孟靜文 解衛(wèi)方 董雨欣 沈洪艷

摘要 [目的]探討慶大霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性效應(yīng)。[方法]采用靜水式直接接觸致毒法，研究慶大霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性效應(yīng)。根據(jù)斑馬魚(yú)在各時(shí)間段的死亡率求出半致死濃度（LC50），根據(jù)LC50判斷慶大霉素廢水的毒性等級(jí)。[結(jié)果]預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，斑馬魚(yú)暴露于慶大霉素體積百分比為30%的廢水中24 h 100 %死亡（24 h LC100）和體積百分比為10%的廢水96 h 零死亡（96 h LC0）。急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，在（22±1） ℃下，慶大霉素廢水4、8、12、24、48、72、96 h的LC50分別為23.975%、21.210%、19.050%、18.395%、16.779%、16.779%、16.779%。慶大霉素廢水不同時(shí)段的LC50為10%～50%，Tua值為2～10，毒性等級(jí)為中等毒性。[結(jié)論]研究結(jié)果可以為慶大霉素廢水對(duì)水生生物的亞急性毒性研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

關(guān)鍵詞 環(huán)境毒理學(xué)；慶大霉素廢水；斑馬魚(yú)；急性毒性；半致死濃度

Acute Toxic Effects of Gentamicin Wastewater on Zebrafish

MENG Jing-wen1，2，XIE Wei-fang1，2，DONG Yu-xin1，2，SHEN Hong-yan1，2* （1.School of Environmental Science and Engineering，Hebei University of Science and Technology，Shijiazhuang，Hebei 050018；2.Medical Molecular Chemistry Laboratory of Hebei Province，Shijiazhuang，Hebei 050018）

Abstract [Objective]To discuss the acute toxic effects of gentamicin wastewater on zebrafish.[Method]The acute toxicity effects of gentamicin wastewater to zebrafish were determined by using hydrostatic contact test methods.The median lethal concentration （LC50） was caculated according to the mortality of zebrafish in each period，and gentamicin wastewater′s toxicity grade was judged according to LC50.[Result] The pre-test showed that 24 h LC100 and 96 h LC0 for zebrafish exposing to gentamicin wastewater were 30% and 10% respectively.The acute toxicity test indicated that 4，8，12，24，48，72，96 h LC50 for zebrafish at （22±1）℃ were 23.975%，21.210%，19.050%，18.395%，16.779%，16.779%，16.779% respectively.The research showed that LC50 values were 10%-50%， Tua values were between 2 and 10， the toxicity grade was moderate toxicity.[Conclusion]The research results can provide some data for studying the subacute toxicity of gentamicin wastewater to aquatic organisms.

Key words Environmental toxicology；Gentamicin wastewater；Zebrafish；Acute toxicity；LC50

抗生素廢水不僅是pH變化趨勢(shì)大、色度很高、氣味比較刺鼻，而且是含有殘留抗生素等難降解有機(jī)物以及高濃度生物毒性物質(zhì)的一種有機(jī)廢水。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外報(bào)道了很多抗生素對(duì)藻類(lèi)、蚤類(lèi)、發(fā)光菌、魚(yú)類(lèi)的急性毒性試驗(yàn)[1-5]。孟文娜等[6]研究了土霉素對(duì)日本錦鯽肝臟抗氧化防御系統(tǒng)的影響，但關(guān)于抗生素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的致毒效應(yīng)研究較少，尤其是慶大霉素廢水。魚(yú)類(lèi)對(duì)于水環(huán)境的變化反應(yīng)是尤為靈敏的，當(dāng)水體污染達(dá)到一定濃度時(shí)，魚(yú)類(lèi)就會(huì)產(chǎn)生一系列中毒反應(yīng)，如出現(xiàn)行為異常、生理功能紊亂，直至死亡[7]。魚(yú)類(lèi)急性毒性試驗(yàn)不僅用于測(cè)定化學(xué)物質(zhì)毒性強(qiáng)度和水體污染程度，檢測(cè)廢水處理效果，而且也為制定水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)、評(píng)價(jià)環(huán)境質(zhì)量和管理廢水排放提供了重要技術(shù)支撐。斑馬魚(yú)（Zebrafish）在常規(guī)毒性試驗(yàn)、分子及細(xì)胞生態(tài)毒理、生物致突變效應(yīng)檢測(cè)和環(huán)境激素測(cè)試等生態(tài)毒理領(lǐng)域中已被廣泛應(yīng)用[8]。在急性毒性試驗(yàn)中，通常采用半致死濃度（LC50）來(lái)表示受試物的急性毒性大小。筆者以斑馬魚(yú)為受試生物，以慶大霉素廢水為受試毒物，將斑馬魚(yú)暴露于慶大霉素廢水中，測(cè)定其在恒定狀態(tài)下4、8、12、24、48、72、96 h的LC50值，觀察慶大霉素廢水對(duì)水生生物的急性毒性效應(yīng)，旨在為其后續(xù)的亞急性毒性研究提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)生物。

受試生物斑馬魚(yú)（Zebrafish）購(gòu)于石家莊市某花鳥(niǎo)魚(yú)蟲(chóng)市場(chǎng)，體長(zhǎng)為（25±3） mm，體質(zhì)量（0.20±0.05） g，試驗(yàn)前在實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下馴養(yǎng)7 d，自然死亡率不得超過(guò)5%，試驗(yàn)前48 h以及在整個(gè)急性毒性試驗(yàn)期間（96 h），不對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行喂食。

1.1.2 儀器與耗材。曝氣泵；溫度計(jì)；量筒；酸度計(jì)（FE20）；溶解氧測(cè)定儀（JPBJ-608）；水質(zhì)硬度計(jì)（YD300）；5 L玻璃魚(yú)缸等。

1.1.3 試驗(yàn)水樣。

慶大霉素廢水來(lái)自某制藥企業(yè)污水處理廠進(jìn)水（生產(chǎn)過(guò)程中的排放水）。水樣保存在0～4 ℃的冰柜中備用，4 h與96 h水質(zhì)發(fā)生了物理變化。前者水樣呈深灰色，刺激性氣味，有大量的深灰色絮狀物；后者水樣呈淺灰色，氣味仍然刺鼻，絮狀物明顯減少（圖1）。試驗(yàn)前對(duì)水樣的COD、TOC、TN、pH等常規(guī)性指標(biāo)進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

（1）預(yù)試驗(yàn)。在5 L玻璃水族缸中盛放4 L 試液，設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)暴露組，體積分?jǐn)?shù)分別為10.00%、30.00%、50.00%、70.00%和90.00%，不設(shè)平行，每24 h 更換試液1次，每個(gè)暴露組放入5 尾斑馬魚(yú)，試驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行96 h，篩選出24 h 100%死亡濃度（24 h LC100）和96 h零死亡濃度（96 h LC0） 。

（2）急性毒性試驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)得出的結(jié)果，按等對(duì)數(shù)間距設(shè)置5個(gè)試驗(yàn)暴露組。試驗(yàn)設(shè)置2個(gè)平行組，同時(shí)設(shè)置1個(gè)空白試驗(yàn)組，試驗(yàn)最后得出魚(yú)類(lèi)96 h半致死濃度（96 h LC50）。每個(gè)暴露組隨機(jī)放入12尾斑馬魚(yú)，試驗(yàn)周期為96 h。

每天檢測(cè)試驗(yàn)溶液的pH、溶解氧（DO）和溫度，pH維持在7.4～7.6，DO值為5 mg/L，溫度控制在（22±1） ℃，試驗(yàn)期間需連續(xù)曝氣，試驗(yàn)方式為靜水式（每24 h更換試液1次[9]）。試驗(yàn)時(shí)間為96 h，分別在4、8、12、24、48、72、96 h觀察斑馬魚(yú)的死亡數(shù)，確定半致死濃度。

急性毒性試驗(yàn)中的斑馬魚(yú)質(zhì)量控制符合《水和廢水監(jiān)測(cè)分析方法》中魚(yú)類(lèi)毒性試驗(yàn)方法的要求，即對(duì)照組死亡率不得高于10%，試驗(yàn)用魚(yú)在與試驗(yàn)相同的環(huán)境條件下提前馴養(yǎng)14 d[10]。試驗(yàn)期間，空白對(duì)照組試驗(yàn)斑馬魚(yú)均表現(xiàn)正常，并未出現(xiàn)死亡或中毒反應(yīng)，水質(zhì)監(jiān)測(cè)結(jié)果表明試驗(yàn)溶液的溶解氧含量均在5 mg/L 以上。

1.2.2 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析。

半致死濃度（LC50）：根據(jù)概率單位加權(quán)回歸（Bliss） 法，又稱(chēng)圖解法，包括求劑量反應(yīng)曲線方程和半致死濃度的95%置信區(qū)間[11]。

（1）求劑量反應(yīng)直線方程。以試驗(yàn)濃度對(duì)數(shù)值x為橫軸，以死亡概率單位y 為縱軸，繪制散點(diǎn)圖，得到回歸曲線。從回歸曲線上死亡概率單位為5的點(diǎn)作垂線與橫軸相交，讀數(shù)即為lgLC50，取lgLC50的反對(duì)數(shù)即可得到LC50值。

（2）半致死濃度的95%置信區(qū)間。通常以總體LC50的 95%置信區(qū)間，為可接受的LC50范圍。

①標(biāo)準(zhǔn)誤差的計(jì)算：SlgLC50 =S（N/2） 。式中，回歸曲線的斜率倒數(shù)用S表示；死亡概率單位4～6范圍內(nèi)各組試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)之和用N表示。②總體LC50的 95%置信區(qū)間的對(duì)數(shù)值（lgLC50-1.96SlgLC50，lgLC50+1.96SlgLC50）對(duì)上述結(jié)果取反對(duì)數(shù)，即得到總體 LC50的95%置信區(qū)間。

2 結(jié)果與分析

2.1 預(yù)試驗(yàn)結(jié)果

慶大霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的預(yù)試驗(yàn)持續(xù)96 h，得出24 h 100%死亡濃度 （24 h LC100） 為30%，96 h無(wú)死亡濃度（96 h LC0）為10%。

2.2 急性毒性試驗(yàn)結(jié)果

當(dāng)斑馬魚(yú)處于慶大霉素廢水中時(shí)，10%、13%濃度組的斑馬魚(yú)在染毒后有輕微的中毒癥狀：浮于水面游動(dòng)緩慢、倒游、豎立于水中[12]，約10 h后行動(dòng)恢復(fù)正常，但24 h 后出現(xiàn)死亡；16.90%、21.90%、28.56%濃度組的斑馬魚(yú)在染毒1 h后中毒癥狀明顯，呼吸加劇、失衡、活力減弱，魚(yú)體側(cè)臥，輕觸魚(yú)背，抽搐、向上跳躍最后出現(xiàn)麻痹甚至死亡狀態(tài)[13]?？瞻讓?duì)照組中斑馬魚(yú)均表現(xiàn)正常，出現(xiàn)零中毒和零死亡現(xiàn)象。

2.3 不同體積分?jǐn)?shù)的慶大霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性效應(yīng)

隨著慶大霉素廢水體積分?jǐn)?shù)的增加，對(duì)斑馬魚(yú)呈現(xiàn)的急性毒性效應(yīng)也逐漸增強(qiáng)（表2），表現(xiàn)為斑馬魚(yú)死亡率明顯升高，當(dāng)慶大霉數(shù)廢水體積分?jǐn)?shù)達(dá)28.56%時(shí)，24 h內(nèi)受試斑馬魚(yú)累積死亡率達(dá)100%。這與武晨虹[14]在研究青霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性效應(yīng)時(shí)也得出隨著青霉素廢水濃度的增加，斑馬魚(yú)的死亡數(shù)目增多，死亡率也隨之增大的結(jié)論相一致。從圖2可以看出，在不同體積分?jǐn)?shù)的慶大霉素廢水中斑馬魚(yú)死亡率與試驗(yàn)濃度對(duì)數(shù)值存在明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系[15]，隨著暴露濃度的增加，斑馬魚(yú)的死亡率顯著上升。在整個(gè)試驗(yàn)中，慶大霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的暴露濃度對(duì)數(shù)值-死亡率曲線均呈不規(guī)則的 S 形[16]，即斑馬魚(yú)死亡率隨著暴露濃度的升高而升高，但最初急速升高，后來(lái)緩慢上升。

2.4 慶大霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的急性毒性效應(yīng)參數(shù)分析

依據(jù)斑馬魚(yú)在4、8、12、24、48、72、96 h的死亡率，通過(guò)建立死亡概率單位（y）與試驗(yàn)濃度對(duì)數(shù)值（x）的回歸方程，各時(shí)段均顯示出較強(qiáng)的正相關(guān)性（R2>0.810），計(jì)算出LC50、Tua值和95%置信區(qū)間。

由表3可知，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，LC50呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，慶大霉素廢水的毒性逐漸增強(qiáng)。在整個(gè)試驗(yàn)周期內(nèi)，試驗(yàn)時(shí)間越長(zhǎng)，LC50值越小，慶大霉素廢水的毒性越大，即廢水對(duì)斑馬魚(yú)的毒性大小受試驗(yàn)時(shí)間的影響[17]。24 h后，隨試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，LC50值下降緩慢，表明隨著試驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)，廢水致毒能力緩慢增長(zhǎng)。48～96 h內(nèi)LC50均為16.779%，表明在這個(gè)時(shí)段內(nèi)慶大霉素廢水對(duì)斑馬魚(yú)的毒性不再增強(qiáng)。胡青云等[18]在研究染發(fā)廢水對(duì)鯉魚(yú)的急性毒性試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)魚(yú)致死時(shí)間主要集中在24 h內(nèi)，24～48 h內(nèi)死亡率緩慢增長(zhǎng)，48～96 h死亡率不再變化。

2.5 慶大霉素廢水的毒性等級(jí)

根據(jù)工業(yè)廢水毒性等級(jí)劃分標(biāo)準(zhǔn)[20-22]，慶大霉素廢水在96 h內(nèi)各觀察時(shí)間段的LC50均介于10%～50%，Tua值也均在2～10（表4），屬于中毒廢水。

3 結(jié)論

（1）預(yù)試驗(yàn)結(jié)果表明，慶大霉素廢水在96 h周期試驗(yàn)中，24 h LC100和 96 h LC0試液中廢水濃度分別為30%和10%；急性毒性試驗(yàn)結(jié)果表明，96 h LC50為16.779%，慶大霉素廢水在96 h內(nèi)各觀察時(shí)間段的LC50均介于10%～50%，Tua值為2～10，屬于中毒性廢水。

（2）回歸曲線表明，斑馬魚(yú)死亡率與慶大霉素廢水濃度和暴露時(shí)間（試驗(yàn)時(shí)間）成正比。慶大霉素廢水濃度越大、暴露時(shí)間越長(zhǎng)，斑馬魚(yú)的死亡數(shù)量越多，死亡率也隨之增大，毒性越大。

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