用實(shí)時(shí)定量PCR及Western印跡方法檢測(cè)海馬神經(jīng)元Bcl-2、Bax和Caspase-3表達(dá)水平。結(jié)果 與模型組相比，TEN各劑量組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力明顯改善(P<0.05)；與模型組相比，TEN各劑量組Bax和Caspase-3表達(dá)水平明顯下降(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)。結(jié)論 TEN可改善小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，其途徑可能是通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)Bax表達(dá)，調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax的平衡比值，降低Caspase-3表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

遠(yuǎn)志皂苷；APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因；學(xué)習(xí)記憶

阿爾茨海默病(AD)臨床主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶、學(xué)習(xí)和認(rèn)知能力的喪失，主要病理特征為大腦皮層和海馬區(qū)的老年斑沉積，神經(jīng)原纖維纏結(jié)和大量神經(jīng)元的喪失等。在AD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，凋亡是其神經(jīng)元死亡的主要形式〔1〕，神經(jīng)細(xì)胞過(guò)度凋亡是造成神經(jīng)元丟失的主要原因。遠(yuǎn)志皂苷(TEN)是益智健腦中藥遠(yuǎn)志中的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有改善記憶、抗氧化、抗衰老和抗癡呆等作用〔2～4〕。本實(shí)驗(yàn)旨在探討TEN改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品 TEN由南京景竹生物科技有限公司提供(CAS：JZ20160327A)，經(jīng)HPLC測(cè)定純度≥98%；鹽酸多奈哌齊由衛(wèi)材(中國(guó))藥業(yè)有限公司制造，產(chǎn)品批號(hào)110917A。

1.2 動(dòng)物 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠(南京生物醫(yī)藥研究院，編號(hào)D000268)，3月齡雄性，50只；C57BL/6J小鼠，3月齡，雄性，10只。飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)飼養(yǎng)室。

1.3 主要試劑及儀器 YBR?ExScriptTMRT-PCR kit(Perfect Real Time)為T(mén)AKARA公司產(chǎn)品，RNAiso Reagent為T(mén)AKARA公司產(chǎn)品，DEPC為瑞興化學(xué)產(chǎn)品。Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗體購(gòu)于美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體購(gòu)于北京博奧森生物技術(shù)公司。2700型PCR System擴(kuò)增儀為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。ABI7300熒光定量PCR儀為美國(guó)ABI公司產(chǎn)品。

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物分組 APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠經(jīng)適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后完全隨機(jī)分組為模型組、鹽酸多奈哌齊組(0.33 mg/kg)，TEN低、中、高劑量組(18.5、37、74 mg/kg)，選同月齡C57BL/6小鼠為對(duì)照組，對(duì)照組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，連續(xù)灌胃90 d。

1.4.2 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 給藥結(jié)束后進(jìn)行Morris水迷宮行為測(cè)試。水迷宮為一直徑150 cm，高60 cm的不銹鋼圓形水池，內(nèi)置有機(jī)玻璃平臺(tái)，平臺(tái)高40 cm，底面為6 cm×10 cm。在東、西、南、北水池壁部位分別標(biāo)明入水點(diǎn)。將平臺(tái)放在西南象限正中距池壁22 cm處，迷宮中含牛奶液面高于安全平臺(tái)1 cm，池內(nèi)水溫(22±1)℃，水中加入奶粉使水呈乳白色以防動(dòng)物看到水下平臺(tái)，訓(xùn)練期間環(huán)境安靜，迷宮外參照物不變。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)前5 d為定位航行試驗(yàn)：每天將小鼠從東入水點(diǎn)頭朝池壁放入水池，4次/d。訓(xùn)練時(shí)隨機(jī)選擇1個(gè)入水點(diǎn)，將小鼠面向池壁放入水中，每次訓(xùn)練間隔為60 s。由頂部的紅外攝像頭記錄小鼠找到水下平臺(tái)的時(shí)間(逃避潛伏期)、游泳距離和軌跡，設(shè)定2 min為最長(zhǎng)逃避潛伏期，2 min后自動(dòng)停止記錄。實(shí)驗(yàn)第6天為空間探索試驗(yàn)：定位航行試驗(yàn)結(jié)束后將水下平臺(tái)撤除，在同一入水點(diǎn)將大鼠面向池壁放入水中，讓大鼠在無(wú)平臺(tái)情況下尋找記憶中的平臺(tái)，記錄在2 min內(nèi)跨過(guò)原平臺(tái)位置的次數(shù)。

1.4.3 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn) 檢測(cè)箱由黑色聚酯塑料材質(zhì)構(gòu)成的60 cm×40 cm×80 cm的封閉箱，箱左右內(nèi)側(cè)壁鑲嵌LED燈條，頂部懸掛攝像頭觀察動(dòng)物的活動(dòng)情況及探索過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)程分為適應(yīng)期、熟悉期和測(cè)試期3個(gè)階段，(1)適應(yīng)期：每天將小鼠依次放入檢測(cè)箱內(nèi)，熟悉環(huán)境10 min為期3 d；(2)熟悉期：第4天，將兩個(gè)完全相同的正方體紅色積木塊放入檢測(cè)箱內(nèi)對(duì)稱(chēng)的位置處，兩個(gè)積木距離箱側(cè)壁與箱后壁的距離均為10 cm，將小鼠放入熟悉5 min；(3)測(cè)試期：間隔30 min后將其中一個(gè)紅色積木替換為大小相近的綠色圓柱形積木，將小鼠放入檢測(cè)箱內(nèi)，記錄5 min內(nèi)小鼠對(duì)新穎物體即綠色圓柱形積木(TN)和紅色正方體即熟悉物體(TF)的探索時(shí)間，以小鼠鼻尖距被識(shí)別物體的距離不超過(guò)2 cm或用鼻子接觸到被識(shí)別物體為探究行為。應(yīng)用認(rèn)知指數(shù)(RI)來(lái)評(píng)價(jià)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力，計(jì)算公式為RI=TN/(TN+TF)×100%。

1.4.4 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)小鼠海馬組織Bcl-2、Bax及Caspase-3的mRNA表達(dá) 按RNAiso Reagent操作說(shuō)明書(shū)提取小鼠海馬組織總RNA，紫外分光光度計(jì)分析后用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的純度、濃度及完整性。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)在2700型PCR System擴(kuò)增儀上進(jìn)行，按SYBR?ExScriptTMRT-PCR Kit轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒方法操作，反應(yīng)參數(shù)如下：反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)42℃ 15 min，反轉(zhuǎn)錄酶失活反應(yīng)95℃ 2 min。PCR反應(yīng)：PCR反應(yīng)采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) kit試劑。引物由TaKaRa公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如下：Bcl-2：上游引物序列為5′-TGA ACC GGC ATC TGC ACA C-3′；下游引物序列為5′-CGT CTT CAG AGA CAG CCA GGA G-3′。Bax：上游引物序列為5′-AGA CAC CTG AGC TGA CCT TGG AG-3′；下游引物序列為5′-GTT GAA GTT GCCATCAGCAAACA-3′；Caspase-3：上游引物序列為5-GAGACAGACAGTGGAACTGACGATG-3，下游引物序列為5-GGCGCAAAGTGACTGGATGA-3。GAPDH：上游引物序列為5′-GAC AAC TTT GGC ATC GTG GA-3′；下游引物序列為5′-ATG CAG GGA TGA TGT TCT GG-3′。反應(yīng)條件如下：預(yù)變性，95℃，10 s (1個(gè)循環(huán))。PCR反應(yīng)，95℃，5 s；60℃，31 s(40個(gè)循環(huán))。反應(yīng)結(jié)束后，使用Sequence Detection software version1.2.3軟件(Applied Biosystems公司)分析PCR過(guò)程個(gè)檢測(cè)樣本的Ct(Threshold cycle)值。

1.4.5 Western印跡檢測(cè)小鼠海馬組織Bcl-2、Bax及Caspase-3蛋白表達(dá) 取每組小鼠各5只，待行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，迅速將小鼠斷頭取出腦組織進(jìn)行總蛋白的提取，采用BCA法對(duì)樣品蛋白質(zhì)濃度進(jìn)行檢測(cè)，取出蛋白質(zhì)50 μg加入2×SDS凝膠加樣緩沖液中，放置在水浴鍋中煮沸5 min以致使蛋白質(zhì)變性，經(jīng)10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h分離樣品。在70 mA恒流狀態(tài)下使膠中蛋白質(zhì)4℃冰箱過(guò)夜，之后經(jīng)電泳轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在5%脫脂奶粉中37℃封閉2 h。加入Bax、Bcl-2和Caspase-3一抗，4℃冰箱過(guò)夜。加入二抗37℃孵育，搖振2 h。利用Western印跡熒光發(fā)光檢測(cè)試劑盒發(fā)光、顯影、定影。晾干、拍照并進(jìn)行圖像分析。在Western印跡分析中，分別以對(duì)照組Bcl-2、Bax和Caspase-3雜交帶的積分光密度值為相對(duì)值，其他各組雜交帶的積分光密度值均與對(duì)照組雜交帶的積分光密度值相比，最后得出相對(duì)值。為了避免不同批次雜交的條件差異所致顯色長(zhǎng)短不一的誤差，故采用相對(duì)值進(jìn)行半定量分析各組的表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)的組間比較行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 TEN對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響

2.1.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果 第5天定位航行實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比模型組小鼠在第三象限停留時(shí)間(RTQ)與跨越隱匿平臺(tái)的次數(shù)明顯減少，而逃逸潛伏期延長(zhǎng)，入水朝向角度明顯增加(均P<0.05)；與模型組相比，鹽酸多奈哌齊組和TEN 各劑量組的RTQ與跨越隱匿平臺(tái)的次數(shù)明顯增加，逃逸潛伏期均明顯縮短，入水朝向角度明顯減小(均P<0.05)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力

與對(duì)照組比較:1)P<0.05；與模型組比較:2)P<0.05；下表同

圖1 各組小鼠定位航線(xiàn)實(shí)驗(yàn)軌跡圖

2.1.2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果 與對(duì)照組〔(75.94±19.59)%〕相比，模型組小鼠RI〔(47.04±10.77)%〕顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，鹽酸多奈哌齊組〔(69.49±17.25)%〕和TEN 高劑量組〔(68.87±13.11)%〕明顯增加(P<0.05)。另外低劑量組為(60.72±19.84)%，中劑量組為(65.45±15.06)%。

2.2 TEN對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組Bax和Caspase-3 mRNA的表達(dá)明顯升高，而B(niǎo)cl-2 mRNA 表達(dá)明顯降低(均P<0.05)；與模型組比較，鹽酸多奈哌齊組和TEN各劑量組Bax和Caspase-3 mRNA表達(dá)均明顯降低且Bcl-2 mRNA表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(P<0.05)。見(jiàn)表2。

2.3 TEN對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.05)，而B(niǎo)cl-2蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，TEN各劑量組Bax和Caspase-3的蛋白表達(dá)均明顯降低且Bcl-2蛋白表達(dá)呈現(xiàn)升高趨勢(shì)(均P<0.05)。見(jiàn)表2、圖2。

表2 TEN對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠Bcl-2、Bax和Caspase-3 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

A：對(duì)照組；B：模型組；C：鹽酸多奈哌齊組；D：TEN 低劑量組；E：TEN中劑量組；F：TEN高劑量組圖2 Bax、Bcl-2和Caspase-3的Western印跡檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

AD是一種神經(jīng)退行性疾病，病理特征為老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元變性或凋亡，其行為學(xué)改變表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶功能障礙和進(jìn)行性癡呆等。學(xué)習(xí)記憶障礙是AD主要臨床癥狀和特征，因此對(duì)學(xué)習(xí)記憶進(jìn)行評(píng)價(jià)是觀察AD模型及藥物治療效果的重要指標(biāo)之一〔5〕。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)是一種讓實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)習(xí)尋找不透明水中隱藏平臺(tái)的過(guò)程，主要應(yīng)用于檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶功能，是國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的檢測(cè)大鼠空間學(xué)習(xí)記憶理想而有效的測(cè)試方法〔6〕。應(yīng)用于AD 研究的動(dòng)物模型很多，APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠較好的模擬AD 患者的早期病理和行為特征，是目前國(guó)內(nèi)外比較公認(rèn)的AD轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型之一〔7，8〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明經(jīng)90 d 的TEN治療能夠改善AD模型小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力，同時(shí)經(jīng)過(guò)TEN治療后轉(zhuǎn)基因小鼠能夠記住站臺(tái)的位置，空間記憶能力明顯提高。物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)是一種評(píng)價(jià)動(dòng)物非空間工作識(shí)記憶能力的簡(jiǎn)單靈敏的方法〔9〕。

現(xiàn)已證實(shí)，AD神經(jīng)細(xì)胞凋亡與Bcl-2基因家族關(guān)系密切，其中Bax是一種重要的促進(jìn)細(xì)胞凋亡的基因，Bax蛋白作為線(xiàn)粒體膜上離子通道的組成成分使Cyt-c得以穿過(guò)線(xiàn)粒體膜，Cyt-c的釋放可看作是凋亡途徑中的始動(dòng)因素，其促使Caspase-9被激活，在凋亡途徑中具有重要作用〔10〕。Bcl-2 具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，通過(guò)干擾Cyt-c 的釋放而阻斷上游Caspase 蛋白酶的激活，抑制細(xì)胞的凋亡〔11〕。正常情況下Bcl-2和Bax在細(xì)胞內(nèi)保持平衡狀態(tài)，二者表達(dá)蛋白水平的相對(duì)比例是凋亡發(fā)生的決定性因素。因此，Bcl-2和Bax基因或蛋白?？勺鳛檠芯康蛲龅奶卣餍灾笜?biāo)。當(dāng)Bcl-2的過(guò)度表達(dá)可與Bax構(gòu)成異源二聚體而抑制細(xì)胞凋亡，Bax過(guò)量時(shí)形成Bax-Bax同源二聚體也可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Caspase 家族是哺乳動(dòng)物細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)者和執(zhí)行者，與Bcl-2 家族基因共同參與了線(xiàn)粒體介導(dǎo)的內(nèi)源性細(xì)胞凋亡途徑，其中 Caspase-3是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的核心、最關(guān)鍵的凋亡蛋白酶〔12〕。細(xì)胞凋亡早期時(shí)凋亡信號(hào)可激活 Caspase-3，而激活Caspase-3后可使細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞骨架的參與凋亡所必需的重要蛋白質(zhì)降解失活〔13，14〕。

TEN是益智健腦中藥遠(yuǎn)志中的主要活性成分，現(xiàn)代藥理研究表明其具有改善記憶、抗氧化、抗衰老和抗癡呆等作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TEN對(duì)APP/PS1 雙轉(zhuǎn)基因小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙有較好的改善作用，其機(jī)制可能是TEN上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，下調(diào)Bax蛋白表達(dá)，調(diào)節(jié)Bcl-2 /Bax 的平衡比值，使線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)得以保護(hù)，進(jìn)而阻止Cyt-c 經(jīng)線(xiàn)粒體間隙外漏到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，阻抑Caspase-3啟動(dòng)凋亡級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)發(fā)生，從而阻斷內(nèi)源性細(xì)胞凋亡通路，最終發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡作用。

1 Riedel WJ.Preventing cognitive decline in preclinical Alzheimer′s disease〔J〕.Curr Opin Pharmacol，2014；14:18-22.

2 傅 晶，張東明，陳若蕓.遠(yuǎn)志屬植物的皂苷類(lèi)成分及其藥理作用研究進(jìn)展〔J〕.中草藥，2006；37(1):144-6.

3 葉海燕，陳 勤.遠(yuǎn)志皂苷對(duì)Aβ1-40誘導(dǎo)的AD大鼠學(xué)習(xí)記憶功能障礙的保護(hù)作用機(jī)制研究〔J〕.中國(guó)新藥雜志，2013；22(22):2674-8.

4 楊賢志，陳 勤，陳慶林，等.遠(yuǎn)志皂苷對(duì)β淀粉樣蛋白1-40誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的抑制作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013；27(3):379-84.

5 Jankowsky JL，Melnikova T.Environmental enrichment mitigates cognitive deficits in a mouse model of Alzheimer′s disease〔J〕.J Neurosci，2005;25(21)：5217-24.

6 Spowart-Manning L，van der Staay FJ.Spatial discrimination deficits by excitotoxic lesions in the Morris water escape task 〔J〕.Behav Brain Res，2005;30(2)：269-76.

7 Zhao L，Liu S，Wang Y，etal.Effects of curculigoside on memory impairment and bone loss via anti-oxidative character in APP /PS1 mutated transgenic Mice〔J〕. PLoS One，2015;10：e0133289.

8 Xu Z，Xiao N，Chen Y，etal. Deletion of aquaporin-4 in APP /PS1 mice exacerbates brain Abeta accumulation and memory deficits〔J〕.Mol Neurodegener，2015;10：58.

9 宋廣青，孫秀萍，劉新民.大鼠物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)方法綜述〔J〕.中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2013;23(7)：55-60，67.

10 Schon EA，Manfredi G.Neuronal degeneration and mitochondrial dysfunction〔J〕.J Clin Invest，2003;111(3)：303-12.

11 Voutsadakis IA.Apoptosis and the pathogenesis of lymphoma〔J〕.Acta Oncol，2000;39：151-6.

12 Fetsch JF，Laskin WB，Tavassoli FA，etal.Superficial angiomyx oma (cutaneoua myxoma ).A clinicopatholgic study of 17 cases arising in the genital region〔J〕.Int I Gynecol Pathol，1997;16：325-34.

13 穆 慶，李百鷗.蛋白酶體抑制劑誘導(dǎo)卵巢癌 SKOV3 細(xì)胞凋亡中伴隨 Caspase 依賴(lài)的 BAG3 剪切〔J〕.現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學(xué)，2013;21(5)：991-4.

14 李 琴，郭云良，李 霞，等.胡黃連苷對(duì)大鼠腦缺血/再灌注損傷 Caspase-3 和 PARP 表達(dá)的影響〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2010;26(3)：342-5.

〔2017-01-16修回〕

(編輯 郭 菁/滕欣航)

國(guó)家自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目(No.81403131)

董海影(1982-)，女，博士，講師，主要從事神經(jīng)精神疾病的病理學(xué)研究。

興桂華(1969-)，女，碩士，教授，主要從事病理學(xué)研究。

R745.1

A

1005-9202(2017)13-3121-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.001