李兆疊+陸秋娜+齊梁煜+楊文林+零新嵐+韋家河+黃彥峰+馮雪萍

摘要：探討不同濃度蟬蛻水提取物對(duì)小鼠D-氨基半乳糖（D-GalN）急性肝損傷的保護(hù)作用。將60只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、D-GalN模型組（模型組）、聯(lián)苯雙酯滴丸組、蟬蛻水提取物低、中、高3個(gè)劑量組，共6組。每組小鼠均按每千克體重劑量灌胃給藥，連續(xù)給藥13 d，末次給藥12 h后，按600 mg/kg腹腔注射10% D-GalN誘導(dǎo)急性肝損傷模型。造模24 h后，計(jì)算小鼠肝指數(shù)，測定血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）活性及心肌組織、肝組織中超氧化物歧化酶（SOD）活性和丙二醛（MDA）含量，HE染色觀察肝組織病理學(xué)變化。結(jié)果表明，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、AST活性升高（P<0.01），肝臟、心肌組織中SOD活性降低，MDA含量增高（P<0.01），肝組織炎癥壞死廣泛。與模型組比較，蟬蛻水提取物的低、中、高劑量組及聯(lián)苯雙酯組小鼠肝臟指數(shù)及血清ALT、AST活性降低（P<0.01或P<0.05），肝臟、心肌組織中SOD活性升高，MDA含量降低（P<0.01或P<0.05），肝組織損傷程度顯著改善。蟬蛻水提取物對(duì)D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有一定的保護(hù)作用。

關(guān)鍵詞：蟬蛻；D-氨基半乳糖；肝損傷；保護(hù)作用

中圖分類號(hào)：R285.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）12-2313-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.028

Protective Effect of Periostracum cicdae Water Extract on D-galactosamine Induced Acute Liver Injury in Mice

LI Zhao-die，LU Qiu-na，QI Liang-yu，YANG Wen-lin，LING Xin-lan，

WEI Jia-he，HUANG Yan-feng，F(xiàn)ENG Xue-ping

（Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，Guangxi， China）

Abstract：To explore the protective effect of Periostracum cicdae water extract on D-GalN induced acute liver injury in mice.60 mice were randomly divided into 6 groups，blank control group，D-GalN model group （model group），bifendate pills group，water extract of Periostracum Cicadae low，middle，and high dose group. Each group of mice per kg of body weight dose administered by gastric administration，continuous administration of 13 d，on the last day of administration，according to the dosage of 600 mg/kg intraperitoneal injection of 10% D-GalN induced acute liver injury model. Modeling for 24 h，the calculation of the liver index，serum alanine aminotransferase（ALT），aspartate aminotransferase（AST） activity and myocardial tissue，liver tissue superoxide dismutase（SOD） activity and malondialdehyde（MDA） content. HE staining and pathological changes of liver tissue were observed. Results showed that compared with the blank control group，the liver index and the serum ALT，AST activity increased（P<0.01），liver，myocardial tissue SOD activity decreased，MDA content increased（P<0.01），liver tissue inflammatory necrosis of the liver.Compared with the model group，cicada slough water extract of low， middle，high dose group and bifendate pills groups of mice liver index and serum ALT，AST activity reduce （P<0.01 or P<0.05），liver，the myocardial tissue of SOD in myocardium increased，decreased the content of MDA（P<0.01 or P<0.05），The degree of liver tissue injury was significantly improved. The water extract of Periostracum cicdae has protective effect on D-GalN induced acute liver injury in mice.

Key words：Periostracum cicdae； D-galactosamine； liver injury； protective effect

隨著人類生活環(huán)境及飲食習(xí)慣的改變，肝臟疾病已成為威脅人類重要疾病之一，在中國以病毒性肝炎為主。因此，尋求抗肝損傷、肝纖維化等藥物日益受到關(guān)注[1-3]。

蟬蛻為蟬科（Periostracum cicdae）昆蟲黑蚱的幼蟲羽化時(shí)脫落的皮殼。蟬蛻性甘、寒，歸肺、肝經(jīng)。蟬蛻內(nèi)含甲殼質(zhì)（chitin）、蝶啶類色素、異黃質(zhì)喋呤（isoxanthopterin）、赤蝶呤（erythropterin）、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機(jī)酸、酚類等化合物。蟬蛻有疏散風(fēng)熱、利咽、透疹、明目退翳、解痙等功能，目前臨床上常用于治療風(fēng)熱感冒、咽痛音啞、麻疹不透、風(fēng)疹瘙癢、目赤翳障、驚風(fēng)抽搐、破傷風(fēng)[4]、疏風(fēng)除熱、哮喘[5]等疾病。本試驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，初步探討蟬蛻水提取物對(duì)D-氨基半乳糖胺致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品與試劑 蟬蛻，購買于廣西壯族自治區(qū)百色市某大藥房；聯(lián)苯雙酯滴丸（廣州白云山星群藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)A02141102）；D-氨基半乳糖（D-GaIN，上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)YS0918TA14）；谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、考馬斯亮藍(lán)（均購于南京建成生物工程研究所，批號(hào)分別為20150918、20150909、20150922、20150820、20150923）。

1.1.2 儀器 TD24A-WS型低速臺(tái)式離心機(jī)、722型可見分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司），XW-80A型旋渦混合器（上海醫(yī)科大學(xué)儀器廠），F(xiàn)SH-2A型可調(diào)高速電動(dòng)勻漿機(jī)（金壇市金南儀器廠），TGL-16G型離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器），HH-W600型三用恒溫水浴箱。

1.1.3 動(dòng)物 昆明種小鼠60只，雌雄各半，體重23～27 g，由右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，合格證：SCXK（桂）2012-0003。

1.2 方法

1.2.1 蟬蛻提取物的制備[6] 將蟬蛻放入清水中反復(fù)清洗，直至清洗蟬蛻的水變清澈，放入烘干箱中烘干，冷卻后粉碎并準(zhǔn)確稱取100 g，按料液比1∶10加入1 000 mL蒸餾水，冷凝回流提取1 h，冷卻至室溫后過濾，保存濾液并重新收集濾渣，再按料液比1∶8加入800 mL蒸餾水回流提取1 h，冷卻后過濾并合并兩次濾液，蒸發(fā)濃縮至恒定體積，4 ℃冷藏備用。

1.2.2 動(dòng)物分組及給藥 取60只小鼠按體重隨機(jī)分為空白對(duì)照組、模型組、聯(lián)苯雙酯滴丸組（0.15 g/kg）、蟬蛻水提取物的低、中、高（0.60、0.75、0.90 g/kg）劑量組共6組，每組10只。每組小鼠均按每千克體重劑量灌胃給藥，空白對(duì)照組和模型組每天給予等體積的生理鹽水，每天給藥1次，連續(xù)給藥13 d。

1.2.3 D-GaIN急性肝損傷模型的建立 給藥前將D-GaIN碾碎溶解并配制成10%生理鹽水溶液，加入1 mol/L NaOH調(diào)pH至7.0。造模各組小鼠末次給藥12 h后，按600 mg/kg腹腔注射10% D-GaIN溶液[7]； 空白對(duì)照組給予等體積的生理鹽水。小鼠禁食不禁水，末次給藥24 h后再次稱重，小鼠眼球采血，處死小鼠后迅速取出肝臟及心臟組織。

1.2.4 生化指標(biāo)的測定 小鼠眼球取血后3 000 r/min離心10 min，取血清冷藏備用，按相應(yīng)試劑盒說明分別測定血清中ALT和AST活性。取肝左葉0.6～0.8 g按質(zhì)量比1∶9加入預(yù)冷的生理鹽水勻漿制備10%的組織勻漿，以3 500 r/min離心10 min，取上清液冷藏保存，按試劑盒說明分別測定小鼠肝組織及心肌組織中的SOD活性、MDA含量。

1.2.5 病理組織學(xué)檢查 用10%的甲醛溶液固定小鼠肝右葉，石蠟包埋，切片后用常規(guī)HE染色制片，在光鏡下觀察肝組織結(jié)構(gòu)變化及細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果用x±S表示，應(yīng)用單因素方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，P<0.05時(shí)則表示該差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組小鼠體重與肝臟指數(shù)

由表1可以看出，與空白對(duì)照組比較，各組小鼠體質(zhì)量未見明顯差異，表明蟬蛻水提取物在試驗(yàn)條件下對(duì)動(dòng)物的體重?zé)o明顯影響。與模型組比較，各組小鼠肝指數(shù)降低（P<0.01或P<0.05）。

2.2 各組小鼠血清AST、ALT水平

由表2可以看出，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠血清中的AST和ALT活性極顯著升高（P<0.01），表明小鼠急性肝損傷模型造模成功。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸、蟬蛻水提取物的低、中、高劑量組小鼠血清中的AST和ALT活性下降（P<0.01或P<0.05）。

2.3 各組小鼠心肌組織SOD、MDA水平

由表3可以看出，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠心肌組織的SOD活性降低、MDA含量上升（P<0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸、蟬蛻水提取物的低、中、高劑量組小鼠心肌組織的SOD活性上升（P<0.01），MDA含量降低（P<0.01或P<0.05）。

2.4 各組小鼠肝臟組織SOD、MDA水平

由表4可以看出，與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠肝臟組織的SOD活性降低、MDA含量上升（P<0.01）。與模型組比較，聯(lián)苯雙酯滴丸、蟬蛻水提取物的低、中、高劑量組小鼠肝臟組織的SOD活性上升（P<0.01或P<0.05），MDA含量降低（P<0.01或P<0.05）。

2.5 各組小鼠肝組織病理形態(tài)學(xué)變化比較

由圖1可以看出，空白對(duì)照組肝組織結(jié)構(gòu)及肝細(xì)胞正常，無溶解及壞死；模型組的肝細(xì)胞呈彌漫性水腫，胞漿腫脹透亮、疏松，肝細(xì)胞核溶解、壞死及消失，病變以小葉中央靜脈周圍的肝細(xì)胞為重；聯(lián)苯雙酯滴丸組的肝小葉結(jié)構(gòu)大致正常，無肝細(xì)胞變性壞死，再生細(xì)胞較少；與模型組比較，蟬蛻水提取物治療組肝細(xì)胞形態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，肝細(xì)胞溶解、壞死明顯減少，并伴有少量肝細(xì)胞再生，特別中劑量組改善最明顯。

3 小結(jié)與討論

研究證實(shí)，D-GaIN誘導(dǎo)的急性肝損傷與病毒性肝炎相似，能直接或間接地誘導(dǎo)生物膜系統(tǒng)發(fā)生脂質(zhì)過氧化，同時(shí)可破壞肝細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能完整性，是目前最接近人類臨床病毒性肝炎病理變化的理想模型[8，9]。

肝細(xì)胞內(nèi)含有AST與ALT，一般情況下血液中僅含少量，但是當(dāng)肝細(xì)胞裂解壞死時(shí)，AST與ALT則大量進(jìn)入血液系統(tǒng)循環(huán)。因此，通過測定血清中的AST與ALT含量能有效地反映肝細(xì)胞變性程度[10]。SOD具有催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化反應(yīng)的性質(zhì)，可作為超氧陰離子自由基的清除劑，可防止細(xì)胞損傷，同時(shí)SOD在哺乳動(dòng)物體內(nèi)與其壽命長短有較重要的關(guān)系，因此其含量的變化可以用來反映細(xì)胞的抗氧化能力，即損傷程度[10，11]、抗衰老能力[6，8]。MDA是細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化的終產(chǎn)物之一，具有較強(qiáng)毒性，可導(dǎo)致細(xì)胞裂解壞死，破壞蛋白和酶的結(jié)構(gòu)和功能，因此可以用MDA含量來間接評(píng)價(jià)組織脂質(zhì)過氧化程度[12，13]。

本研究中模型組小鼠血清中ALT、AST含量明顯升高，肝臟指數(shù)增加，表明D-GalN模型復(fù)制成功，而小鼠肝臟、心肌組織中SOD活性降低，MDA含量增高，提示模型組小鼠體內(nèi)有氧化應(yīng)激反應(yīng)的發(fā)生。病理形態(tài)學(xué)顯示肝細(xì)胞受損嚴(yán)重，表明脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。通過蟬蛻水提取物治療后，能明顯降低D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷血清中ALT、AST水平，增強(qiáng)小鼠肝臟、心肌組織中SDO活性，降低MDA含量，同時(shí)還明顯減輕肝組織炎癥病變程度。由此提示，蟬蛻水提取物可能通過催化超氧陰離子自由基發(fā)生歧化，降低肝細(xì)胞、心肌細(xì)胞內(nèi)氧化脂質(zhì)的水平，促進(jìn)氧自由基的清除，提高機(jī)體的抗氧化來保護(hù)肝細(xì)胞的損害。蟬蛻水提取物對(duì)D-GalN誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷有一定的保護(hù)作用，推測其機(jī)制可能與減輕脂質(zhì)過氧化、清除自由基、提高機(jī)體的抗氧化、保護(hù)肝細(xì)胞膜等有關(guān)。

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