鄭曉文++饒品彬++蔡曄++楊宗歧++姜永厚

摘要：目前，豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS）已成為全球范圍內(nèi)影響較廣的豬類重要疾病之一，因此建立快速、有效的豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）檢測(cè)技術(shù)成為預(yù)防和控制PRRS傳播的關(guān)鍵。在序列分析的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)特異性引物，建立基于熔解曲線分析的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV方法。該方法能夠特異性擴(kuò)增PRRSV，并用經(jīng)熔解曲線分析產(chǎn)生特異性的熔解峰，而非靶標(biāo)病毒未產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增；PRRSV的檢測(cè)靈敏度可達(dá) 50 copies/μL；批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)中變異系數(shù)均在2%以內(nèi)；對(duì)118份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性率為31.4%，與普通PCR檢測(cè)結(jié)果相符率為100%。結(jié)果表明，建立的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV方法具有較高的特異性、靈敏度和良好的重復(fù)性，可用于臨床PRRSV感染的早期診斷及分子流行病學(xué)調(diào)查。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）；EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR；熔解曲線分析；檢測(cè)

中圖分類號(hào)： S855.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0123-04

豬繁殖與呼吸綜合征病毒別稱藍(lán)耳病病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus，簡(jiǎn)稱PRRSV），屬動(dòng)脈炎病毒科動(dòng)脈炎病毒屬，是一種單股正鏈RNA病毒，全基因組序列約為15 kb，含9個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），其中ORF1a、ORF1b占整個(gè)病毒基因組的80%，ORF1a編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白Nsp-2蛋白在病毒復(fù)制和致病過(guò)程中發(fā)揮重要作用，ORF2a、ORF2b、ORFs3～7各自編碼病毒結(jié)構(gòu)蛋白GP2、E、GP3、 GP4、 GP5、M、N[1-3]。PRRSV基因組毒株間具有較大的遺傳變異性，根據(jù)PRRSV基因型差異，將PRRSV分為美洲型、歐洲型，兩者序列同源性約為63%[4-5]。

由PRRSV引起的豬繁殖與呼吸綜合征（豬藍(lán)耳?。┦且宰胸i呼吸衰竭和孕豬流產(chǎn)、胎兒畸變、早產(chǎn)、死產(chǎn)及木乃伊胎等繁殖障礙為主要癥狀的傳染病[6]，以高致病率、高死亡率為主要特征，該病于1987年在美國(guó)首次被發(fā)現(xiàn)，目前遍布世界各個(gè)養(yǎng)豬國(guó)家[7-8]。1992年世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（Office International Desepizooties，簡(jiǎn)稱OIE）將豬繁殖與呼吸綜合征列為B類動(dòng)物傳染病，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病[9]。我國(guó)于1996年首次報(bào)道該病，主要為美洲型。2006年，PRRSV的高致病性NA型病毒株（HP-PRRSV）在我國(guó)各地養(yǎng)豬業(yè)中引起大規(guī)模疾病暴發(fā)，給我國(guó)豬群養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了沉重的經(jīng)濟(jì)損失[10-11]。因此，建立及時(shí)快速的PRRSV檢測(cè)方法，對(duì)預(yù)防和控制該疫情有重要的作用。

目前用于診斷PRRSV的方法有病毒分離培養(yǎng)、間接免疫熒光試驗(yàn)（IFA）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等，這些檢測(cè)手段存在耗時(shí)長(zhǎng)、靈敏度低、對(duì)感染早期無(wú)法確診等缺點(diǎn)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescent quantitative PCR，簡(jiǎn)稱real-time PCR）是一種自動(dòng)化程度高、特異性強(qiáng)、靈敏度好、可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程的核酸檢測(cè)技術(shù)，包括熒光雜交探針、熒光染料2類[12]。染料法實(shí)時(shí)定量PCR省去了設(shè)計(jì)、標(biāo)記熒光探針等流程，檢測(cè)費(fèi)用較探針?lè)ㄏ鄬?duì)降低，同時(shí)適用于各種PCR擴(kuò)增體系[13-14]。新型飽和染料EvaGreen 具有很強(qiáng)的熒光信號(hào)和穩(wěn)定性，解決了SYBR Green染料重分布等缺點(diǎn)，是一種適用于實(shí)時(shí)熒光定量PCR的DNA結(jié)合熒光染料[15]。本研究擬建立1種基于EvaGreen的PRRSV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法，應(yīng)用于豬繁殖與呼吸綜合征的早期診斷，同時(shí)也可為豬繁殖與呼吸綜合征的診斷、試劑研發(fā)、流行病學(xué)研究等奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1病毒和臨床樣品PRRSV、豬瘟病毒（classical swine fever virus，簡(jiǎn)稱CSFV）及豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus type 2，簡(jiǎn)稱PCV2）疫苗株由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存；豬細(xì)小病毒（porcine parvovirus，簡(jiǎn)稱PPV）疫苗干粉，購(gòu)自北京中海保健科技有限公司；偽狂犬病病毒（pseudorabies virus，簡(jiǎn)稱PRV）、日本腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，簡(jiǎn)稱JEV）疫苗干粉，購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限公司。收集來(lái)自湖北省、福建省、安徽省、廣東省、河南省、浙江省及天津等地豬場(chǎng)的共58份血清樣品和在杭州市內(nèi)不同豬肉市場(chǎng)收集的共60份包括豬肺、淋巴結(jié)、肝、腎等組織樣品。

1.1.2主要試劑及儀器Taq DNA聚合酶、dNTPs、蛋白酶K等，購(gòu)自Sangon公司；Ezol、RNase A、pMD18-T vector、RNase inhibitor、M-MuLV反轉(zhuǎn)錄酶、Agarose等，購(gòu)自TaKaRa公司；EB固體，購(gòu)自Boehringer Mannheim公司；EvaGreen，購(gòu)自 Biotum 公司；DNA Gel Extraction Kit，購(gòu)自Axygen公司。主要儀器：Bio-Rad S1000PCR擴(kuò)增儀；Tanon 1600凝膠成像分析系統(tǒng)；Nanodrop 2000紫外分光光度計(jì)；Fresco 21離心機(jī)；ABI 7300熒光PCR儀。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)從GenBank下載現(xiàn)有的PRRSV全基因組序列，利用DNAstar軟件進(jìn)行序列比對(duì)后，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，選出PRRSV的特異性保守區(qū)域，借助Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物1，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為451 bp，用于構(gòu)建重組質(zhì)粒，并在此擴(kuò)增產(chǎn)物序列范圍內(nèi)再設(shè)計(jì)1對(duì)用于EvaGreen 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的引物2，對(duì)應(yīng)擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為88 bp（表1）。引物由Sangon公司合成。

1.2.2PRRSV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

1.2.2.1PRRSV核酸提取及普通PCR擴(kuò)增根據(jù)RNA提取試劑盒要求進(jìn)行病毒RNA提取。以提取的RNA為模板，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將提取產(chǎn)物反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以獲得的cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，在0.2 mL PCR管中依次加入2.5 μL 10× Buffer，2.0 μL 25 mmol/L MgCl2，各0.5 μL上下游引物1，0.5 μL 2.5 mmol/L dNTP，0.3 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），1.0 μL cDNA（約100 ng），加入ddH2O至總體積為25.0 μL。反應(yīng)程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后，使用DL2000 Marker對(duì)PCR產(chǎn)物的目的片段進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)品模板構(gòu)建根據(jù)DNA Gel Extraction Kit操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行產(chǎn)物割膠回收。回收產(chǎn)物參照TaKaRa pMD 18-T Vector試劑盒說(shuō)明書(shū)連接到pMD18-T載體中。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞DH5α內(nèi)，通過(guò)氨芐青霉素（Amp+）培養(yǎng)基篩選，提取重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定，并將電泳檢測(cè)正確的重組質(zhì)粒委托Sangon公司進(jìn)行序列測(cè)定，將經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證后正確的重組質(zhì)粒用紫外分光光度計(jì)Nanodrop 2000 測(cè)定濃度，根據(jù)阿弗加德羅常數(shù)將濃度轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，再按10倍梯度進(jìn)行系列稀釋，制成PRRSV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。

1.3PRRSV EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法建立

EvaGreen實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系總體積為10 μL，反應(yīng)體系組成：1.2 μL 25 mmol/L Mg2+，1 μL 10×Buffer，0.8 μL 2.5 mmol/L dNTP Mix，0.5 μL 20×EvaGreen，0.5 U Taq酶，各0.2 μL上下游引物2，1 μL PRRSV重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品（模板），加滅菌ddH2O補(bǔ)足體積至10 μL。擴(kuò)增完成后進(jìn)行熔解曲線制作過(guò)程，擴(kuò)增程序：95 ℃ 3 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，40個(gè)循環(huán)。熔解曲線程序：95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s，60 ℃開(kāi)始收集熒光信號(hào)，制作熔解曲線。

1.4PRRSV EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法評(píng)價(jià)

1.4.1特異性試驗(yàn)按照EvaGreen實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系配制7份試劑，1份加入1 μL PRRSV的cDNA（約100 ng）作為模板，其余6份為對(duì)照組，模板中分別加入其他5種豬病毒，包括CSFV、PCV2、PPV、PRV和JEV的DNA/cDNA 1 μL（約100 ng），另1份加入1 μL ddH2O為陰性對(duì)照，按實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)程序擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。

1.4.2靈敏度試驗(yàn)將PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度系列濃度稀釋，進(jìn)行EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。通過(guò)能夠檢測(cè)出陽(yáng)性結(jié)果的最高稀釋度的拷貝數(shù)，確定PRRSV在EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR中的靈敏度。

1.4.3重復(fù)性試驗(yàn)選用同一次制備的PRRSV的3個(gè)濃度梯度（104、103、102 copies/μL）的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)行批內(nèi)、批間重復(fù)試驗(yàn)。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)是將每個(gè)濃度在同一次EvaGreen實(shí)時(shí)熒光中重復(fù)3次；批間重復(fù)試驗(yàn)是在3個(gè)不同時(shí)間段進(jìn)行試驗(yàn)，對(duì)3個(gè)濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行EvaGreen實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)。

1.5臨床樣品檢測(cè)

對(duì)118份臨床樣品分別進(jìn)行EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR、常規(guī)PCR檢測(cè)，比較其檢測(cè)結(jié)果。

2結(jié)果與分析

2.1重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備

PRRSV疫苗經(jīng)總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物克隆至pMD18-T載體；以獲得的重組質(zhì)粒為模板，用構(gòu)建病毒標(biāo)準(zhǔn)品的引物（表1）進(jìn)行普通PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳檢測(cè)分析得到條帶大小為451 bp，與預(yù)期目的片段大小相符（圖1）。對(duì)含PRRSV目的片段的重組質(zhì)粒測(cè)序后，經(jīng)BLAST在線比對(duì)分析，表明該克隆插入的DNA序列確實(shí)為PRRSV部分核酸序列，表明PRRSV重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2PRRSV EvaGreen實(shí)時(shí)熒光PCR特異性

應(yīng)用構(gòu)建好的EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系，用PRRSV熒光引物2（表1）同時(shí)對(duì)PRRSV核酸、非靶病毒核酸（CSFV、PCV2、PPV、PRV、JEV）和ddH2O進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，發(fā)現(xiàn)PRRSV的引物2只能特異性擴(kuò)增PRRSV核酸，呈現(xiàn)特異熔解峰，其熔解峰值對(duì)應(yīng)Tm為81.1 ℃，而對(duì)其他非目標(biāo)病毒及ddH2O均不能擴(kuò)增（圖2），表明建立的檢測(cè)方法具有較好的特異性。

2.3PRRSV實(shí)時(shí)熒光PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線和檢測(cè)靈敏度

將PRRSV重組質(zhì)粒稀釋成系列濃度標(biāo)準(zhǔn)品（106、105、104、103、102 copies/μL）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)，對(duì)實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，建立檢測(cè)PRRSV的PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線及相應(yīng)擴(kuò)增曲線（圖3），可以看出其中標(biāo)準(zhǔn)品濃度在100～106 copies/μL內(nèi)有良好線性關(guān)系，其中擴(kuò)增效率為98.7%（R2>0.99）。PRRSV系列濃度梯度標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)時(shí)熒光PCR體系中，所能檢測(cè)到的最高稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)品，即能夠產(chǎn)生相應(yīng)特異熔解峰的最低拷貝數(shù)模板即為相應(yīng)靈敏度。PRRSV標(biāo)準(zhǔn)品（50～106 copies/μL）為模板時(shí)熔解曲線均有明顯目的峰產(chǎn)生，25 copies/μL時(shí)無(wú)目的峰，表明PRRSV重組質(zhì)粒靈敏度可達(dá)50 copies/μL。

2.4PRRSV EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR重復(fù)性

PRRSV在EvaGreen實(shí)時(shí)熒光PCR中（104、103、102 copies/μL）3個(gè)濃度循環(huán)閾值Ct重復(fù)性檢測(cè)（表2）。其批間重復(fù)變異系數(shù)分別為0.40%、1.32%、1.68%，批內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)分別為0.37%、0.93%、0.93%；2種重復(fù)試驗(yàn)中的變異系數(shù)均小于2%，表明重復(fù)性良好。

2.5臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用本研究所建立的PRRSV EvaGreen 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法、常規(guī)PCR方法同時(shí)對(duì)118份臨床樣品進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，結(jié)果表明，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法共檢測(cè)出37份PRRSV陽(yáng)性樣品（20份陽(yáng)性血清樣品、17份陽(yáng)性組織樣品），陽(yáng)性率為31.4%，與普通PCR方法檢測(cè)結(jié)果完全一致。

3討論與結(jié)論

自2006年，高致病性PRRSV在中國(guó)南方部分地區(qū)豬場(chǎng)暴發(fā)，并逐漸蔓延擴(kuò)散到北方各地區(qū)，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。豬繁殖與呼吸綜合征潛伏期短，從感染到出現(xiàn)病癥間隔大約為3～37 d，不同年齡、品種的豬均可感染，具有傳播速度快、發(fā)病率高、病死率高的特征，屬于一旦發(fā)現(xiàn)必須向世界動(dòng)物衛(wèi)生組織通報(bào)的烈性傳染病。PRRSV常與偽狂犬病病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、日本腦炎病毒、豬瘟病毒及豬細(xì)小病毒等病毒混合感染，在臨床上常呈現(xiàn)出相似的病狀，增加了臨床診斷的難度。因此，建立一種能夠快速、有效、準(zhǔn)確地早期檢測(cè)方法在PRRS的防控上具有重要意義。

本研究構(gòu)建的PRRSV EvaGreen 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法在特異性、重復(fù)性及靈敏度等方面都取得了比較理想的效果。本試驗(yàn)得到直線性較好的標(biāo)準(zhǔn)曲線，其擴(kuò)增效率達(dá)到了 98.7%，說(shuō)明PRRSV在EvaGreen實(shí)時(shí)熒光PCR中得到較好的擴(kuò)增效果，而引物只能擴(kuò)增相應(yīng)的靶序列說(shuō)明該方法具有較好的特異性。此外，EvaGreen實(shí)時(shí)熒光定量PCR也呈現(xiàn)了較高的靈敏度。PRRSV的檢測(cè)極限可達(dá)到50 copies/μL，較Shin等建立的PRRSV定量PCR方法檢測(cè)極限 100 copies/μL[16]的靈敏度要好。吳憶春建立的PRRSV SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光PCR靈敏度達(dá)到13 copies/μL[17]，稍高于本試驗(yàn)的靈敏度，但本研究所使用的EvaGreen是種新型熒光染料，其原理與SYBR Green Ⅰ相同，實(shí)際操作中對(duì)PCR擴(kuò)增的抑制作用更小，且不容易產(chǎn)生非特異性擴(kuò)增[18]。而較高濃度的EvaGreen亦能消除SYBR Green Ⅰ溶解曲線中常見(jiàn)的“染料重分布”的缺陷，并具備更強(qiáng)的熒光信號(hào)及穩(wěn)定性，尤其適于開(kāi)發(fā)多重PCR檢測(cè)技術(shù)[15]。吳海港等建立的TaqMan 探針熒光定量PCR檢測(cè)PRRSV的靈敏度達(dá)到 5 copies/μL[19]，但TaqMan探針的成本較高，須要設(shè)計(jì)相應(yīng)的探針，且容易受探針結(jié)合位點(diǎn)序列突變的影響導(dǎo)致假陰性結(jié)果[20]，而EvaGreen染料實(shí)時(shí)熒光PCR相對(duì)簡(jiǎn)單，只須設(shè)計(jì)目的引物，更適用于PRRSV的基礎(chǔ)研究及流行病學(xué)調(diào)查。

在臨床樣品檢測(cè)中，對(duì)118份臨床樣品（收集自湖北省等地豬場(chǎng)的共58份血清樣品和杭州市內(nèi)不同豬肉市場(chǎng)的共60份組織樣品）進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，其中用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法共檢測(cè)出37份PRRSV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為31.4%，與普通PCR方法檢測(cè)結(jié)果符合率為100%。血清樣品中PRRSV的陽(yáng)性檢出率為34.5%，稍高于組織樣品中PRRSV的陽(yáng)性檢出率28.3%，檢測(cè)結(jié)果與李蕾對(duì)2010年全國(guó)10個(gè)省1 375份和2011年12個(gè)省1 707份生豬屠宰場(chǎng)組織樣品利用普通PCR進(jìn)行檢測(cè)得出的28.7%、16.75% PRRSV陽(yáng)性率相類似[21]。而韓慶安等采用逆轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）方法對(duì)河北不同地區(qū)收集的2 159份商品豬的肺臟或肺門淋巴結(jié)進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，結(jié)果表明，PRRSV樣品陽(yáng)性率為1190%[22]；范仲鑫等用RT-PCR方法對(duì)采自湖南地區(qū)不同屠宰場(chǎng)的50份豬肺門淋巴結(jié)進(jìn)行PRRSV的檢測(cè)，結(jié)果表明，陽(yáng)性率為16%[23]；刁有祥等應(yīng)用PCR方法對(duì)125份臨床健康豬肺臟進(jìn)行PRRSV檢測(cè)，結(jié)果表明有12份PRRSV陽(yáng)性樣品，陽(yáng)性率為9.6%[24]，均低于本研究中的PRRSV檢出率。以上結(jié)果表明，PRRSV在豬體內(nèi)不同組織器官中分布不同，且不同地域的流行率也存在差異，可能由于樣品收集橫跨多個(gè)?。ㄊ?、區(qū)），不同地區(qū)飼養(yǎng)模式及感染情況不同。這些結(jié)果還表明，PRRSV在我國(guó)豬群中相當(dāng)流行，是養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的一大潛在危險(xiǎn)，應(yīng)當(dāng)引起足夠的重視，加強(qiáng)對(duì)PRRSV的防御和控制，規(guī)范養(yǎng)豬業(yè)和科學(xué)合理用藥。

本研究采用新型飽和染料EvaGreen成功建立了PRRSV熒光定量PCR檢測(cè)方法，具有快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，為PRRSV早期診斷、流行病學(xué)調(diào)查及其防控措施研究提供了技術(shù)支持。

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