劉培培++張冰++程曉琴++王會(huì)會(huì)++馬瑞++謝昌平

摘要：紅掌真菌性葉枯病是近幾年在海南新發(fā)現(xiàn)的一種病害，在紅掌病害中較嚴(yán)重。田間癥狀是多從葉緣發(fā)病，發(fā)病初期葉片出現(xiàn)水漬狀褪綠病斑，病斑周圍有黃暈，后期葉片大面積枯萎，甚至致植株枯死。從中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院周邊采集紅掌葉枯病病葉，對(duì)該病菌進(jìn)行分離培養(yǎng)。通過(guò)對(duì)該病原菌的形態(tài)鑒定以及rDNA-ITS序列分析，確定引起該病害的病原菌為苞葉芋帚梗柱孢菌（Cylindrocladium spathiphylli Schouties，El-Gholl & Alfieri）。此病原菌引起紅掌葉枯病在國(guó)內(nèi)為首次報(bào)道。

關(guān)鍵詞：紅掌；葉枯??；病原菌鑒定；苞葉芋帚梗柱孢菌

中圖分類號(hào)： S436.8文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）09-0095-02

紅掌（Anthurium andraeanum）別稱燈臺(tái)花、花燭、安祖花，為天南星科（Araceae）花燭屬（Anthurium）多年生常綠草本花卉，原產(chǎn)于南美洲的熱帶雨林地區(qū)，現(xiàn)歐洲、亞洲、非洲皆有栽培。由于紅掌花色艷麗，花期長(zhǎng)，近年來(lái)逐步走進(jìn)家居，成為美化家庭的盆栽，備受國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者喜愛(ài)。目前，我國(guó)已報(bào)道的紅掌病害主要有根腐?。≒ythium splendens）[1]、炭疽?。–olletorichum destructivum/Colletorichum gloeosporioides）、細(xì)菌性葉斑?。╔anthomonas axonopodis pv.citri）、細(xì)菌性葉枯病（Pseudomonas/Xanthomonas）[2]、灰霉?。˙otrytis cinerea）、褐斑病（Acremonium zonatum）、葉霉?。–ladosporium cladosporioides）、莖基腐病（Phytophthora parasitica、Pythium pringshcim）、苗枯?。∕etathizium anisopliae）、根莖潰瘍?。–ylindrocladium sp.）、藻斑?。–ephaleuros virescens）。國(guó)外已報(bào)道的紅掌病害有露濕漆斑菌（Myrothecium roridum）引起的葉斑病[3]、由花葉萬(wàn)年青頭孢菌（Cephalosporium dieffenbachiae）引起的葉斑病、根腐?。–alonectria crotalariae）、葉疫?。≒hytophthora nicotianae）。但由苞葉芋帚梗柱孢菌（Cylindrocladium spathiphylli）引起的紅掌葉枯病尚未見(jiàn)報(bào)道。

海南省儋州市紅掌葉枯病在紅掌病害中較嚴(yán)重，多從葉緣發(fā)病，引起葉片大面積枯萎，弱化植株生長(zhǎng)，甚至致其枯死，造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。本試驗(yàn)主要是從形態(tài)觀察和分子鑒定兩方面進(jìn)行研究，確定引起紅掌葉枯病病原真菌是苞葉芋帚梗柱孢菌（C. spathiphylli Schoulties，El-Gholl&Alfieri），從而為這種病害的防治提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1病葉采集及癥狀描述

紅掌葉枯病病葉采于中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院周邊。按常規(guī)方法對(duì)田間病株癥狀進(jìn)行描述及拍攝。

1.2菌株分離

采用常規(guī)組織分離法分離，無(wú)菌操作接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）上，置于室溫下培養(yǎng)。

1.3菌株的致病性測(cè)定

采用針刺法進(jìn)行人工接種。具體方法：先用滅菌針將葉片刺傷，再將分離純化菌株的菌餅（直徑0.45 cm），貼在傷口上，處理10株。同時(shí)設(shè)與菌餅同樣大小的瓊脂塊作為對(duì)照，最后表面覆蓋已滅菌的吸水紙，用保鮮袋套住保濕培養(yǎng)4～7 d，觀察并記錄發(fā)病情況。

1.4病原菌菌落和形態(tài)觀察

將菌種分別接種在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）和水瓊脂培養(yǎng)基（WA）上，室溫下培養(yǎng)5 d后，觀察菌落的培養(yǎng)性狀，包括菌落的顏色、氣生菌絲是否發(fā)達(dá)、分子孢子、不孕附屬絲形態(tài)和大小，以及是否存在厚垣孢子等。采用培養(yǎng)基表面劃傷法來(lái)誘導(dǎo)病原菌分子孢子、不孕附屬絲和泡囊的產(chǎn)生，具體做法：用滅菌的刀片在培養(yǎng)基表面劃上幾刀，再置于常溫下培養(yǎng)5～10 d，分生孢子、不孕附屬絲和泡囊產(chǎn)生，然后再觀察分生孢子和不孕附屬絲的形態(tài)以及測(cè)量分生孢子、分生孢子梗和泡囊的大小。

1.5病原菌rDNA-ITS序列分析

用CTAB法提取菌絲的DNA。采用通用引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′擴(kuò)增菌株的rDNA-ITS片段，并委托天根生化科技（廣州）有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。對(duì)測(cè)得的供試菌株 rDNA-ITS 區(qū)段的序列，分別運(yùn)用GenBank核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST工具軟件，在DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源DNA序列并進(jìn)行比較分析，根據(jù)BLAST搜索和比較的結(jié)果，進(jìn)行同源性分析。

2結(jié)果與分析

2.1田間癥狀描述

該病原菌主要危害紅掌葉片，從葉片邊緣開始發(fā)病。典型癥狀：發(fā)病初期葉片出現(xiàn)水漬狀褪綠病斑，然后逐漸擴(kuò)大為圓形、卵圓形和不規(guī)則的淺褐色至深褐色病斑，邊緣有黃色的暈圈，發(fā)病后期多個(gè)病斑也會(huì)聯(lián)合成片，造成葉片枯死（圖1-a）。

2.2菌株的致病性測(cè)定

將分離純化后的菌種接種到健康的葉片上，經(jīng)過(guò)4～7 d后的觀察，針刺法接種的葉片全部發(fā)病，且癥狀與初始分離所選葉片相同（圖1-b，圖1-c），對(duì)照葉片沒(méi)有發(fā)病癥狀（圖1-d）。以接種后發(fā)病葉片作為分離材料再次分離，所得菌與初次分離所得菌落的分生孢子形態(tài)等相同，符合柯赫氏法則。

2.3病原菌菌落和形態(tài)觀察

在PDA上培養(yǎng)，病原菌的菌落圓形，紅棕色，邊緣整齊且顏色較淺，氣生菌絲發(fā)達(dá)（圖2-a）。而通過(guò)在培養(yǎng)基表面劃傷后，菌落的刮傷處會(huì)散生許多白色粉狀物，即為病原菌的不孕附屬絲、分生孢子梗和大型分生孢子。泡囊為無(wú)色，棍棒狀，大小為4.2～5.9 μm（圖2-c）；分生孢子梗掃帚狀，一級(jí)分枝長(zhǎng)度為14.3～22.7 μm，二級(jí)分枝長(zhǎng)度為10.1～14.7 μm，三級(jí)分枝長(zhǎng)為8.6～12.3 μm（圖2-c）；大型分生孢子無(wú)色，圓柱狀，兩端圓形，多數(shù)無(wú)分隔，少數(shù)1～2個(gè)分隔，其長(zhǎng)為35.3～46.5 μm，寬為3.5～4.7 μm（圖2-b）；還可見(jiàn)厚垣孢子，未見(jiàn)有小型分生孢子產(chǎn)生。在WA上培養(yǎng)時(shí)，產(chǎn)生的大型分生孢子與PDA上培養(yǎng)產(chǎn)生的大型孢子基本一致（圖2-e），分生孢子梗末端膨大（圖2-d），未見(jiàn)有小型分生孢子產(chǎn)生[4]。通過(guò)對(duì)培養(yǎng)性狀和形態(tài)學(xué)的觀察，進(jìn)行查閱相關(guān)資料，初步鑒定引起該病害的病原菌所在屬為帚梗柱孢屬（Cylindrocladium）。

2.4病原菌rDNA-ITS測(cè)序分析與同源性比較

以提取病原菌的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，3個(gè)樣品均可擴(kuò)增出1條大小與預(yù)計(jì)長(zhǎng)度符合約600 bp的特異片段。以轉(zhuǎn)化后收集的菌液進(jìn)行PCR擴(kuò)增，克隆的結(jié)果與基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果一致，長(zhǎng)度約為600 bp。片段經(jīng)克隆、測(cè)序后放到NCBI進(jìn)行BLAST比對(duì)（GenBank：EU285-555.1），結(jié)果表明，該病原菌目的片段的序列與數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的苞葉芋帚梗柱孢菌（C.spathiphylli Schouties，El-Gholl & Alfieri）ITS核苷酸序列（GQ280627.1）有極大的相似性，同源性高達(dá)99%。

3結(jié)論與討論

目前，國(guó)內(nèi)尚未對(duì)由苞葉芋帚梗柱孢菌引起的紅掌葉枯病報(bào)道，黃志朋對(duì)紅掌莖基腐病病原進(jìn)行研究，提出帚梗柱孢霉（Cylindrocladium sp.）可侵染紅掌根莖部或莖基部引起根莖潰瘍病[5]，但未提到該病原可危害紅掌葉片，也未確定病原具體種。畢可可等對(duì)白掌病害進(jìn)行研究，確定苞葉芋帚梗柱孢菌是白掌褐腐病的致病菌[6-7]，但在紅掌上還未見(jiàn)報(bào)道。

本研究針對(duì)紅掌葉枯病進(jìn)行了病原菌分離，通過(guò)對(duì)分離菌株的形態(tài)特征和rDNA-ITS序列同源性的分析，將分離的菌株鑒定為苞葉芋帚梗柱孢菌（C. spathiphylli Schouties，El-Gholl & Alfieri），本結(jié)論為國(guó)內(nèi)首次報(bào)道。該研究為有效防治紅掌葉枯病提供了理論依據(jù)，使用何種藥劑及如何有效防治有待進(jìn)一步研究。此外，由于真菌引起的紅掌葉枯病和細(xì)菌引起的紅掌葉枯病在病株上產(chǎn)生的癥狀十分相似，所以在鑒別紅掌葉枯病病原時(shí)，可首先通過(guò)切取葉片病斑組織做顯微鏡檢查，如果發(fā)現(xiàn)有細(xì)菌溢留現(xiàn)象，則為細(xì)菌性葉枯病。

參考文獻(xiàn)：

[1]周曉云，游春平. 紅掌根腐病病原鑒定及其PCR檢測(cè)方法[J]. 園藝學(xué)報(bào)，2013，40（5）：989-996.

[2]梁麗雯，任希望，高志亮，等. 紅掌細(xì)菌性葉枯病病原菌的分離與鑒定[J]. 熱帶生物學(xué)報(bào)，2013，4（4）：327-331.

[3]Ben H Y，Zhao Y J，Chai A L，et al. First report of Myrothecium roridum causing leaf spot on Anthurium andraeanum in China[J]. Journal of Phytopathology，2015，163（2）：144-147.

[4]Crous P W，Wingfield M J. A monograph of Cylindrocladium，including anamorphs of Calonectria[J]. Mycotaxon，1994，51（27）：393-404.

[5]黃志朋. 紅掌莖基腐病病原菌鑒定及防治藥劑的篩選[D]. 廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，2013.

[6]畢可可，周佳暖，習(xí)平根，等. 匙葉天南星根莖腐爛病病原鑒定[C]//中國(guó)菌物學(xué)會(huì). 中國(guó)菌物學(xué)會(huì)2009學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集，2009.

[7]馬凱生. 廣州白掌主要土傳真菌病害鑒定及防治藥劑的篩選[D]. 廣州：仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院，2015.